陳尚武 綜述,李青華 審校
(廣西壯族自治區(qū)梧州市藤縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 543300)
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·綜述·
同型半胱氨酸檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展
陳尚武 綜述,李青華 審校
(廣西壯族自治區(qū)梧州市藤縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科543300)
同型半胱氨酸;色譜技術(shù);酶法分析技術(shù);熒光偏振免疫分析法;熒光探針檢測(cè)技術(shù)
同型半胱氨酸(Hcy)是蛋氨酸去甲基后形成的一種含硫氨基酸,屬于蛋氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物[1]。血漿Hcy是一個(gè)總稱,包括還原型Hcy,雙硫Hcy,混合雙硫半胱氨酸-Hcy和混合雙硫蛋白質(zhì)-Hcy,正常情況下游離Hcy較少,主要以蛋白質(zhì)形式存在[2]。
Mccully[3]描述Hcy尿毒癥患者的血管病變特征,患者的代謝障礙在任何階段,Hcy是引起臨床表現(xiàn)的原因,由此提出Hcy可能與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)。Lcken首次報(bào)道冠心病患者存在Hcy代謝障礙。Kang等發(fā)現(xiàn)MTHFR與Hcy代謝有關(guān)。相關(guān)臨床資料顯示Hcy是冠心病的一個(gè)新的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,可作為心腦血管病、腎臟病、老年癡呆與帕金森癥、妊娠合并癥、先兆子癇與不良事件的預(yù)測(cè)指標(biāo),是近年來醫(yī)學(xué)研究的新熱點(diǎn)。Hcy的檢測(cè)方法也不斷更新,現(xiàn)就Hcy的檢測(cè)技術(shù)綜述如下。
Hcy于1932年由Vincent Du Vigheaud發(fā)現(xiàn),分子式為C4H9NO5S,來源于蛋氨酸,由甲硫氨酸轉(zhuǎn)甲基后生成。合成途徑為蛋氨酸在ATP參與下,由蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(MAT)催化,生成S-腺苷蛋氨酸(SAM),SAM又經(jīng)Hcy甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTase)催化,去甲基生成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH),接著由SAH水解酶催化生成Hcy。
Hcy在體內(nèi)的代謝:(1)Hcy在胱硫醚縮合酶(CBS)的催化下與絲氨酸縮合成胱硫醚,胱硫醚又由胱硫醚酶催化生成半胱氨酸和α酮丁酸,代謝產(chǎn)物進(jìn)入三羧酸循環(huán)或由尿液排出,2步轉(zhuǎn)化均需維生素B6參與或經(jīng)氧化結(jié)合生成高胱氨酸。(2)Hcy可在葉酸和維生素B12的輔助下甲基化重新合成甲硫氨酸,此過程需要甲硫氨酸合成酶(MS)催化,且須有N5-甲基四氫葉酸(THF)作為甲基供體。(3)釋放到細(xì)胞外液。凡是涉及Hcy代謝的各種酶和輔助因子異常均可導(dǎo)致血液中總同型半胱氨酸的增加而形成高同型半胱氨酸血癥。高同型半胱氨酸與老年性癡呆、腎病、糖尿病、妊娠相關(guān)病(如子癇、先天缺陷、死胎、流產(chǎn))等相關(guān)。因此,檢測(cè)Hcy具有重要的臨床意義。
2.1色譜技術(shù)1901年俄國(guó)植物學(xué)家Tswett在進(jìn)行植物色素的分離試驗(yàn)發(fā)明,“色譜法”一詞最早正式出現(xiàn)在《葉綠素的物理化學(xué)研究》和《吸附分析與色譜法》這2篇論文中[4]。色譜法根據(jù)分離原理的不同分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、排阻色譜;根據(jù)固定相的不同可分為柱色譜、薄層色譜、紙色譜;根據(jù)流動(dòng)相物態(tài)的不同分為氣相色譜和液相色譜。應(yīng)用色譜法檢測(cè)Hcy主要有紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC),由于質(zhì)譜(MS)技術(shù)的不斷成熟,Hcy由單一的色譜法發(fā)展到色譜與質(zhì)譜的連用檢測(cè)。
2.1.1薄層色譜法1962年Carson等[5]對(duì)患者的尿液進(jìn)行化學(xué)分析,經(jīng)紙色譜進(jìn)一步分析確定為Hcy。國(guó)內(nèi)利用薄層色譜技術(shù)檢測(cè)Hcy的報(bào)道在上世紀(jì)80~90年代較多,且大多數(shù)方法為吳有光等和閆英地等[6-10]的雙向薄層色譜法分析氨基酸,如利用微型雙向薄層色譜法檢測(cè)氨基酸代謝病,利用雙向展開劑,第1向展開劑為異丙醇-乙酸乙酯-丙酮-甲醇-仲戊醇-氨水-水(9∶3∶3∶1∶1∶3∶3),第2向展開劑為正丁醇-丙酮-異丙醇-甲酸-水(9∶4∶4∶1.5∶3),以鎘-茚三酮酸化丙酮溶液為顯色劑,通過與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì),定性檢測(cè)1例Hcy尿毒癥患者,雖然薄層掃描法可用于Hcy的定量檢測(cè),但因該方法靈敏性低、重復(fù)性差、標(biāo)本前處理操作繁瑣等原因,臨床未能得到普及[11]。
2.1.2氣相色譜法1987年Stabler等[12]首先報(bào)道GC-MS用于血漿Hcy檢測(cè),該法首先在標(biāo)本中加入內(nèi)標(biāo)物,沉淀蛋白后上清液用離子交換柱色譜進(jìn)行預(yù)處理,使用水復(fù)溶,衍生處理后進(jìn)樣經(jīng)GC-MS分析,以保留時(shí)間和質(zhì)譜進(jìn)行定性和定量。Myung等[13]應(yīng)用固相微萃取技術(shù)處理標(biāo)本,采用GC-MS同時(shí)檢測(cè)樣品中的Hcy、半胱氨酸和蛋氨酸含量。有研究報(bào)道,將GC法聯(lián)合電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)檢測(cè)血清總的Hcy、半胱氨酸和蛋氨酸,該法往樣品中加入硼氫化鈉打開二硫鍵,最終衍生成N-三氟乙酰-O-異丙酯衍生物進(jìn)行測(cè)定[14]。雖然這些方法具有高度的精密性、靈敏性和專一性,但操作復(fù)雜,化學(xué)試劑毒性大,耗時(shí)長(zhǎng),難以適合常規(guī)臨床化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的使用,無法普及。
2.1.3液相色譜法根據(jù)檢測(cè)方法的不同又可分為紫外法(HPLC-UV)、熒光法(HPLC-FD)、示差折光法(HPLC-RID)、電化學(xué)法(HPLC-ED)等。HPLC-FD方法主要采用柱前或柱后衍生技術(shù),然后通過HPLC將衍生物分離,并由熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。相關(guān)研究報(bào)道使用了這種方法[15-17]。HPLC-ED具有標(biāo)本處理簡(jiǎn)單,無需衍生化等特點(diǎn),又具較高的靈敏性、專一性、穩(wěn)定性,應(yīng)用比較廣泛,文獻(xiàn)報(bào)道也比較多[18-19]。
近幾年研究表明較多的是HPLC-MS聯(lián)用方法,Espina等[20]建立高效液相色譜聯(lián)合電感耦合等離子體質(zhì)譜和電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS-ESI-MS)法測(cè)定血清中游離Hcy;國(guó)內(nèi)還采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)聯(lián)合檢測(cè)血清中葉酸代謝物[21],該法采用 BEH C18 色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),以甲酸-乙腈為流動(dòng)相,流速為 0.4 mL/min, 進(jìn)樣體積 5 μL,梯度洗脫,電噴霧正離子模式下以多反應(yīng)檢測(cè)(MRM) 方式,6 種葉酸代謝產(chǎn)物[葉酸、5-甲基四氫葉酸(5-MeTHF) 、5-甲酰四氫葉酸( 5-FoTHF)、Hcy、SAM、SAH] 分別在一定范圍內(nèi)呈線性相關(guān),加樣回收率及日內(nèi)與日間精密度良好。
HPLC法是目前公認(rèn)的高精密度的濃度檢測(cè)方法,具有特異性高、靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn),色譜條件確定后一般均可獲得穩(wěn)定的結(jié)果。
2.2酶法分析技術(shù)酶法分析技術(shù)是以酶為試劑測(cè)定酶促反應(yīng)的底物、輔酶、輔基、激活劑、抑制劑及酶偶聯(lián)法測(cè)定酶活性等的方法。由于酶作用的特異性高,成分復(fù)雜的血清等液體標(biāo)本不需進(jìn)行預(yù)處理就能檢測(cè),極大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作程序,試劑酶的本質(zhì)大多是蛋白質(zhì),酶促反應(yīng)的條件溫和,無毒性,具有良好的應(yīng)用前景。
2.2.1酶循環(huán)法羅氏公司采用酶比色法測(cè)定血清Hcy,其原理為氧化型 Hcy首先被還原為游離 Hcy,然后在 Hcy S-甲基轉(zhuǎn)移酶催化下,再與S-腺苷甲硫氨酸反應(yīng)形成甲硫氨酸(Met)和SAH。SAH的評(píng)估是通過一種偶聯(lián)的酶反應(yīng),其中 SAH經(jīng) SAH 水解酶催化形成腺苷(Ado)和 Hcy ,而 Hcy 又循環(huán)進(jìn)入 Hcy轉(zhuǎn)化反應(yīng)中,形成的循環(huán)反應(yīng)擴(kuò)大了檢測(cè)信號(hào)從而被檢測(cè)。
2.2.2酶轉(zhuǎn)換法原理為氧化型Hcy首先被還原劑還原為還原型Hcy,還原型Hcy隨后被分解,分解產(chǎn)物在氧化劑(如FeCl3)存在下與呈色劑二乙基對(duì)苯二胺硫酸鹽反應(yīng)形成甲基藍(lán)色化物,甲基藍(lán)色化物與標(biāo)本Hcy的濃度呈正比,通過測(cè)定吸光度的變化值,即可檢測(cè)標(biāo)本的Hcy總濃度。
眾多報(bào)道顯示酶法分析技術(shù)與熒光偏振免疫法(FPIA)及高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行對(duì)比,各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯差異,酶法檢測(cè)血清Hcy具有操作簡(jiǎn)單、精密度良好,線性范圍寬等諸多優(yōu)點(diǎn),且結(jié)果準(zhǔn)確,值得推廣[22-24]。
2.3FPIA法是一種定量免疫分析技術(shù),其基本原理是熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的藍(lán)偏振光(485 nm)照射后,吸收光能躍入激發(fā)態(tài),隨后回復(fù)至基態(tài),并發(fā)出單一平面的偏振熒光(525 nm)。偏振熒光的強(qiáng)弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān),與其(受激發(fā)時(shí))轉(zhuǎn)動(dòng)的速度呈反相關(guān)。FPIA最適宜檢測(cè)小至中等分子物質(zhì),常用于藥物、激素的檢測(cè)。采用競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)原理,在缺乏未標(biāo)記分析物(通常是待測(cè)樣品)時(shí)熒光信號(hào)最強(qiáng);加入未標(biāo)記分析物后,在已標(biāo)記和未標(biāo)記標(biāo)本之間的競(jìng)爭(zhēng)將減弱熒光信號(hào)。熒光信號(hào)強(qiáng)度與游離的分析物濃度呈正比,與待測(cè)標(biāo)本中未標(biāo)記分析物的濃度呈反比。
FPIA法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高,如檢測(cè)Digoxin的靈敏度可達(dá)0.2 ng/mL,精密度高、速度快、操作簡(jiǎn)便,標(biāo)本用量少,儀器不需每日校準(zhǔn)。缺點(diǎn)是試劑盒專屬性強(qiáng),儀器設(shè)備昂貴。
2.4熒光探針檢測(cè)技術(shù)熒光探針一般由熒光基團(tuán)和識(shí)別基團(tuán)通過連接基團(tuán)連接而成。熒光基團(tuán)具有大π鍵共軛體系,屬剛性平面結(jié)構(gòu),是發(fā)射熒光并通過儀器輸出電信號(hào)的信號(hào)基團(tuán)。識(shí)別基團(tuán)是通過絡(luò)合或(和)化學(xué)反應(yīng)與被分析物發(fā)生作用的部分。當(dāng)識(shí)別基團(tuán)選擇性地與被分析物結(jié)合或反應(yīng)時(shí),引起探針的化學(xué)環(huán)境發(fā)生改變,一般表現(xiàn)為熒光基團(tuán)突光信號(hào)的增強(qiáng)或減弱。
Hcy、半胱氨酸和還原型谷胱甘肽(GSH)等是生物體中主要的小分子生物硫醇化合物,在維持生物的正常生理活動(dòng)中起重要作用。根據(jù)探針與生物硫醇化合物的反應(yīng)機(jī)制,可把探針分為2大類[25]。第1類主要是利用生物硫醇分子中巰基的親核性、還原性和金屬離子絡(luò)合能力與探針分子發(fā)生反應(yīng)。第2類熒光探針設(shè)計(jì)主要是利用熒光探針與生物醇中巰基和氨基官能團(tuán)發(fā)生協(xié)同反應(yīng)。
探針檢測(cè)技術(shù)目前臨床應(yīng)用的報(bào)道非常少,但研究性文獻(xiàn)較多。Yang等[26]研究報(bào)道利用醛基探針檢測(cè)小分子生物硫醇化合物,該探針可選擇性地與硫醇化合物中的Hcy和半胱氨酸發(fā)生反應(yīng),且成功應(yīng)用到生物成像中檢測(cè)低毒性的活細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸和Hcy。不同物質(zhì)設(shè)計(jì)的熒光基團(tuán),與探針的反應(yīng)機(jī)制與也不相同,如以黃酮類、香豆素類、吡唑啉類物質(zhì)等。Xie等[27]研發(fā)設(shè)計(jì)的熒光探針基于醛基的環(huán)合反應(yīng),通過抑制C=N鍵誘導(dǎo)分子內(nèi)氫鍵作用引起熒光淬滅而使吸收峰出現(xiàn)藍(lán)移(107 nm),該機(jī)制已通過H1NMR譜和MS譜的分析驗(yàn)證。Zhang等[28]基于黃酮類物質(zhì)設(shè)計(jì)的熒光探針對(duì)半胱氨酸和Hcy的靈敏度高。Dai等[29]采用醛基香豆素氯化物研發(fā)熒光探針,GSH、Hcy、半胱氨酸的檢測(cè)限分別是0.08、0.09、0.18 μmol/L。
熒光探針技術(shù)具有體積小、合成簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好、可直接觀察等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn):(1)一些熒光探針溶解在考察體系后,難以提取分離,不具備多次重復(fù)使用。(2)因一些小分子熒光探針的非水溶性與不良反應(yīng),使其臨床應(yīng)用受到限制。(3)小分子熒光探針難以制作成光學(xué)器械與光學(xué)儀器結(jié)合,無法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)。由于熒光探針的普適性不強(qiáng),因此應(yīng)用受到較大限制。
綜上所述,血漿或血清Hcy檢測(cè)可給臨床診斷或觀察提供必要的科學(xué)依據(jù),檢測(cè)方法較多且各具特點(diǎn),目前臨床主要以酶法分析技術(shù)為主,標(biāo)本不需進(jìn)行預(yù)處理,極大地簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作程序,適應(yīng)臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的要求,值得臨床推廣應(yīng)用。
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2016-02-16
2016-04-11)