膠質(zhì)瘤細(xì)胞中巢蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶的表達(dá)研究

李艷娜1 馬靈筠2

1河南省周口市西華縣人民醫(yī)院 466000；2河南科技大學(xué) 河南洛陽(yáng) 471003

膠質(zhì)瘤細(xì)胞中巢蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶的表達(dá)研究

李艷娜1 馬靈筠2（通訊作者）

1河南省周口市西華縣人民醫(yī)院 466000；2河南科技大學(xué) 河南洛陽(yáng) 471003

目的研究巢蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)。方法購(gòu)買(mǎi)A172，U87，U251，LN229，GaMG，pA及pB，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞免疫組化、Western blot分析、RT-PCR和real-time PCR。結(jié)果Β微管蛋白Ⅲ型（classⅢ β-tubulin）、微管相關(guān)蛋白2（MAP-2）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）均表達(dá)于2種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織、5種人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中，均在各種腫瘤細(xì)胞中均一表達(dá)，但是神經(jīng)絲蛋白70不表達(dá)于這些腫瘤細(xì)胞中。NSE在胞質(zhì)核細(xì)胞核區(qū)域存在，但是和胞質(zhì)相比，細(xì)胞核區(qū)域具有顯著較高的染色輕度。classⅢ β-tubulin、NSE均在各種細(xì)胞系中均一表達(dá)，但是MAP-2亞型在不同的細(xì)胞系或腫瘤組織中具有不同的含量，高分子量MAP-2在pA、U251、LN229中高表達(dá)，低分子量MAP-2在pB、A172、U87、GaMG中高表達(dá)，同時(shí)將兩種不同分子量的MAP-2表達(dá)出來(lái)。結(jié)論巢蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)均隨著周?chē)h(huán)境的變化而變化。

巢蛋白；神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白；神經(jīng)元特異性烯醇化酶；膠質(zhì)瘤細(xì)胞；表達(dá)

本文研究通過(guò)研究巢蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)情況及其在不同環(huán)境中的調(diào)控作用，并探討其表達(dá)量與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系，利于后期膠質(zhì)瘤的診斷及治療，具有重要實(shí)踐意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

購(gòu)買(mǎi)美國(guó)ATCC公司生產(chǎn)的A172，U87，U251，LN229，采用諾美卑爾根大學(xué)提供的GaMG，從挪威霍蘭山大學(xué)醫(yī)院神經(jīng)外科病人膠質(zhì)瘤標(biāo)本中提取pA及pB。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，進(jìn)行細(xì)胞傳代，凍存細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇及細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞免疫組化

1）細(xì)胞標(biāo)本制作。將一層放置在37℃的溫度下2h的50μ g/ml聚左旋賴氨酸涂在12mm蓋玻片上，然后將適量細(xì)胞種植出來(lái)，2-3d細(xì)胞爬片。用PBS對(duì)標(biāo)本進(jìn)行2次清洗，用4%多聚甲醛進(jìn)行10min的固定。用0.5%Triton X-100對(duì)標(biāo)本進(jìn)行4min的透化處理。用PBS對(duì)標(biāo)本進(jìn)行3次清洗，將PBS加入其中后在4℃的冰箱中放置將其保存起來(lái)；2）免疫染色。室溫下在封閉液中對(duì)細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行15min的放置，37℃下將細(xì)胞標(biāo)本和一抗進(jìn)行45min的孵育或4℃將細(xì)胞標(biāo)本和一抗孵育過(guò)夜。用PBS對(duì)標(biāo)本進(jìn)行3次清洗，每次5min。37℃下將標(biāo)本和二抗工作液進(jìn)行45min的孵育。用PBS對(duì)標(biāo)本進(jìn)行3次清洗，每次5min，然后用三蒸水對(duì)其進(jìn)行1次清洗。在每個(gè)標(biāo)本中加入5μlVectashield固定液，其中含DAPI，常溫下避光保存，時(shí)長(zhǎng)為2h，將蓋玻片邊緣封閉住，在此過(guò)程中將指甲油充分利用起來(lái)。檢查結(jié)果并將其保存下來(lái)，在此過(guò)程中將尼康Eclipse TE2000-E熒光顯微鏡充分利用起來(lái)。

1.2.3 Western blot分析

制備蛋白樣品，測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，在1.5ml的離心管中將18μl樣本準(zhǔn)備出來(lái)，70℃下對(duì)混合樣本進(jìn)行10min的加熱。組裝玻璃板和12孔NuPage 4-12%Bis-Tris膠，將500μl抗氧化劑及1倍NuPage MOPS SDS電泳緩沖液加入到電泳槽中，將1倍電泳緩沖液加入到外面空間中。將膠底部的氣泡排出，在上樣孔中加入15μl處理好的樣品及7μl SeeBlue Plus2 Prestained標(biāo)準(zhǔn)。插上電極， 200V下進(jìn)行5min電泳。電泳過(guò)程中應(yīng)該對(duì)電壓及電泳時(shí)間進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，在此過(guò)程中嚴(yán)格依據(jù)分子量。將膠從玻璃板上取下時(shí)應(yīng)該從下端開(kāi)始對(duì)凝膠進(jìn)行剝離，使較自然脫落。然后轉(zhuǎn)膜，最后分析化學(xué)發(fā)光及結(jié)果。

1.2.4 RT-PCR和real-time PCR

提取細(xì)胞系總RNA，進(jìn)行RNA定量，然后進(jìn)行RT-PCT，最后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，分析過(guò)程中將LCS480軟件充分利用起來(lái)，向Excel中導(dǎo)入，運(yùn)用CT（2-△△CT）方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。常規(guī)統(tǒng)計(jì)及t檢驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)采用軟件SPSS19.0，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 討論

膠質(zhì)瘤源自神經(jīng)上皮細(xì)胞的腫瘤總稱，約占顱腦腫瘤的45%[1]，屬于臨床中較為常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤。臨床學(xué)者提出了多種關(guān)于膠質(zhì)瘤的起源及發(fā)展的假說(shuō)，其中普遍認(rèn)可腫瘤干細(xì)胞模型及克隆演變模型[2]。長(zhǎng)期以來(lái)，膠質(zhì)瘤認(rèn)為起源于腦間質(zhì)中的膠質(zhì)細(xì)胞，且有部分學(xué)者通過(guò)研究表明：膠質(zhì)瘤中表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物，少數(shù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中含有神經(jīng)元特異性的離子通道。膠質(zhì)瘤形成過(guò)程中極易使得神經(jīng)元的不完全分化，或者來(lái)源膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤的惡心演變中，處于分化。惡性顱腦腫瘤往往包含較顯著的細(xì)胞異質(zhì)性，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中含有其他多種類型的標(biāo)記物，如：神經(jīng)元標(biāo)記物。因此，研究巢蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)研究具有重要意義。本研究結(jié)果表明，巢蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)均隨著周?chē)h(huán)境的變化而變化，值得臨床充分重視。

[1]張晉,金貴善,米蕊芳等.神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的差異基因表達(dá)譜的分析[J].中華神經(jīng)外科雜志,2015,31(3):299-303.

[2]陸娜,馮曉源,邸悅等.CT灌注成像評(píng)價(jià)人腦膠質(zhì)瘤腫瘤血管生成[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)計(jì)算機(jī)成像雜志,2014,20(6):481-484.

R329

A

1672-5018（2016）10-127-01

1.李艷娜，(1982,10--)，女，漢族，河南西華縣人。本科學(xué)歷，河南省周口市西華縣人民醫(yī)院職工，現(xiàn)西華縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科工作。2.馬靈筠 通訊作者，女 河南科技大學(xué)教授，碩士生導(dǎo)師，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)教學(xué)與研究