肺癌的液體活檢和檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

康艷麗 綜述,曹穎平 審校

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科,福州 350000)

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肺癌的液體活檢和檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

康艷麗 綜述,曹穎平△審校

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科,福州 350000)

液體活檢；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；循環(huán)腫瘤DNA；微小核糖核酸；外泌體

原發(fā)性肺癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年我國(guó)主要癌癥發(fā)病順位和死因順位排第一的均是肺癌，肺癌年齡標(biāo)化病死率高達(dá)40.41/10萬(wàn)。肺癌具有發(fā)病率高、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、早期難以發(fā)現(xiàn)、治療效果不佳等特點(diǎn)。腫瘤標(biāo)志物有助于早期診斷肺癌，對(duì)早發(fā)現(xiàn)、早治療有重要作用，并在精準(zhǔn)醫(yī)療和個(gè)體化治療中起重要作用。根據(jù)《原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015版)》，癌胚抗原、細(xì)胞角蛋白19片段抗原、神經(jīng)元特異性烯醇化酶和胃泌素釋放前肽及鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原已被推薦為常用的原發(fā)性肺癌標(biāo)志物[1]。數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，在初診時(shí)57%的肺癌患者已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2],所以發(fā)現(xiàn)新的用于早期診斷和個(gè)體化治療的腫瘤標(biāo)志物十分必要。

小活檢組織標(biāo)本肺癌病理診斷主要為明確有無(wú)腫瘤及腫瘤類型[3]。由于活檢具有創(chuàng)傷性，且多次活檢患者的依從性差，液體活檢成為當(dāng)下熱門研究方向。液體活檢的優(yōu)點(diǎn)包括以下幾項(xiàng)：無(wú)創(chuàng)傷，標(biāo)本容易獲取，可以反映腫瘤的整體狀態(tài)，可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。液體活檢項(xiàng)目目前主要包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、微小核糖核酸(miRNA)和外泌體等。

1　CTCs

1.1CTCs作為潛在標(biāo)志物的研究進(jìn)展CTCs是由原發(fā)腫瘤細(xì)胞脫落到循環(huán)血液中形成，它具有原發(fā)性腫瘤的特征，是潛在的生物標(biāo)志物[4]。CTCs可以作為療效評(píng)測(cè)指標(biāo)。在一項(xiàng)研究中，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)放療前檢測(cè)了CTCs數(shù)量，隨著放療后腫瘤縮小，CTCs數(shù)量也減少，表明CTCs可以作為放療療效評(píng)測(cè)指標(biāo)[5]。CTCs也可作為預(yù)后指標(biāo)。有研究報(bào)道，Ⅴ期的CTCs數(shù)量高于Ⅲ期患者，且治療前較少CTCs的患者治療后的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期更長(zhǎng)，表明CTCs是潛在的預(yù)后指標(biāo)[6]。CTCs作為活的腫瘤細(xì)胞實(shí)體，可提供突變和藥物敏感性分析變化。其細(xì)胞的完整性可進(jìn)行細(xì)胞水平的研究，從DNA、RNA、表觀遺傳學(xué)等方面提供信息。

1.2CTCs的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展CTCs在血液中含量少，大概每100萬(wàn)血細(xì)胞(1 mL血液)中混雜1個(gè)腫瘤細(xì)胞。因此進(jìn)行CTCs研究時(shí)必須先進(jìn)行富集，可采用免疫親和、免疫磁珠標(biāo)志、RT-PCR、CTC chip等方法。CTCs的檢測(cè)方法包括計(jì)數(shù)、免疫熒光、原位雜交、細(xì)胞培養(yǎng)、測(cè)序等方法。其中CTCs全基因組擴(kuò)增和檢測(cè)方法包括基于PCR的qPCR、ARMs-PCR、ME-PCR、dPCR和基于二代測(cè)序的Thermo Fisher等方法。

1.3CTCs的臨床局限性CTCs同時(shí)具有局限性，其分離需要特殊設(shè)備，難以確定是否為真正的腫瘤細(xì)胞，因此依賴單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展。CTCs具有腫瘤異質(zhì)性，樣本代表性不強(qiáng)。這些問(wèn)題仍然影響其在臨床運(yùn)用。

2　ctDNA

2.1ctDNA作為潛在標(biāo)志物的研究進(jìn)展人體的血液中存在血漿游離DNA(cfDNA),其中攜帶腫瘤特有突變信息的成為ctDNA。ctDNA來(lái)源于壞死的或者凋亡的腫瘤細(xì)胞[7]。研究表明，ctDNA可以用來(lái)重建腫瘤基因[8]。Qiu等[9]指出，ctDNA是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因突變狀態(tài)檢測(cè)中具有高特異性和有效性的生物標(biāo)志物，ctDNA的分析將是非小細(xì)胞肺癌的個(gè)性化癌癥治療的一個(gè)關(guān)鍵部分。Nie 等[10]指出，許多基因的改變，如基因突變、雜合性缺失、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和基因甲基化，均可在非小細(xì)胞肺癌患者ctDNA中發(fā)現(xiàn)。因此這些結(jié)果表明ctDNA可以作為一個(gè)可行的工具來(lái)監(jiān)測(cè)NSCLC。研究表明，ctDNA檢測(cè)腫瘤變異比CTCs有更高的敏感性[11]。目前ctDNA被CFDA推薦用于晚期NSCLC中血漿EGFR的檢測(cè)。最近研究表明ctDNA涵蓋腫瘤整體突變信息，比局部組織活檢更具有惡性整體表現(xiàn)[12]。其攜帶某種腫瘤特異性突變或其他基因組改變信息，可用于早期篩查，表現(xiàn)為假陽(yáng)性低，特異性好，可攜帶腫瘤細(xì)胞的體細(xì)胞突變。

2.2ctDNA的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展ctDNA在腫瘤患者體內(nèi)的含量很低，約占整體cfDNA的1%，半衰期短，約為2 h。因此需要靈敏度高的檢測(cè)技術(shù)。目前常用的有digital PCR、BEAMing、標(biāo)記擴(kuò)增深度測(cè)序和癌癥個(gè)體化深度測(cè)序等方法[13]。

2.3ctDNA的臨床局限性ctDNA數(shù)量少，且容易被正常的cfDNA掩蓋，因此需要進(jìn)一步提高靈敏性。ctDNA檢測(cè)結(jié)果無(wú)法定位，無(wú)法檢測(cè)蛋白質(zhì)，無(wú)法從細(xì)胞層面進(jìn)行功能研究。而且，目前由于技術(shù)的局限，ctDNA尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，給臨床使用帶來(lái)一定的局限性。

3　miRNA

3.1miRNA作為潛在標(biāo)志物的研究進(jìn)展miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約20～25個(gè)核苷酸[14]。成熟的miRNA形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。不同的miRNA在不同肺癌類型中起不同的作用。有研究報(bào)道，在NSCLC中起到致癌作用的有miR-21、miR-17/92、miR-31、miR-224等，在NSCLC中起到抑癌作用的有l(wèi)et-7、miR-34b。miR-25在小細(xì)胞肺癌(SCLC)中起致癌作用，在SCLC中起抑癌作用的有miR-34、miR-138、miR-126。方楚玲等[15]綜述了miRNA對(duì)肺癌化療耐藥的調(diào)控，提出：miRNA與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，如miR-495與順鉑藥物敏感性增加有關(guān)[16]；miRNA與細(xì)胞損傷后自我修復(fù)能力有關(guān)，如miR-138與ERCCL的mRNA結(jié)合導(dǎo)致順鉑敏感性增加[17]；miRNA調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，如miR-135a與APC的mRNA結(jié)合，導(dǎo)致紫杉醇耐受[18]；miRNA與上皮細(xì)胞間質(zhì)化有關(guān)，如miR-200家族。在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNA表達(dá)模式具有分化的位相性和時(shí)序性，提示miRNA有可能作為參與調(diào)控基因表達(dá)的分子，因而具有重要意義。

3.2miRNA的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展和臨床局限性miRNA常用的檢測(cè)技術(shù)有RT-PCR、miRNA芯片、Sanger測(cè)序、熒光原位雜交、基因敲除和過(guò)表達(dá)等方法。miRNA種類繁多，相同的miRNA在不同的腫瘤中都可能有異常表達(dá)，缺乏腫瘤異質(zhì)性和代表性，在臨床上使用上存在局限性。

4　外泌體

4.1外泌體作為潛在標(biāo)志物的研究進(jìn)展外泌體是細(xì)胞主動(dòng)向胞外分泌的大小均一的囊泡樣小體,具有抗腫瘤免疫，促血管新生等生理功能[19]。不同類型的細(xì)胞可以釋放出外泌體。外泌體包含脂類、蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA等[20]。外泌體可以用來(lái)做早期診斷、預(yù)后判斷、耐藥評(píng)估。腫瘤來(lái)源的外泌體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥[21]。Xiao等[22]認(rèn)為抑制外泌體的形成和釋放可能是潛在的新的治療肺癌的策略。Rodriguez等[23]分析了外泌體中不同的miRNA。Frydrychowicz等[24]也認(rèn)為認(rèn)識(shí)外泌體和外泌體中的miRNA可能是認(rèn)識(shí)肺癌的關(guān)鍵，為肺癌治療提供了新思路。外泌體能有效地保護(hù)核酸物質(zhì)且穩(wěn)定性好，克服ctDNA容易被降解的問(wèn)題，可以用做ctDNA和miRNA的補(bǔ)充分析。

4.2外泌體的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展和臨床局限性外泌體數(shù)量多于CTCs，更容易富集。常用檢測(cè)技術(shù)有免疫磁珠法、色譜法、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)、納米微粒追蹤分析術(shù)等。目前，利用外泌體來(lái)研究NSCLC相對(duì)較少。其分離需要特殊設(shè)備，可分析的標(biāo)志物相對(duì)較少，無(wú)法進(jìn)行細(xì)胞層面的研究，有一定的臨床局限性。

5　小　　結(jié)

肺癌具有發(fā)病機(jī)制復(fù)制、早期難以發(fā)現(xiàn)等疾病特點(diǎn)，有效的、能夠用于早期發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物的研究對(duì)肺癌治療十分必要。組織活檢是診斷肺癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但具有創(chuàng)傷性和多次活檢的依從性較差的特點(diǎn)，而液體活檢無(wú)創(chuàng)且可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。本綜述側(cè)重描述當(dāng)前熱門的CTCs、ctDNA、miRNA、外泌體和其檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展，同時(shí)分析了臨床局限性。為肺癌的精準(zhǔn)醫(yī)療和個(gè)體化治療提供新的參考。液體活檢除了檢測(cè)CTCs、ctDNA、miRNA、外泌體之外，還可以檢測(cè)mRNA、IncRNA等。在檢測(cè)技術(shù)的不斷創(chuàng)新中，靈敏度不斷的提高，特別是新一代測(cè)序、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)、ddPCR、熒光條形碼標(biāo)記分子檢測(cè)技術(shù)等新技術(shù)，液體活檢這種無(wú)創(chuàng)傷的檢測(cè)將會(huì)成為檢驗(yàn)科新的趨勢(shì)，也為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和個(gè)體化醫(yī)學(xué)提供新的研究參考。

[1]支修益，石遠(yuǎn)凱，于金明．中國(guó)原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015年版)[J]．中華腫瘤雜志，2015，37(1)：67-78．

[2]Edwards BK,Anne-Michelle MS,Mariotto AB,et al.Annual Report to the Nation on the status of cancer,1975-2010,featuring prevalence of comorbidity and impact on survival among persons with lung,colorectal,breast,or prostate cancer[J].Cancer,2014,120(9):1290-1314.

[3]石遠(yuǎn)凱 孫燕，余金明,等.中國(guó)晚期原發(fā)性肺癌診治專家共識(shí)(2016年版)[J].中國(guó)肺癌腫瘤雜志,2016,9(1):1-15.

[4]O′Flaherty JD,Gray S,Richard D,et al.Circulating tumour cells,their role in metastasis and their clinical utility in lung cancer[J].Lung Cancer,2012,76(1):19-25.

[5]Dorsey JF,Kao GD,Macarthur KM,et al.Tracking viable circulating tumor cells(CTCs) in the peripheral blood of non-small cell lung cancer(NSCLC) patients undergoing definitive radiation therapy:pilot study results[J].Cancer,2015,121(1):139-149.

[6]Krebs MG,Sloane R,Priest L,et al.Evaluation and prognostic significance of circulating tumor cells in patients with non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2011,29(12):1556-1563.

[7]Schwarzenbach H,Hoon DS,Pantel K.Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients[J].Nat Rev Cancer,2011,11(6):426-437.

[8]Thierry AR,Mouliere F,El Messaoudi S,et al.Clinical validation of the detection of KRAS and BRAF mutations from circulating tumor DNA[J].Nat Med,2014,20(4):430-435.

[9]Qiu M,Wang J,Xu Y,et al.Circulating tumor DNA is effective for the detection of EGFR mutation in non-small cell lung cancer:a meta-analysis[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2015,24(1):206-212.

[10]Nie K,Jia Y,Zhang X,et al.Cell-free circulating tumor DNA in plasma/serum of non-small cellluncancer[J].Tumour Biol,2015,36(1):7-19.

[11]Punnoose EA,Atwal S,Liu W,et al.Evaluation of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in non-small cell lung cancer:association with clinical endpoints in a phase II clinical trial of pertuzumab and erlotinib[J].Clin Cancer Res,2012,18(8):2391-2401.

[12]Kuo YB,Chen JS,Fan CW,et al.Comparison of KRAS mutation analysis of primary tumors and matched circulating cell-free DNA in plasmas of patients with colorectal cancer[J].Clin Chim Acta,2014,433(7):284-289.

[13]Newman AM,Bratman SV,To J,et al.An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage[J].Nat Med,2014,20(5):548-554.

[14]Croce CM.Oncogenes and cancer[J].N Engl J Med,2008,358(5):502-511.

[15]方楚玲,郭琳瑯.miRNA對(duì)肺癌化療耐藥調(diào)控研究進(jìn)展[J].中華腫瘤防治雜志,2014,21(1):72-76.

[16]Guo L,Liu Y,Bai Y,et al.Gene expression profiling of drug-resistant small cell lung cancer cells by combining microRNA and cDNA expression analysis[J].Eur J Cancer,2010,46(9):1692-1702.

[17] Wang Q,Zhong M.Alterations of microRNA in cisplatin-resisitant human non-small cell lung cancer cells(A549/DDP)[J].Exp lung Res,2011,37(7):427-434．

[18]Holleman A,Chung I,Olsen RR,et al.miR-135a contributes to paclitaxel resistance in tumor cells both in vitro and in vivo[J].Oncogene,2011,30(43):4386-4398.

[19]Lotvall J,Valadi H.Cell to cell signalling via exosomes through esRNA[J].Cell Adh Migr,2009,1(3):156-158.

[20]Mathivanan S,Fahner CJ,Reid GE,et al.ExoCarta 2012:database of exosomal proteins,RNA and lipids[J].Nucleic Acids Res,2012,40(1):1241-1244.

[21]Grange C,Tapparo M,Collino F,et al.Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche[J].Cancer Res,2011,71(15):5346-5356.

[22]Xiao X,Yu S,Li S,et al.Exosomes:decreased sensitivity of lungcancer A549 cells to cisplatin[J].PLoS One,2014,9(2):e89534.

[23]Rodriguez M,Silva J,Lopez-Alfonso A,et al.Different exosome cargo fromplasma/bronchoalveolar lavage in non-small-cell lung cancer[J].Genes Chromosom Cancer,2014,53(9):713-724.

[24]Frydrychowicz M,Kolecka-Bednarczyk A,Madejczyk M,et al.Exosomes-structure,biogenesis and biological role in non-small-cell lung cancer[J].Scand J Immunol,2015,81(1):2-10.

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2016-03-03

2016-05-23)