循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集檢測(cè)的研究進(jìn)展

周婧婷 綜述，戴啟宇 審校

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生院,河南新鄉(xiāng) 453000；2.中國(guó)人民解放軍第三七一中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,河南新鄉(xiāng) 453000)

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·綜述·

循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集檢測(cè)的研究進(jìn)展

周婧婷1綜述，戴啟宇2△審校

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生院,河南新鄉(xiāng) 453000；2.中國(guó)人民解放軍第三七一中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,河南新鄉(xiāng) 453000)

關(guān)鍵詞:循環(huán)腫瘤細(xì)胞；富集檢測(cè)方法；納米技術(shù)

惡性腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要原因。目前臨床上仍主要通過影像學(xué)檢查及傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)來發(fā)現(xiàn)并診斷腫瘤，發(fā)現(xiàn)時(shí)患者常常已處于腫瘤進(jìn)展晚期，影響患者預(yù)后[1]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是從原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤病灶脫落，進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞，與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其檢測(cè)具有重要的臨床意義，不僅有助于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤動(dòng)態(tài)、早期發(fā)現(xiàn)腫瘤微轉(zhuǎn)移，還能為評(píng)估預(yù)后和療效以及腫瘤的個(gè)體化治療提供可靠參考[2]。近年來納米技術(shù)在CTCs的富集檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用，本文對(duì)常用的CTCs富集檢測(cè)方法以及相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，并對(duì)納米技術(shù)在CTCs檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行探討。

1CTCs的生物學(xué)特性及其檢測(cè)的臨床意義

CTCs主要表達(dá)上皮源性表面標(biāo)志，存在于大多數(shù)上皮來源的惡性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和膀胱癌等多種惡性腫瘤中[3]。雖然CTCs在血液中水平極低，但是CTCs檢測(cè)是評(píng)估臨床預(yù)后及化療療效的重要指標(biāo)。

2現(xiàn)有CTCs富集和檢測(cè)的方法學(xué)

外周血CTCs取材方便，重復(fù)性強(qiáng)，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)癌細(xì)胞動(dòng)態(tài)，相比較骨髓來說，是更為理想的檢測(cè)標(biāo)本來源。外周血中白細(xì)胞水平較高，而CTCs的濃度極低，這就對(duì)其檢測(cè)分析技術(shù)提出了較高要求。現(xiàn)有的方法學(xué)主要分為CTCs分離富集方法和CTCs檢測(cè)鑒定方法兩大類[4]。

2.1CTCs分離富集方法

2.1.1物理富集方法物理富集方法是基于CTCs和血細(xì)胞之間直徑、密度、變形性、介電性質(zhì)等物理學(xué)特性的不同而建立的方法。目前最常用的CTCs富集方法為膜濾過分析法和密度梯度離心法。這兩種方法分別根據(jù)CTCs直徑和密度與其他血細(xì)胞的差異，通過濾膜過濾法和離心法將CTCs分離出，并用于進(jìn)一步的檢測(cè)鑒定。基于CTCs物理學(xué)特性的富集方法操作簡(jiǎn)便，但特異度低，得到的CTCs純度較低，且存在被漏檢的可能[5]。細(xì)胞變形性富集法是利用腫瘤細(xì)胞的惡性程度增加，變形性增加這一特性而設(shè)計(jì)的一種微流體裝置進(jìn)行細(xì)胞分離富集的方法。目前該方法應(yīng)用于臨床仍有一定的困難。細(xì)胞電學(xué)特征富集法是根據(jù)細(xì)胞介電性質(zhì)的不同而建立的分離富集方法。該方法具有活細(xì)胞分選、使用靈活、容易調(diào)控、便于自動(dòng)化、可重復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)。但是由于各種腫瘤細(xì)胞的介電性質(zhì)不同，無法對(duì)所有腫瘤進(jìn)行檢測(cè)。腫瘤細(xì)胞的尺寸和表面電荷與正常細(xì)胞存在差異，ApoStreamTM技術(shù)利用這一點(diǎn)通過改變電場(chǎng)頻率來捕獲CTCs[6]。ApoStreamTM技術(shù)的CTCs檢出率明顯高于CellSearch系統(tǒng)，有報(bào)道稱，ApoStreamTM技術(shù)檢出的CTCs數(shù)超過CellSearch系統(tǒng)的10倍以上[7]。

2.1.2生物富集方法生物富集方法是基于CTCs和普通血細(xì)胞之間某些生物標(biāo)志物的表達(dá)差異而建立的方法。免疫磁性分離技術(shù)是目前最常用的CTCs分離富集方法[8]，其原理是形成抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物，通過外加磁場(chǎng)作用使該復(fù)合物發(fā)生移動(dòng)，達(dá)到分離細(xì)胞的目的，主要有陽性富集和陰性富集兩種[9]。CellSearch系統(tǒng)是目前唯一獲得美國(guó)FDA的批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床檢測(cè)CTCs的新技術(shù)[10]。該技術(shù)通過上皮細(xì)胞黏附分子Ep-CAM標(biāo)記磁珠從而對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)行富集，目前已用于檢測(cè)結(jié)直腸癌、前列腺癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌CTCs[11]。該方法與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)等方法相結(jié)合檢查CTCs，可提高檢測(cè)敏感度和特異度。CellSearch系統(tǒng)具有很好的重復(fù)性[12]，可以很好地保存細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)則是操作較為復(fù)雜，技術(shù)要求和檢測(cè)成本均較高。采用上皮細(xì)胞標(biāo)志篩選將遺漏發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的腫瘤細(xì)胞，造成結(jié)果的假陰性[13]。有研究者發(fā)現(xiàn)，增加的標(biāo)記分子在提高CTCs檢出率的同時(shí)，其與正常細(xì)胞的特異性反應(yīng)和非特異性反應(yīng)也會(huì)增加，所以要求增加的標(biāo)記分子特異度好、具有一定代表性[14-15]。

2.2CTCs檢測(cè)鑒定方法

2.2.1FCMFCM通過檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記的熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)高速、逐一的細(xì)胞定量分析和分選[16]。FCM可作為診斷癌前病變發(fā)展至癌變的一個(gè)重要標(biāo)志，精確定量DNA水平的改變，對(duì)癌前病變的性質(zhì)及發(fā)展趨勢(shì)做出評(píng)估，有助于癌變的早期診斷。FCM的優(yōu)點(diǎn)是可以定量計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞，可精確定量DNA水平。缺點(diǎn)是敏感度較低，檢測(cè)價(jià)值依賴于可分析細(xì)胞數(shù)量。

2.2.2免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)方便、直觀，在細(xì)胞富集的基礎(chǔ)上，利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)及鑒定，但敏感度低，特異度較差。

2.2.3RT-PCRRT-PCR以上皮源性腫瘤細(xì)胞的mRNA為標(biāo)志檢測(cè)CTCs，靈敏度高，價(jià)格較低，可重復(fù)操作，是目前檢測(cè)CTCs最有效的方法。缺點(diǎn)是無法計(jì)數(shù)，缺乏一定的特異度，易造成假陽性結(jié)果，在臨床應(yīng)用上仍有局限性。

3納米技術(shù)在CTCs富集檢測(cè)中的應(yīng)用

早期免疫磁珠技術(shù)磁珠大小只達(dá)到微米級(jí)，細(xì)胞分離效率較低，磁珠較難洗脫，不利于進(jìn)一步分析。隨著技術(shù)的發(fā)展，磁珠的大小達(dá)到了納米級(jí)(10～100 nm)[17]，使其與細(xì)胞的接觸概率增加，大幅度提高了CTCs的富集率。但是捕獲了CTCs的納米磁珠易聚集，會(huì)影響細(xì)胞的形態(tài)及活性，不利于進(jìn)一步分析檢測(cè)。

基于上述技術(shù)的缺點(diǎn)，非磁性納米材料在CTCs富集中的應(yīng)用開始得到關(guān)注。研究者們將抗體功能化的不同形狀的納米材料固定在基底上富集CTCs，提高了細(xì)胞與納米材料的接觸概率。捕獲到的CTCs細(xì)胞較易洗脫，減少了對(duì)細(xì)胞形態(tài)及活力和進(jìn)一步分析檢測(cè)的影響，從而進(jìn)一步提高了CTCs細(xì)胞的富集率和檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)了CTCs富集檢測(cè)的一體化。

有研究者利用血細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞在納米粗糙表面的不同黏附特性實(shí)現(xiàn)CTC的分離富集[18]。隨著粗糙度的增加，腫瘤細(xì)胞的黏附增多，而正常細(xì)胞不受影響。避免了因特異性抗原丟失所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

血液中CTCs水平相對(duì)于白細(xì)胞來說極少，這便成為CTCs富集檢測(cè)中的首要困難。微流控芯片具有液體流動(dòng)可控、消耗試樣和試劑極少、分析速度高等特點(diǎn)。有研究者將納米材料與微流控技術(shù)相結(jié)合[19]，構(gòu)建一種腫瘤細(xì)胞表面特異性識(shí)別抗體功能化的魚骨形芯片，使血液流過一個(gè)可視通道，通道內(nèi)魚骨形溝回能夠引起血液的一個(gè)輕微斡旋，從而增強(qiáng)了其與抗體修飾表面的接觸。該技術(shù)不用對(duì)血液樣本進(jìn)行預(yù)處理，操作方便，靈敏度更高，且獲得的CTCs仍能夠保持活性，用于進(jìn)一步分析檢測(cè)。

4CTCs富集檢測(cè)在臨床應(yīng)用存在的問題和前景

CTCs檢測(cè)是一種新型的診斷工具，屬于非侵入性操作，但也有一定的弊端。如外周血中CTCs數(shù)量稀少，且具有異質(zhì)性、易聚集成團(tuán)。已有微流控技術(shù)與納米材料聯(lián)合應(yīng)用的相關(guān)研究[20]，尋找新的特異性標(biāo)志或多種檢測(cè)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用是必然的發(fā)展趨勢(shì)。隨著技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，已經(jīng)研究出可觀的新方法，但是關(guān)于CTCs的臨床實(shí)用性的評(píng)估仍是必不可少的，還需要建立規(guī)范的實(shí)驗(yàn)流程使其標(biāo)準(zhǔn)化。CTCs檢測(cè)技術(shù)成本較高也是需要解決的一個(gè)重要問題。隨著研究的不斷深入和未來科技的發(fā)展，CTCs檢測(cè)勢(shì)必在臨床腫瘤的診治過程中得到廣泛應(yīng)用，其檢測(cè)的同時(shí)所伴隨的問題也會(huì)不斷的改進(jìn)與解決，其檢測(cè)方法的更加高效、經(jīng)濟(jì)、快速是必然的趨勢(shì)。

參考文獻(xiàn)

[1]郭浩,劉劍新.TCT在泌尿系上皮腫瘤診斷中的應(yīng)用進(jìn)展[J].浙江醫(yī)學(xué),2014，20(2)：135-136.

[2]申珊珊.循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)在監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用[C].北京：第十四屆全國(guó)腫瘤生物治療大會(huì)論文集,2015:105-106.

[3]楊卓,張玉娟,陳倩,等.循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)及其特性[J].協(xié)和醫(yī)學(xué)雜志,2013,4(2):191-194.

[4]張玉娟.循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的方法學(xué)建立和改良及在實(shí)體瘤中的監(jiān)測(cè)應(yīng)用研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2014.

[5]戚大梁,王強(qiáng),易維京.循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法和技術(shù)研究進(jìn)展[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2012,33(24):3022-3024.

[6]Gupta V,Jafferji I,Garza M,et al.ApoStreamTM,a new dielectrophoretic device for antibody independent isolation and recovery of viable cancer cells from blood[J].Biomicrofluidics,2012,6(2):24133.

[7]王瑩,梁硯菲,陶敏.循環(huán)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性及其檢測(cè)方法和應(yīng)用進(jìn)展[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,31(2):329-332.

[8]嵇金陵,何曉東,索美芳,等.利用新型免疫磁珠富集原理檢測(cè)肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2013,36(8):727-732.

[9]李媛,宋麗華,宋現(xiàn)讓.小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(10):793-796.

[10]Truini A,Alama A,Coco S,et al.Clinical applications of circulating tumor cells in lung cancer patients by cell search system[J].Front Oncol,2014,20(4):242.

[11]Cohen SJ,Punt CJ,Nicholas I,et al.Relationship of circulating tumor cells to tumor response,progression-free survival,and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer[J].J of Clin Onco,2008,26(19):3213-3221.

[12]Frithiof H,Welinder C,Larsson AM,et al.A novel method for downstream characterization of breast cancer circulating tumor cells following cell search isolation[J].Jour Trans Med,2015,13(1)：200-202.

[13]趙麗娜,蔡莉.乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞研究進(jìn)展與展望[J].中華腫瘤防治雜志,2011,18(22):1810-1815.

[14]Isabelle D,Guerrouahen BS,Naoual BF,et al.A new device for rapid isolation by size and characterization of rare circulating tumor cells.[J].Anticancer Research,2011,31(2):427-441.

[15]龔學(xué)軍.CEA 及 CK20 的不同檢測(cè)方法對(duì)結(jié)直腸癌診斷及預(yù)后評(píng)估的初步探討[D].長(zhǎng)沙：中南大學(xué),2010.

[16]史珂瑋,劉春芳.循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤惡性行為間的關(guān)系[J].標(biāo)記免疫分析與臨床,2014,21(5):603.

[17]Li FR,Li Q,Zhou HX,et al.Detection of circulating tumor cells in breast cancer with a refined immunomagnetic nanoparticle enriched assay and nested-RT-PCR[J].Nano Med,2013,9(7):1106-1113.

[18]Chen W,Weng S,Zhang F,et al.Nanoroughened surfaces for efficient capture of circulating tumor cells without using capture antibodies[J].Acs Nano,2013,7(1):566-575.

[19]Stott SL,Chia-Hsien H,Tsukrov DI,et al.Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2010,107(43):18392-18397.

[20]劉玉磊.基于納米材料的微流控技術(shù)在 HIV 和 HCV 檢測(cè)中的應(yīng)用研究[D].北京：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心,2012.

(收稿日期：2015-12-24)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.035

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)09-1239-02

作者簡(jiǎn)介：周婧婷，女，在讀研究生，主要從事循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的研究?！魍ㄓ嵶髡撸篍-mail：dqy716@sohu.com。