靶向肝星狀細(xì)胞的基因治療逆轉(zhuǎn)肝纖維化的研究進(jìn)展

諶雙君 趙衛(wèi)華 叢敏

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靶向肝星狀細(xì)胞的基因治療逆轉(zhuǎn)肝纖維化的研究進(jìn)展

諶雙君 趙衛(wèi)華 叢敏

作者單位：100050 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院肝病中心，肝硬化轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心

肝纖維化由肝臟受到慢性損傷后細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積引起，激活的肝星狀細(xì)胞（HSCs）是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源。肝纖維化是許多慢性肝臟疾病的共同病理基礎(chǔ)與特征，包括病毒性和自身免疫性肝炎，鐵沉積，酒精性肝病和膽汁淤積等。目前認(rèn)為肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解失衡，導(dǎo)致其在肝內(nèi)過(guò)度沉積是肝纖維化發(fā)展的主要機(jī)制。肝損傷導(dǎo)致HSCs活化并失去其靜止表型?；罨腍SCs具有肌成纖維細(xì)胞樣表型，細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)上調(diào)如a-SMA，同時(shí)分泌大量膠原。HSCs是肝臟中主要的促纖維化細(xì)胞，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源［1，2］。肝纖維化如果不能得到及時(shí)治療將會(huì)進(jìn)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌，并會(huì)出現(xiàn)一系列并發(fā)癥如食管靜脈曲張破裂出血、肝性腦病、腹水、肝腎綜合征等，給患者帶來(lái)巨大的痛苦甚至威脅生命［2］。為此，針對(duì)肝纖維化逆轉(zhuǎn)，尤其是抑制HSCs活化或者誘導(dǎo)活化后HSCs凋亡的研究成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。由于，目前對(duì)肝纖維化逆轉(zhuǎn)的研究主要是通過(guò)作用于HSCs，抑制其促纖維化基因的表達(dá)及誘導(dǎo)其凋亡等?，F(xiàn)就近年來(lái)靶向肝星狀細(xì)胞的基因治療研究進(jìn)展綜述如下。

一、靶向阻斷HSCs受體-配體的相互作用促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)

（一）轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGFβ1）及其受體 肝纖維化過(guò)程中，HSCs被激活并且通過(guò)提高對(duì)可溶性介質(zhì)的反應(yīng)能力進(jìn)行增殖，進(jìn)而發(fā)揮促炎及促纖維化作用［3］。在這些可溶性介質(zhì)中，TGFβ1是一個(gè)很重要的細(xì)胞因子，其通過(guò)Smad2/3信號(hào)通路促進(jìn)HSCs的激活［3］。在纖維化動(dòng)物模型及肝纖維化病人體內(nèi)均可檢測(cè)到TGFβ信號(hào)通路的增強(qiáng)［4］，因此，阻斷TGFβ介導(dǎo)的這一信號(hào)通路對(duì)有效逆轉(zhuǎn)肝纖維化具有重要意義。

有研究［3］發(fā)現(xiàn)通過(guò)微小RNA（miRNA）-101抑制TGFβ信號(hào)通路進(jìn)而能夠緩解肝纖維化。研究者通過(guò)建立四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型發(fā)現(xiàn)在肝纖維化進(jìn)展過(guò)程中，肝組織、激活的星狀細(xì)胞及受損的肝細(xì)胞miR-101表達(dá)水平顯著降低；通過(guò)預(yù)防性給予以慢病毒為載體的miR-101可以顯著減輕肝纖維化，而給予反義寡核苷酸抑制miR-101的表達(dá)后加重肝纖維化。此外，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-101抑制活化星狀細(xì)胞的增殖和遷移及活化標(biāo)志物的表達(dá)，使星狀細(xì)胞由活化狀態(tài)轉(zhuǎn)化為靜止?fàn)顟B(tài)。究其機(jī)制，miR-101在肝纖維化形成過(guò)程中通過(guò)靶向作用于TGFβ1受體（TβRI）及其轉(zhuǎn)錄激活因子KLF6，進(jìn)而抑制TGFβ信號(hào)通路，最終抑制促纖維化細(xì)胞因子的產(chǎn)生、肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。

此外，另有研究發(fā)現(xiàn)miR-30也在肝纖維化中參與TGFβ信號(hào)通路的調(diào)控。以腺病毒為載體誘導(dǎo)miR-30在CCl4肝纖維化小鼠模型中的表達(dá)，可以通過(guò)miR-30作用于轉(zhuǎn)錄因子KLF11進(jìn)而抑制TGFβ信號(hào)通路［5］，最終顯著降低肝纖維化程度。

因?yàn)橄到y(tǒng)性抑制TGFβ會(huì)誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)或者導(dǎo)致上皮細(xì)胞增生甚至腫瘤的發(fā)生，因此靶向HSCs中的TGFβ信號(hào)通路可能是肝纖維化治療中的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。

（二）神經(jīng)受體 內(nèi)源性大麻素（CB）家族起源于花生四烯酸，其通過(guò)與CB1和CB2受體結(jié)合，抑制免疫細(xì)胞的活化，維持輔助性T細(xì)胞（Th）1/Th2的平衡，進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［6］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)肝硬化病人肝內(nèi)肌成纖維細(xì)胞CB1受體表達(dá)增加，并且小鼠肝纖維化模型及非酒精性脂肪性肝炎模型中肝臟肌成纖維細(xì)胞表達(dá)的CB1受體增高［7］。

有學(xué)者［8］通過(guò)構(gòu)建以慢病毒為載體靶向作用于CB1受體的小干擾RNA（CB1-RNAi-LV）發(fā)現(xiàn)其在抑制大鼠原代HSCs 的CB1受體表達(dá)的同時(shí)可以顯著抑制星狀細(xì)胞的活化、增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。此外，給予大鼠尾靜脈注射CB1-RNAi-LV治療，可以明顯降低二甲基亞硝胺誘發(fā)的肝纖維化程度，大鼠肝臟間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA，波形蛋白等表達(dá)水平均降低。此研究通過(guò)體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了抑制星狀細(xì)胞CB1受體的表達(dá)對(duì)肝纖維化具有抑制作用。

另有研究［9］發(fā)現(xiàn)外周選擇性CB1受體拮抗劑VD60能顯著抑制大鼠原代HSCs及人星狀細(xì)胞系LX-2的增殖，使α2（I）前膠原MRNA表達(dá)水平顯著降低。此外，VD60在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型體內(nèi)具有抗纖維化活性。綜上所述，抑制HSCs CB1受體已為肝纖維化的治療提出新的思路。

（三）血管緊張素II1型（AT1）受體 血管緊張素II由星狀細(xì)胞分泌，其可與1型受體結(jié)合，通過(guò)JAK2介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮作用［10］。應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制劑或AT1受體阻滯劑（ARBs）阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)對(duì)臨床肝纖維化的治療可能有效。有研究［11］發(fā)現(xiàn)AT1與大麻素通過(guò)受體的異二聚體作用可以發(fā)揮協(xié)同作用。研究者通過(guò)運(yùn)用免疫共沉淀、共振能量轉(zhuǎn)移分析等方法發(fā)現(xiàn)AT1受體與CB（1）受體形成異二聚體，從酒精性飲食的大鼠肝臟內(nèi)分離HSCs，發(fā)現(xiàn)其AT1 R-CB（1）R異聚體表達(dá)水平顯著升高，血管緊張素II介導(dǎo)的信號(hào)通路表達(dá)增強(qiáng)。此外，阻斷CB1受體的活性可以抑制血管緊張素II介導(dǎo)的促有絲分裂信號(hào)通路，使促纖維化基因表達(dá)降低。這為聯(lián)合應(yīng)用ARB和CB1受體阻斷劑治療肝纖維化提供了理論依據(jù)。

（四）酪氨酸蛋白激酶受體 許多增殖性細(xì)胞因子包括血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF），成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）及腫瘤壞死因子（TGF）-α信號(hào)通路通過(guò)酪氨酸蛋白激酶受體發(fā)揮作用。索拉非尼，是一種多種酪氨酸激酶受體抑制劑，可以靶向作用于PDGF受體及Raf/ERK信號(hào)通路，在動(dòng)物模型中具有抗纖維化作用［12］。作為小分子酪氨酸激酶拮抗劑的伊馬替尼，也具有抗纖維化的作用［13］。體外培養(yǎng)的HSCs給予甲磺酸伊馬替尼處理后，其凋亡增加，增殖減少；CCl4小鼠肝纖維化模型給予甲磺酸伊馬替尼治療后可以緩解肝纖維化，促進(jìn)肝再生［13］。

二、通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的降解促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)

肝纖維化時(shí)ECM合成和降解失衡，從而導(dǎo)致ECM的過(guò)度沉積，其中ECM降解由MMPs介導(dǎo)，而MMPs的活動(dòng)由金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）調(diào)節(jié)［14］?；罨腍SCs除了I型膠原合成增加之外，TIMPs表達(dá)增加使ECM合成和降解失調(diào)并向合成增加的方向發(fā)展，引起組織纖維化［15］。TIMPs共有四種，在肝損傷中發(fā)揮作用的主要是TIMP-1［16］。許多研究發(fā)現(xiàn)TIMP-1不僅可以通過(guò)阻斷MMPs的功能阻止ECM的降解，而且能抑制活化HSCs的凋亡［17］。因此，抑制TIMP-1的表達(dá)將有助于促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。

Cong等［18］通過(guò)構(gòu)建以腺相關(guān)病毒為載體靶向作用于大鼠TIMP-1的小干擾RNA（rAAV/siRNA-TIMP-1）在抑制大鼠HSC-T6細(xì)胞系TIMP1基因的表達(dá)的同時(shí)可以使MMP-13表達(dá)增加。研究者又進(jìn)一步證實(shí)了rAAV/siRNA-TIMP-1在大鼠肝纖維化模型中的作用。對(duì)CCl4和膽管結(jié)扎兩種大鼠肝纖維化模型給予rAAV/siRNA-TIMP-1治療發(fā)現(xiàn)能夠顯著減輕肝纖維化的程度，星狀細(xì)胞激活標(biāo)志物α-SMA及TGFβ1水平均顯著降低，并且MMP13活性及表達(dá)水平顯著升高。rAAV/siRNA-TIMP-1治療通過(guò)直接提高M(jìn)MP-13的表達(dá)及減少活化HSCs使細(xì)胞外基質(zhì)降解增多，合成減少，進(jìn)而減輕肝纖維化［19］。

目前認(rèn)為，未充分交聯(lián)的膠原更易被內(nèi)源性膠原酶和其他酶所降解。研究發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，小鼠纖維化肝組織中膠原交聯(lián)酶賴氨酰氧化酶2（LOXL2）水平升高，對(duì)CCl4小鼠肝纖維化模型給予LOXL2單克隆抗體治療可以緩解肝纖維化，并使其p-Smad3表達(dá)水平顯著降低［20］。

因此抑制TIMP-1的表達(dá)或者封閉膠原纖維交聯(lián)酶的作用可能是一種有效的抗纖維化治療方法。

三、靶向作用于HSCs表達(dá)的蛋白促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)

（一）金屬硫蛋白（MT） MT是一種重要的鋅離子結(jié)合型蛋白，與鋅的代謝及穩(wěn)態(tài)有關(guān)［21］，但近年來(lái)其在肝纖維化中的作用受到關(guān)注。

Jiang等［22］應(yīng)用CCl4小鼠肝纖維化模型發(fā)現(xiàn)在肝纖維化進(jìn)展期肝內(nèi)MT表達(dá)水平降低，而在逆轉(zhuǎn)期肝內(nèi)MT表達(dá)水平升高。敲除小鼠MT基因給予CCl4四周停藥后無(wú)纖維化的逆轉(zhuǎn)，對(duì)不可逆轉(zhuǎn)期肝纖維化模型及MT敲除肝纖維化模型小鼠給予以腺病毒為載體的人金屬硫蛋白IIA（h MT-IIA）基因治療可以使肝纖維化逆轉(zhuǎn)，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，推測(cè)MT在肝纖維化逆轉(zhuǎn)中發(fā)揮著重要作用。

Xu等［23］又進(jìn)一步證實(shí)了h MT-IIA轉(zhuǎn)染對(duì)人肝星狀細(xì)胞中金屬蛋白酶表達(dá)改變的影響作用。人星狀細(xì)胞系LX-2在培養(yǎng)24小時(shí)后表達(dá)α-SMA、I型膠原增多，膠原酶表達(dá)水平降低，以質(zhì)粒為載體將人MT-IIA基因轉(zhuǎn)染入活化的HSCs可以使其MT蛋白水平升高并伴隨α-SMA、I型膠原及其MRNA表達(dá)水平降低及金屬蛋白酶（MMP）1，8，13表達(dá)水平的升高。這說(shuō)明HSCs活化狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)，尤其是膠原酶表達(dá)水平的上調(diào)可能參與MT基因治療中肝纖維化的逆轉(zhuǎn)，但是其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

（二）N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶V（Gn T-V） 糖基化是真核細(xì)胞最常見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾作用之一，由高爾基體糖基轉(zhuǎn)移酶催化，因此糖基化異常主要由糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)異常引起［24］。N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶V（Gn T-V）作為糖基轉(zhuǎn)移酶的一種，其在肝纖維化中的作用近年來(lái)備受關(guān)注。

最近有學(xué)者［25］通過(guò)腹腔注射CCl4或硫代乙酰胺（TAA）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)在肝纖維化形成過(guò)程中肝內(nèi)Gn T-V顯著升高。同時(shí)，激活的星狀細(xì)胞及損傷的肝細(xì)胞中Gn T-V表達(dá)上調(diào)。對(duì)CCl4或硫代乙酰胺（TAA）誘導(dǎo)的肝纖維化模型小鼠尾靜脈注射以腺病毒為載體靶向作用于Gn T-V的小干擾RNA（Ad MS1）可以緩解纖維化。體外對(duì)HSC-T6轉(zhuǎn)染Ad MS1，48-72小時(shí)后其促纖維化基因（I型膠原、αSMA、TIMP-1及波形蛋白）的表達(dá)水平顯著降低。此外，敲除星狀細(xì)胞中的Gn T-V基因可以減弱TGFβ/ Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并抑制HSCs的活化，并且可以通過(guò)阻斷PDGF/Erk信號(hào)通路進(jìn)而抑制血小板源性生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的星狀細(xì)胞擴(kuò)增及遷移。

因此，Gn T-V參與毒素誘導(dǎo)的肝纖維化進(jìn)程，靶向作用于Gn T-V可能是治療肝纖維化的可行、有希望的方法。

四、刺激活化星狀細(xì)胞的凋亡促進(jìn)肝纖維化逆轉(zhuǎn)

肌成纖維細(xì)胞的凋亡可以有效促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)，其抗凋亡蛋白如Bcl-2及轉(zhuǎn)錄因子如NF-kB表達(dá)的增加［26］，可以促進(jìn)HSCs的生存。在動(dòng)物模型中證實(shí)，NF-kB抑制劑膠霉毒素能夠促進(jìn)肝纖維化的恢復(fù)，柳氮磺嘧啶與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑也可通過(guò)抑制NF-kB信號(hào)通路來(lái)降低肌成纖維細(xì)胞生存率從而具有抗纖維化的作用［26］。

NK細(xì)胞能夠清除活化的星狀細(xì)胞，因此，通過(guò)促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖將會(huì)有助于減輕肝纖維化。NK細(xì)胞活化后產(chǎn)生的IFN-γ，也是NK細(xì)胞抗纖維化的重要機(jī)制之一。盡管體液輸入IFN-γ在臨床試驗(yàn)中并未取得滿意的效果，研究者仍更多地關(guān)注著受體介導(dǎo)的靶向活化的HSCs的IFN-γ治療方案［27］。

綜上所述，通過(guò)靶向阻斷HSCs受體-配體的相互作用、增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的降解、靶向作用于HSCs表達(dá)的纖維化相關(guān)蛋白及刺激活化星狀細(xì)胞的凋亡，均可促進(jìn)肝纖維化逆轉(zhuǎn)。這些研究都為臨床肝纖維化治療提供了希望和思路。

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（本文編輯：馮珉）

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收稿日期：（2015-09-10）

通信作者：叢敏，Email：mao mao0623@sina.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81370544），北京市自然科學(xué)基金（7142043），王寶恩肝纖維化基金（CFHPC0120131）