貝氏柯克斯體的相變異與脂多糖研究進(jìn)展

王　濤，于永慧 綜述，宋立華 審校

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所/病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071)

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貝氏柯克斯體的相變異與脂多糖研究進(jìn)展

王濤，于永慧 綜述，宋立華△審校

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所/病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071)

貝氏柯克斯體；立克次體；Q熱；脂多糖

貝氏柯克斯體(Cb)為一類(lèi)兼性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性小桿菌，歸屬于軍團(tuán)菌目，柯克斯體科，柯克斯體屬。傳統(tǒng)上，因?yàn)镃b有類(lèi)似立克次體的生物學(xué)特征，Cb被歸類(lèi)到立克次體目中，俗稱(chēng)為Q熱立克次體，但其與立克次體目?jī)?nèi)各種菌株的親緣關(guān)系相距較遠(yuǎn)。Cb地理分布廣泛，在羊、牛等家畜中感染率高[1-2]。Cb通過(guò)氣溶膠感染人可導(dǎo)致急性或慢性Q熱病，在部分患者中引起肺炎、肝炎、心內(nèi)膜炎和脊髓炎等重癥疾病。由于易于獲得及具有很強(qiáng)的感染性，Cb被列為生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑。脂多糖(LPS)是Cb的重要毒力因子和關(guān)鍵保護(hù)性抗原，含有兩種特有糖組分維瑞糖(Vir)和雙氫羥基鏈霉糖(Strep)。不同Cb分離株在雞胚或細(xì)胞上傳代后都能發(fā)生不可逆的Ⅰ～Ⅱ相的相變異。目前已知的Cb相變異均與LPS發(fā)生結(jié)構(gòu)變異有關(guān)。LPS發(fā)生變異的原因主要是缺失O抗原、或缺失某種特有糖組分。本文在Narasaki等[3]的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了Cb相變異、LPS的結(jié)構(gòu)與生物合成，為下一步LPS應(yīng)用基礎(chǔ)研究提供借鑒。

1　Cb的相變異

Cb相變異與經(jīng)典的細(xì)菌相變異有兩點(diǎn)差異，一是Cb的相變異發(fā)生在數(shù)十次甚至百次以上用雞胚或細(xì)胞(不是動(dòng)物或蜱等天然宿主)傳代培養(yǎng)Cb的過(guò)程中，二是Cb的相變異是不可逆的減毒過(guò)程。Cb相變異的實(shí)質(zhì)是在雞胚或細(xì)胞上傳代時(shí)Ⅰ相Cb發(fā)生了適應(yīng)性遺傳變異成為Ⅱ相(有時(shí)為中間相Crazy變異株)，這些變異在這兩種系統(tǒng)中無(wú)一例外均與LPS結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。在不同的九里克隆株中，Ⅰ相LPS(LPSⅠ)的O-PS最長(zhǎng)，Ⅱ相LPS(LPSⅡ)不含O-PS，而Crazy變異株(LPS Cr)的O-PS長(zhǎng)度介于Ⅰ～Ⅱ相范圍內(nèi)。Cb相變異為研究LPS的功能提供了天然的突變體。

Cb相變異的遺傳機(jī)制仍懸而未決。九里Ⅱ相株RSA 439中有大片段染色體(25、992 bp)刪除突變和13個(gè)點(diǎn)突變[4]，九里Crazy變異株RSA514在Ⅱ相株刪除突變基礎(chǔ)上有更多的基因缺失(31、568 bp)，這里奇怪的是LPS Cr的復(fù)雜性介于LPSⅠ與LPSⅡ之間[5]。另外，國(guó)外已對(duì)多株Ⅰ相和Ⅱ相菌進(jìn)行了全基因組測(cè)序[6]，但目前還沒(méi)有看到相變異相關(guān)的生物信息學(xué)分析，這可能是由于不同菌株間的全基因組序列差異較大，很難將相變?cè)驓w結(jié)到少數(shù)基因差異上。

Cb在無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中是否有類(lèi)似的相變異是個(gè)新課題，還沒(méi)有明確的研究。Kuley等[7]對(duì)多株Ⅰ相菌在無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行30次以上傳代，發(fā)現(xiàn)多個(gè)LPS相關(guān)基因的表達(dá)水平下降，且這些基因的重測(cè)序覆蓋度有類(lèi)似的下降，說(shuō)明可能存在上述類(lèi)似的基因刪除導(dǎo)致的相變異。雖然Cb相變異的遺傳機(jī)制還不明確，但已明確的是在細(xì)胞或雞胚生長(zhǎng)模型上相變異會(huì)大幅度提高Cb的感染性。在無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，Ⅱ相菌是否有顯著的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)還不清楚。另外，現(xiàn)有的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)需要嚴(yán)格的低氧條件，還有待改進(jìn)?？梢灶A(yù)測(cè)的是，Cb在不同無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)條件下的適應(yīng)性生長(zhǎng)變異將是本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

2　Cb的LPS分型

LPS是很多革蘭陰性菌的血清型特異性抗原，但目前還沒(méi)有Cb血清學(xué)分型研究。由于LPS是Cb的關(guān)鍵保護(hù)性抗原，深入理解不同Cb分離株間的LPS結(jié)構(gòu)和抗原性差異對(duì)研制多價(jià)糖結(jié)合疫苗有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)Cb分離株中至少存在3種LPS化學(xué)型，3者之間的帶型差異可能與導(dǎo)致急性或慢性Q熱相關(guān)[8]，與Cb LPS化學(xué)型相關(guān)的遺傳機(jī)制還不清楚。廣泛的地理分布和宿主多樣性提示Cb存在更多的表型和遺傳多樣性。Vir和Strep是Cb LPS的特有糖組分，但是否是Cb毒株的共有組分值得進(jìn)一步研究。今后有必要分離鑒定更多來(lái)自不同地區(qū)的Cb分離株，深入分析不同分離株的LPS組分和結(jié)構(gòu)差異。

3　Cb的LPS化學(xué)組成與結(jié)構(gòu)

前期對(duì)Cb LPS的研究主要來(lái)自九里、Henzerling、Priscilla和S株。九里L(fēng)PSⅠ至少有3個(gè)主要的組分，相對(duì)分子質(zhì)量分別是19.0、15.0、14.3×103，九里或澳大利亞QD株LPSⅡ的相對(duì)分子質(zhì)量是2.5×103，九里L(fēng)PS Cr的相對(duì)分子質(zhì)量是14.3×103[9]。雖然在九里株中Ⅰ相、中間相和Ⅱ相的LPS分子量在總體上呈梯度下降，但澳大利亞AUSTⅡ株LPSⅡ與九里L(fēng)PS Cr的大小相同[5]，說(shuō)明LPS分子量與Ⅱ相血清反應(yīng)特性間無(wú)必然聯(lián)系。

3.1Ko-Kdo-lipidA基因革蘭陰性菌內(nèi)毒素的主要活性成分是Kdo2-lipidA基團(tuán)。最新研究提示，Cb的Kdo2-lipidA基團(tuán)實(shí)質(zhì)上是Ko-Kdo-lipidA，該結(jié)構(gòu)還存在于鼠疫菌、鼻疽菌、肺炎克雷伯菌、長(zhǎng)灘軍團(tuán)菌和植物病原體青枯菌等[10]。目前還不清楚Ko-Kdo-lipidA是否為Cb生長(zhǎng)所必需的組分，但該基團(tuán)可能與Cb全菌滅活苗的不良反應(yīng)相關(guān)。Ko位于Kdo的外側(cè)，比Kdo多了1個(gè)氧原子。有研究表明鼠疫菌的Kdo加氧酶(KdoO)活性需要空氣氧濃度[10]。KdoO是Cb中唯一已知的Kdo2-lipidA修飾酶。目前較少有Cb Ko或KdoO相關(guān)研究。Ko提高了Ko-Kdo-lipidA的抗酸水解能力。對(duì)于Cb，Ko可能對(duì)其在酸性囊泡內(nèi)增殖有重要意義。

lipidA由脂肪酸鏈通過(guò)酯鍵或酰胺鍵與葡萄糖胺(GlcN)二糖組成。Toman等[11]發(fā)現(xiàn)Henzerling和S株兩株菌的lipidA GlcN二糖連接有4個(gè)?；簝蓚€(gè)酰胺3-羥基脂肪酸和兩個(gè)酯鍵非羥基脂肪酸。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Priscilla株LPSⅠ的兩個(gè)主要組分均含四?；鵯ipidA，有經(jīng)典的雙磷酸GlcN二糖骨架，二糖均通過(guò)酰胺鍵連接3-羥基十六烷酸或異分支3-羥基十六烷酸，其中一種LPS組分的2個(gè)GlcN均通過(guò)酯鍵連接十六烷酸，而另一種LPS組分的第二個(gè)GlcN通過(guò)酯鍵連接反異式分支十五烷酸[12]。鼠疫菌在37 ℃培養(yǎng)時(shí)表達(dá)的lipidA具有類(lèi)似的四?；Y(jié)構(gòu)，重要的是鼠疫菌和Cb的lipidA均為T(mén)LR4的拮抗劑，而不是激活劑[13]。

3.2核心糖一般認(rèn)為Cb LPS內(nèi)核寡糖的成分有Kdo、甘露糖和甘油甘露庚糖，而外核寡糖的成分主要是甘露糖和甘油甘露庚糖[3]。Cb LPS的內(nèi)核和外核寡糖的具體結(jié)構(gòu)還不清楚?？贵w是研究LPS結(jié)構(gòu)的重要工具?，F(xiàn)有研究表明，LPSⅠ與LPSⅡ可能有不同的內(nèi)核寡糖結(jié)構(gòu)，這是因?yàn)長(zhǎng)PSⅡ有內(nèi)核寡糖，無(wú)外核寡糖，但LPSⅡ抗體不能與LPSⅠ發(fā)生反應(yīng)[14]。與該研究不一致的是，Wen等[15]研究發(fā)現(xiàn)LPSⅠ特異的單抗也可以識(shí)別GritaⅡ相株的LPS，但Grita LPSⅢ是否缺失外核寡糖和O抗原還不清楚。還有團(tuán)隊(duì)研制了中和抗體1E4，可特異性識(shí)別14×103條帶，其中和表位可能位于外核寡糖[16-17]，這可解釋Ⅱ相菌為什么不能用于研制Q熱全菌滅活苗。事實(shí)上，LPS Cr的相對(duì)分子質(zhì)量為14×103，而且九里L(fēng)PSⅠ也有14×103條帶[9]，加上不同LPSⅠ組分很可能有相同的核心糖結(jié)構(gòu)，這說(shuō)明1E4有可能識(shí)別的是O-PSⅠ特定組分，該組分是否是LPS Cr值得研究。

3.3O抗原現(xiàn)已知道Cb O-PSⅠ在Cb致病力上發(fā)揮關(guān)鍵作用，O-PSⅠ在單個(gè)菌體表面存在多種不同大小的組分，如九里株至少有3個(gè)主要組分[9]，目前還沒(méi)有對(duì)單種組分的組成、結(jié)構(gòu)與功能的研究。另外，不同Cb分離株間的O-PSⅠ種類(lèi)也存在差異。但總體上，O-PSⅠ至少含有以下幾種糖：Vir、Strep、甘露糖等。如前所述，Vir和Strep是Cb O-PS的標(biāo)志物。除了前述的Cb O-PS的長(zhǎng)度差異，一般認(rèn)為同時(shí)含有Vir和Strep的為L(zhǎng)PSⅠ，缺失Vir的為L(zhǎng)PS Cr，二者均缺失的為L(zhǎng)PSⅡ。Vir和Strep兩種獨(dú)有成分可能位于O-PSⅠ的末端，與Cb的免疫調(diào)節(jié)活性有關(guān)[3]。AUSTⅡ株LPSⅡ和LPS Cr均含有Strep(無(wú)Vir)，它們的長(zhǎng)度介于九里L(fēng)PSⅠ和九里L(fēng)PSⅡ之間，說(shuō)明Vir可能與合成長(zhǎng)鏈O-PS有關(guān)，或者Vir起到接頭的作用以延長(zhǎng)O-PSⅠ并調(diào)節(jié)其構(gòu)象[5]。需要說(shuō)明的是，九里Crazy變異株RSA514分離自被九里Ⅰ相株感染343 d的豚鼠胎盤(pán)，與Ⅰ相抗血清有弱反應(yīng)，與Ⅱ相抗血清無(wú)反應(yīng)，其LPS Cr只有1條14×103條帶。

4　Cb LPS的生物合成

盡管LPS是公認(rèn)的Cb關(guān)鍵毒力因子，但由于研究困難，Cb LPS的合成途徑嚴(yán)重缺乏研究。目前對(duì)Cb LPS合成途徑的理解多是基于蛋白質(zhì)同源性分析和功能預(yù)測(cè)，缺乏實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，Narasaki等[3]詳盡綜述了這方面的進(jìn)展。筆者在這里進(jìn)行簡(jiǎn)要摘譯補(bǔ)充，因?yàn)長(zhǎng)PS合成途徑與研制Q熱疫苗聯(lián)系密切，例如在大腸埃希菌(E.coli)中重組表達(dá)Cb特有的單糖或寡糖結(jié)構(gòu)以研制Q熱糖結(jié)合疫苗等。

4.1lipidA與核心寡糖的合成E.coli的Kdo2-lipidA合成途徑，又稱(chēng)Raetz途徑，共有9種酶依次參與，這些酶的同源基因存在于包括Cb在內(nèi)的幾乎所有革蘭陰性菌[18]。雖然這些酶的種類(lèi)保守，但不同菌的脂質(zhì)A組分及結(jié)構(gòu)都有差異。在Raetz途徑的9種酶中，LpxC是很好的藥物靶標(biāo)，因?yàn)樵撁概c其他脫乙酰酶或酰胺酶無(wú)同源性且被認(rèn)為是菌體生長(zhǎng)必需的酶。脂質(zhì)A或其組分與Cb繁殖間的關(guān)系還有待研究。Ko-Kdo-lipidA合成酶類(lèi)在Cb基因組中散在分布，但核心寡糖與O抗原合成酶類(lèi)聚集在Cb基因組的3個(gè)區(qū)域(見(jiàn)4.2)，這些酶類(lèi)仍有待鑒定。

4.2特異多糖的合成[3]Cb基因組的3個(gè)區(qū)域可能與O-PSⅠ合成有關(guān)：第Ⅰ區(qū)是605781～653889，包含了九里Cr RSA514的刪除突變區(qū)域，可能與Vir合成相關(guān)；第Ⅱ區(qū)是775635～813578，可能與O-PSⅠ骨架糖類(lèi)的合成相關(guān)；第Ⅲ區(qū)是1760021～1768371，可能與Strep的合成相關(guān)。其中CBU0691和CBU0683可能分別是Vir和Strep的合成酶[19]。另外，Cb基因組編碼兩個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的通透酶基因CBU0703和CBU0704。ABC系統(tǒng)通常轉(zhuǎn)運(yùn)線性O(shè)-PS，而Wzy途徑運(yùn)送具有分支結(jié)構(gòu)的O-PS。目前的生物信息學(xué)分析還沒(méi)有在Cb中發(fā)現(xiàn)Wzy途徑相關(guān)基因，因此Cb O-PS Ⅰ可能為線性結(jié)構(gòu)，但還有待證實(shí)。

5　小結(jié)與展望

作為Cb外膜的主要結(jié)構(gòu)組分，LPS是Cb的關(guān)鍵毒力因子和保護(hù)性抗原，在調(diào)節(jié)及逃逸宿主免疫方面發(fā)揮重要功能。關(guān)于Cb LPS的致病機(jī)制研究進(jìn)展，筆者已另文總結(jié)[20]。Cb LPS及其兩種特有組分Vir和Strep在研制Cb疫苗和免疫調(diào)節(jié)劑等方面的應(yīng)用仍有待開(kāi)發(fā)。因?yàn)檠芯咳藛T早已發(fā)現(xiàn)Cb全菌苗或氯仿甲醇沉淀組分可誘導(dǎo)很強(qiáng)的特異性和非特異性免疫保護(hù)作用[21]，并已明確LPS是關(guān)鍵的保護(hù)組分。傳統(tǒng)上Cb培養(yǎng)和操作困難，但Cb無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)和遺傳操作技術(shù)的出現(xiàn)為深入研究Cb LPS的合成及表達(dá)調(diào)控等方面提供了機(jī)遇[22-24]。

基于Cb O-PS的糖結(jié)合疫苗是有潛力的Q熱候選疫苗，一個(gè)重要問(wèn)題是在無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)條件下Cb是否能穩(wěn)定表達(dá)含有兩種特有組分的O抗原。Kuley等[7]在多株Ⅰ相菌中發(fā)現(xiàn)Ⅰ相菌經(jīng)無(wú)細(xì)胞傳代30次以上后LPS相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著下降，進(jìn)一步說(shuō)明深入理解相變異或者LPS在不同培養(yǎng)條件下的適應(yīng)性結(jié)構(gòu)變異對(duì)研制Cb糖結(jié)合疫苗有重要意義。需要指出的是，雖然Cb可以在體外無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)，有研究者仍認(rèn)為Cb歸屬于專(zhuān)性胞內(nèi)寄生菌，因?yàn)楫?dāng)前的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)需要嚴(yán)格低氧條件。今后隨著培養(yǎng)方法的不斷改進(jìn)，Cb LPS的適應(yīng)性表達(dá)需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，現(xiàn)有研究對(duì)Cb LPS的生物合成、組分改變、結(jié)構(gòu)修飾等有限。以下幾個(gè)問(wèn)題將是今后Cb LPS的重要研究方向：(1)不同Cb分離株的LPSⅠ有何異同；(2)不同分子量的LPSⅠ是否有不同的組成與結(jié)構(gòu)差異；(3)不同分子量的LPS是否有不同的免疫調(diào)節(jié)功能及致病力；(4)能否在E.coli中重組不同分子量LPSⅠ的合成途徑；(5)能否利用無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)分離鑒定更多的CbⅡ相變異株以研究相變異的遺傳學(xué)機(jī)制；(6)能否改進(jìn)無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)以研制Q熱糖結(jié)合疫苗。

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病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主課題(SKLPBS1409)。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.029

A

1673-4130(2016)17-2431-03

2016-02-18

2016-04-25)