布魯菌實驗室檢測技術(shù)進展

龔玉姣 張 晶 周 勇 楊智聰

（廣州市疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510440）

布魯菌實驗室檢測技術(shù)進展

龔玉姣 張 晶 周 勇 楊智聰

（廣州市疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510440）

David Bruce在19世紀60年代首次確認布魯菌（即布氏桿菌）是人畜共患病布魯菌病的致病菌。至今，布魯菌病仍困擾著多個國家和地區(qū)的人和家畜，引起一系列畜牧業(yè)和公共健康方面的問題及經(jīng)濟損失[1]。布魯菌病累及多個系統(tǒng)，臨床表現(xiàn)不典型，其診斷具有挑戰(zhàn)性。慢性布魯菌病及復雜布魯菌病如診斷不明則會產(chǎn)生高額的檢查費用，因此檢驗科工作人員需要了解并掌握布魯菌病的各項實驗室診斷技術(shù)。布魯菌病的實驗室診斷主要基于從臨床樣本中分離出布魯菌、標準微生物試管試驗、抗布魯菌抗體血清學檢測以及布魯菌DNA的分子檢測。 本文對布魯菌的檢測方法及其最新進展綜述如下。

1 布魯菌的分離與鑒定

布魯菌病的確診要求從血、骨髓或其他組織和體液中分離出病原菌。臨床樣本中布魯菌的菌量差別很大，因此布魯菌的分離高度依賴于疾病的發(fā)展階段（急性還是慢性）、抗生素的使用、臨床標本是否取材得當以及培養(yǎng)方法是否恰當[2]。在起病前2周發(fā)熱階段獲得的標本中分離出布魯菌的幾率較高；骨髓標本培養(yǎng)比血培養(yǎng)要敏感而且培養(yǎng)時間較短。經(jīng)典的選擇培養(yǎng)基中含有萘啶酸和桿菌肽素，嚴重影響馬耳他布魯菌和豬布魯菌的生長。因此，含有萬古霉素、黏菌素、制霉素、呋喃妥英和兩性霉素B的新型選擇培養(yǎng)基被推薦用于畜類標本，然而目前沒有該培養(yǎng)基在人患布魯菌病中使用的研究報道[3]。

患者的血經(jīng)4 d左右的培養(yǎng)即可找到病原菌，使用自動血培養(yǎng)系統(tǒng)如BACTEC系統(tǒng)，檢測效率會更高。但是對于疑似病例，將培養(yǎng)時間延長到至少4周，同時間斷傳代培養(yǎng)，才能更可靠地排除布魯菌感染。對于含菌量較少的標本，可以采用快速培養(yǎng)法（shell vial culture）分離兼性厭氧的胞內(nèi)菌[4]。

對可疑菌落的早期快速判斷方法是玻片凝集試驗，即將未經(jīng)稀釋的多價布魯菌抗血清與菌落的生理鹽水懸液混合并預(yù)判。布魯菌的種類和分型鑒定則需要測試是否需要CO2、是否產(chǎn)生H2S、尿素酶的活性、與單特異性血清是否凝集、在選擇培養(yǎng)基中的生長情況以及噬菌體型。以上實驗耗時且判讀結(jié)果因人而異，因而并不適用于臨床常規(guī)檢測。作為替代的半自動代謝分型系統(tǒng)（Micronaut）擁有93種不同的底物，既能減少手工作業(yè)時間，又能減少經(jīng)實驗室獲得感染的幾率[5]。近些年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF）的發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)成為臨床微生物檢驗的強有力工具之一。與傳統(tǒng)方法相比，質(zhì)譜技術(shù)快速、精確且經(jīng)濟。采用質(zhì)譜的方法可以直接從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中鑒定布魯菌，但是細菌的鑒定需要大規(guī)模的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，而由于布魯菌傳染劑量較低、一旦致病則病程較為持久，有被用于生化武器的可能性，因此布魯菌被劃分為B類“選擇性生物恐怖主義物種”，這就使得針對布魯菌數(shù)據(jù)庫的建立受到極大限制[6]。

2 布魯菌病的血清學診斷

與細菌培養(yǎng)不同，布魯菌病的血清學試驗快速、無害、更敏感，因此在臨床工作中被廣為采用。但血清學試驗只能間接證明布魯菌的感染。一般認為，凝集效價≥1:160或者在隨訪過程中抗體滴度升高4倍及以上則可判定為活動性布魯菌感染。然而，患者痊愈后的數(shù)月甚至數(shù)年，抗體檢測依舊可以陽性。截至目前，能夠用于血清學試驗的標準參考抗原還沒有找到，一是因為布魯菌的脂多糖（LPS）可與臨床上其他常見細菌如耶爾森菌、志賀菌、霍亂弧菌等產(chǎn)生交叉反應(yīng)，二是因為不是所有布魯菌都有相同的抗原成分。

現(xiàn)階段，血清凝集試驗（SAT）仍然被認為是參考標準。缺點是耗時耗力。 虎紅試驗（RBT）將試管改良為卡片、玻片或平板，將經(jīng)虎紅染色的牛布魯菌的抗原懸液與血清混合（pH=3.65），觀察凝集?；⒓t試驗快速、簡單，缺點在于對于慢性布魯菌病的假陰性較高。經(jīng)典Coombs試驗可以作為血清凝集試驗的補充，該方法可以檢測非凝集抗體。在慢性布魯菌病以及復發(fā)布魯菌病的患者中，SAT結(jié)果可能為陰性或不確定，此時Coombs試驗診斷價值很高。不過，SAT與Coombs試驗均費時費力。鑒于此，一種基于全抗體檢測的免疫捕獲方法布魯菌捕獲(Brucellacapt)應(yīng)運而生。該方法的抗體滴度提示感染狀況，與疾病的階段無關(guān)，且抗生素治療后抗體滴度可大幅度下降[7]。在非布魯菌病流行地區(qū)，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）也是常規(guī)檢測手段之一，而且商用試劑盒可靠，結(jié)果與SAT保持高度一致[8]。盡管ELISA費用較高，但耗時短，對于慢性布魯菌病的診斷敏感性更高。其缺點是，類風濕因子存在時易引起假陽性，IgG大量存在時檢測IgM易產(chǎn)生假陰性。有研究進一步表明，血清膜聯(lián)蛋白A2（ANXA2）的ELISA檢測對于布魯菌病椎間盤炎具有提示作用[9]。另外，用ELISA間接測定通過重組外膜結(jié)構(gòu)蛋白Omp28和Omp31作為抗原刺激所產(chǎn)生的抗體，診斷布魯菌病的敏感性與特異性均不亞于SAT方法[10]。最近，血清學檢測與生物傳感器相結(jié)合產(chǎn)生了一個新型快速檢測方法—電化學微磁珠生物傳感器法(EMBIA)。該方法將布魯菌抗原與微磁珠結(jié)合，再與含有布魯菌抗體的血清孵育，通過8通道電極讀取電化學信號的改變并轉(zhuǎn)換到電子設(shè)備上。該方法可原位檢測，快速、敏感性特異性均較高[11]。

3 布魯菌病的分子診斷

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）可用來檢測培養(yǎng)標本和血清、全血、尿液、腦脊液、漿膜腔液體等臨床樣本中的布魯菌的DNA。由于樣本中菌量較少以及基質(zhì)成分中含有抑制物，直接測定樣本中的DNA難度極高。因此，準備樣品過程中應(yīng)該盡量除去抑制物，同時富集DNA模板的濃度。PCR檢測的優(yōu)勢很多，它不依賴于疾病的階段，敏感性遠遠高于血培養(yǎng)，比血清學檢測更特異。布魯菌DNA檢測陽性可見于布魯菌病的急性感染期、慢性感染期以及既往有過布魯菌病感染的無癥狀人群。經(jīng)過抗生素成功治療的患者，在治療期間、隨訪期間甚至在治愈后的數(shù)年，其布魯菌DNA的檢測均可以出現(xiàn)陽性結(jié)果[12]。這個現(xiàn)象說明布魯菌可以在人體巨噬細胞內(nèi)存活并長期存在，也說明PCR的敏感性極高。而且實時定量（real time）PCR還可用來區(qū)分急、慢性感染[13]。3.1 經(jīng)典PCR 經(jīng)典PCR方法診斷布魯菌病，需要一對引物，用來擴增布魯菌靶點基因組序列。引物可以基于表達16S核糖體RNA、外膜結(jié)構(gòu)蛋白（omp2a, omp2b）、牛布魯菌31kDa免疫原性蛋白（BCSP31）的序列，也可以是16S核糖體DNA與23S核糖體DNA之間的中間序列以及插入序列（IS711）[14]。經(jīng)典PCR方法簡單高效，不過該方法的效率依賴于引物的特異性。有研究專門針對BCSP31、16S核糖體RNA等設(shè)計不同的引物來探究診斷的敏感性，發(fā)現(xiàn)不同的引物導致診斷的敏感性差別很大[15]。實際上，臨床常將采集的血樣用于經(jīng)典PCR方法檢測布魯菌病。其中有幾方面因素會影響檢測結(jié)果，如高濃度的白細胞DNA和亞鐵血紅素。此外，人體基因組DNA的存在也會干擾外周血PCR檢測布魯菌DNA的敏感性。有學者認為血清樣本優(yōu)于全血樣本，但也有學者傾向于使用血塊黃層及全血。此外，足夠的樣本量和高效的DNA提取方法也是經(jīng)典PCR檢測手段的關(guān)鍵[16]。

3.2 實時定量PCR 與經(jīng)典PCR不同，實時定量PCR是在PCR過程中監(jiān)測擴增而不是在PCR結(jié)束之后。與經(jīng)典PCR方法相比，實時定量PCR可以計數(shù)每個血樣的核酸量，同時還能實現(xiàn)數(shù)據(jù)的自動化。隨著實時定量PCR儀器及試劑價格的下調(diào)，越來越多的患者可以通過此項技術(shù)來測量DNA拷貝數(shù)、mRNA表達水平等。最近，用實時定量PCR方法快速檢測布魯菌并進行分類的方法已被研發(fā)出來。靶標序列包括16S-23S內(nèi)部轉(zhuǎn)錄隔離區(qū)（ITS）和omp25、omp31、BCSP 31、IS711等基因[17]。實時定量PCR更加快速、敏感、特異，重復性高。除此之外，這項檢測方法容易標準化和降低實驗室工作人員感染布魯菌病的風險。有外國學者利用基于LightCycler的實時PCR技術(shù)檢測血清樣本中的布魯菌DNA，發(fā)現(xiàn)敏感性為91.9%，而特異性高達95.4%。還有學者比較TaqMan實時PCR與傳統(tǒng)方法檢測布魯菌病患者處于不同階段時的血清樣本，敏感性為88%，特異性為100%，陽性預(yù)測值100%，陰性預(yù)測值83%。研究人員探索多項檢測方法組合對布魯菌的診斷效力，認為即便在凝集試驗是陰性的情況下，實時定量PCR、ELISA以及培養(yǎng)都可能提示有價值的信息[17]。通過設(shè)計一組引物，實時定量PCR還能用于分辨布魯菌的不同品種，還可能據(jù)此檢測到新的品種。當然，就像經(jīng)典PCR一樣，實時定量PCR的效率也取決于引物的特異性。到目前為止，針對16S-23S內(nèi)部轉(zhuǎn)錄隔離區(qū)（ITS）以及IS711設(shè)計的引物最敏感、特異、高效。不過也有影響實時定量PCR檢測方法的因素，比如從血清樣本提取模板DNA時可能帶有的免疫球蛋白G，會影響實時定量PCR的擴增環(huán)節(jié)[18]。

3.3 多重PCR(multiplex PCR) 多重PCR是指基于PCR技術(shù)同時擴增幾段不同的DNA序列，即在同一個反應(yīng)體系中進行多個獨立的PCR。該技術(shù)的實現(xiàn)依賴于多對引物和溫度調(diào)節(jié)的DNA聚合酶。引物的設(shè)計需要滿足所有的引物在同一個退火溫度下都能夠工作。對于多重PCR而言，隨著反應(yīng)體系中引物的增多，引物二聚體形成的風險也相應(yīng)提高。因此引物設(shè)計優(yōu)化時還需考慮到非特異性PCR產(chǎn)物的問題。由于多重PCR能夠同時擴增幾段序列，一次多重PCR檢測能夠獲得的信息是經(jīng)典PCR的幾倍，同時還能減少試劑的使用和縮短檢測時間。目前，多重PCR可以一次性檢測多種病原體。早在2003年，就有研究人員采用多重PCR的方法診斷布魯菌病。多重PCR方法除了可以診斷布魯菌病，還能幫助分型。在2007年，Imaoka等[19]通過設(shè)計4對引物（bcsp31、 omp2b、omp2a、omp31）在同一個反應(yīng)體系中發(fā)現(xiàn)了布魯菌的4種主要類型。多重PCR檢測布魯菌耗時在1.5 h左右，結(jié)果回報及時、精確，有利于追蹤感染源以及快速診斷。近年來，有研究人員利用多重PCR技術(shù)來同時檢測布魯菌（IS711、bcsp31、omp2a基因）與結(jié)核分枝桿菌（IS6110、senX3-regX3、cfp31基因）。結(jié)果表明該技術(shù)切實可行，能夠為肺外結(jié)核與復雜布魯菌病的鑒別診斷提供重要依據(jù)[20]。

3.4 巢式與半巢式PCR 巢式PCR是對經(jīng)典PCR技術(shù)的一種改良，其目的是減少非特異性片段的擴增。經(jīng)典PCR要求引物從目標序列的兩端進行擴增，然而引物有可能與其他位點結(jié)合從而擴增出非特異性目標產(chǎn)物。巢式PCR需要兩對引物。目標DNA序列在第一對引物的參與下進行第一輪聚合酶鏈式反應(yīng)。在引物可能隨機結(jié)合到非目標序列的情況下會產(chǎn)生一系列擴增產(chǎn)物，其中只有一個產(chǎn)物包含了終極目標序列。在第2對引物的選擇下，只有真正含有終極目標序列的首輪擴增產(chǎn)物才能進入第二輪擴增，從而保證了最后的擴增產(chǎn)物的純度。與巢式PCR類似，半巢式PCR也有兩對引物，然而第2對引物中的一個引物與第1對引物中的一個引物非常相似。因此，巢式PCR與半巢式PCR都比經(jīng)典PCR特異。最近，巢式與半巢式PCR也被用來檢測血樣中的布魯菌。針對IS711、IS6501、bcsp31、VirB11基因的巢式與半巢式PCR技術(shù)檢測布魯菌已有文獻報道[21]。不過，巢式與半巢式PCR也有缺點，比如引物二聚體可能增多，另外，這兩種方法只能檢測出一組布魯菌而無法具體分型。

3.5 兩階段PCR 兩階段PCR是經(jīng)典PCR與多重PCR的結(jié)合。2013年Kamal等[22]首先針對bcsp31基因的223個堿基對序列進行擴增，該序列在各種致病型布魯菌中高度保守；針對致病型布魯菌的IS711序列設(shè)計不同的引物，確保每種類型布魯菌擴增出來的DNA產(chǎn)物長度不一從而用于區(qū)分布魯菌的類型；然后將第一階段的擴增產(chǎn)物與多對引物進行多重PCR，此即第二階段PCR。該方法對于疫區(qū)的布魯菌病診斷及致病菌的分布有著很高的價值。

3.6 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP） LAMP是一項十分精簡的PCR技術(shù)，其所有擴增及檢測都在等溫條件下一步完成。因此該項技術(shù)對設(shè)備的要求不高，適合于發(fā)展中國家實驗室使用。LAMP方法能夠在等溫條件下完成有賴于源自枯草芽孢桿菌的DNA聚合酶活性。當PCR反應(yīng)體系中存在4種靶向特異的引物時，該酶能夠催化在單一溫度條件下大量擴增模板DNA序列的一個特異性片段。反應(yīng)產(chǎn)物的量遠大于同等條件下的經(jīng)典PCR。如此高效的擴增使得反應(yīng)產(chǎn)物可以采用比色法來直接檢查分析[23]。有文獻報道，針對bcsp31設(shè)計引物采用LAMP檢測布魯菌，其敏感性與經(jīng)典PCR類似，耗時2～3 h，由于所有反應(yīng)均在同一溫度下完成，因此實驗室配備的水浴鍋即可替代經(jīng)典PCR儀進而節(jié)約成本[24]。

現(xiàn)階段，PCR檢測布魯菌可以作為其他臨床檢測的重要補充，而且還有報道指出PCR快速檢測布魯菌DNA有助于布魯菌病處于窗口期時期（從臨床起病到血清學轉(zhuǎn)陽之間的時期）的診斷，窗口期時DNA陽性而凝集試驗陰性的患者在3個月后復查80%的患者凝集實驗轉(zhuǎn)為陽性[25]。不過PCR技術(shù)成本依然較高，同時質(zhì)控難以標準化，因此PCR技術(shù)仍需不斷優(yōu)化、服務(wù)臨床。如前所述，PCR檢測到的DNA可來源于急性感染期，也可來源于吞噬細胞中的布魯菌，甚至可來源于已經(jīng)死亡的細胞，因此臨床上PCR結(jié)果的判讀需要結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)以及其他實驗室診斷結(jié)果。

4 總結(jié)與展望

布魯菌病的許多方面諸如臨床表現(xiàn)、流行病學特點、致病機制、診斷技術(shù)、治療方式等多年以來已取得了較大進展。實驗室檢測技術(shù)方面，細菌的分離培養(yǎng)、血清學試驗、DNA檢測已成為三大支柱。今后亟待解決的問題是：①研發(fā)特異的血清學診斷標記物和預(yù)后標記物；②研究布魯菌病不同疾病進程（急性、慢性、復發(fā)、治愈）的抗原表達成分從而提示疾病的進程；③研發(fā)標準化的PCR相關(guān)的分子檢測流程及設(shè)計標準化的核酸探針。

［1］Pappas G, Papadimitriou P, Akritidis N, Christou L, Tsianos EV. The new global map of human brucellosis[J]. Lancet Infect dis，2006， 6(2): 91-99 .DOI: 10.1016/s1473-3099(06)70382-6.

［2］Al Dahouk S, Tomaso H, Nockler K, Neubauer H, Frangoulidis D. Laboratory-based diagnosis of brucellosis--a review of the literature. (Part I): techniques for direct detection and identification of Brucella spp[J]. Clin Lab, 2003, 49(9-10): 487-505.

［3］De Miguel MJ, Marin CM, Munoz PM, Dieste L, Grillo MJ, Blasco JM. Development of a selective culture medium for primary isolation of the main Brucella species[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(4): 1458-1463. DOI: 10.1128/jcm.02301-10.

［4］Rovery C, Rolain JM, Raoult D, Brouqui P. Shell vial culture as a tool for isolation of Brucella melitensis in chronic hepatic abscess[J]. J Clin Microbiol,2003, 41(9): 4460-4461.

［5］Al Dahouk S, Scholz HC, Tomaso H, Bahn P, Gollner C, Karges W, Appel B, Hensel A, Neubauer H, Nockler K. Differential phenotyping of Brucella species using a newly developed semiautomated metabolic system[J]. BMC Microbiol, 2010, 10: 269. DOI: 10.1186/1471-2180-10-269.

［6］Lista F, Reubsaet FA, De Santis R, Parchen RR, de Jong AL, Kieboom J, van der Laaken AL, Voskamp-Visser IA, Fillo S, Jansen HJ, Van der Plas J, Paauw A. Reliable identification at the species level of Brucella isolates with MALDI-TOF-MS[J]. BMC Microbiol, 2011, 11: 267.DOI: 10.1186/1471-2180-11-267.

［7］Mantur BG, Amarnath SK, Parande AM, Patil GA, Walvekar RR, Desai AS, Parande MV, Shinde RS, Chandrashekar MR, Patil SD, Shivaram C, Salagare RC. Comparison of a novel immunocapture assay with standard serological methods in the diagnosis of brucellosis[J]. Clin Lab,2011, 57(5-6): 333-341.

［8］Prince HE, Lopez J, Yeh C, Tablante J, Morgan J, Kaneko B, Duffey P. Performance characteristics of the Euroimmun enzymelinked immunosorbent assay kits for Brucella IgG and IgM[J]. Diagnostic Microbiol Infect Dis,2009, 65(2): 99-102.DOI: 10.1016/j.diagmicrobio.2009.06.002.

［9］Aktug Demir N, Kolgelier S, Sumer S, Inkaya AC, Ozcimen S, Demir LS, Ural O, Arpaci A. Serum annexin A2 levels in acute brucellosis and brucellar spondylodiscitis[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2014, 33(10): 1855-1859. DOI: 10.1007/s10096-014-2155-2.

［10］Tiwari S, Kumar A, Thavaselvam D, Mangalgi S, Rathod V, Prakash A, Barua A, Arora S, Sathyaseelan K. Development and comparative evaluation of a plate enzyme-linked immunosorbent assay based on recombinant outer membrane antigens Omp28 and Omp31 for diagnosis of human brucellosis[J]. Clin Vaccine Immunol: CVI,2013, 20(8): 1217-1222. DOI: 10.1128/ cvi.00111-13.

［11］Cortina ME, Melli LJ, Roberti M, Mass M, Longinotti G, Tropea S, Lloret P, Serantes DA, Salomon F, Lloret M, CaillavaAJ, Restuccia S, Altcheh J, Buscaglia CA, Malatto L, Ugalde JE, Fraigi L, Moina C, Ybarra G, Ciocchini AE, Comerci DJ. Electrochemical magnetic microbeads-based biosensor for point-of-care serodiagnosis of infectious diseases[J]. Biosens Bioelectr,2016, 80: 24-33. DOI: 10.1016/j.bios.2016.01.021.

［12］Vrioni G, Pappas G, Priavali E, Gartzonika C, Levidiotou S. An eternal microbe: Brucella DNA load persists for years after clinical cure[J]. Clin Infect Dis,2008, 46(12): e131-136. DOI: 10.1086/588482.

［13］Queipo-Ortuno MI, Colmenero JD, Bravo MJ, Garcia-Ordonez MA, Morata P. Usefulness of a quantitative real-time PCR assay using serum samples to discriminate between inactive, serologically positive and active human brucellosis[J]. Clin Microbiol Infect,2008, 14(12): 1128-1134. DOI: 10.1111/ j.1469-0691.2008.02095.x.

［14］Wang Y, Wang Z, Zhang Y, Bai L, Zhao Y, Liu C, Ma A, Yu H. Polymerase chain reaction-based assays for the diagnosis of human brucellosis[J]. An Clin Microbiol Antimicrob,2014, 13: 31.DOI: 10.1186/s12941-014-0031-7.

［15］Baddour MM, Alkhalifa DH. Evaluation of three polymerase chain reaction techniques for detection of Brucella DNA in peripheral human blood[J]. Can J Microbiol, 2008, 54(5): 352-357. DOI: 10.1139/w08-017.

［16］Gemechu MY, Gill JP, Arora AK, Ghatak S, Singh DK. Polymerase chain reaction (PCR) assay for rapid diagnosis and its role in prevention of human brucellosis in Punjab, India[J]. Intern J Preventive Med,2011, 2(3): 170-177.

［17］Zhang B, Wear DJ, Stojadinovic A, Izadjoo M. Sequential realtime PCR assays applied to identification of genomic signatures in formalin-fixed paraffin-embedded tissues: a case report about brucella-induced osteomyelitis[J]. Military Med,2013, 178(1): 88-94.

［18］Queipo-Ortuno MI, De Dios Colmenero J, Macias M, Bravo MJ, Morata P. Preparation of bacterial DNA template by boiling and effect of immunoglobulin G as an inhibitor in real-time PCR for serum samples from patients with brucellosis[J]. Clin Vaccine Immunol: CVI,2008, 15(2): 293-296. DOI: 10.1128/cvi.00270-07.

［19］Imaoka K, Kimura M, Suzuki M, Kamiyama T, Yamada A. Simultaneous detection of the genus Brucella by combinatorial PCR[J]. Jap J Infect Dis,2007, 60(2-3): 137-139.

［20］Sanjuan-Jimenez R, Colmenero JD, Bermudez P, Alonso A, Morata P. Amplicon DNA melting analysis for the simultaneous detection of Brucella spp and Mycobacterium tuberculosis complex. Potential use in rapid differential diagnosis between extrapulmonary tuberculosis and focal complications of brucellosis[J]. PloS one,2013, 8(3): e58353. DOI: 10.1371/ journal.pone.0058353.

［21］Lin GZ, Zheng FY, Zhou JZ, Gong XW, Wang GH, Cao XA, Qiu CQ. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the omp25 gene for rapid detection of Brucella spp[J]. Molecular Cellular Probes,2011, 25(2-3): 126-129. DOI: 10.1016/j.mcp.2011.01.001.

［22］Kamal IH, Al Gashgari B, Moselhy SS, Kumosani TA, Abulnaja KO. Two-stage PCR assay for detection of human brucellosis in endemic areas[J]. BMC Infect Dis, 2013, 13: 145. DOI: 10.1186/1471-2334-13-145.

［23］Goto M, Honda E, Ogura A, Nomoto A, Hanaki K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue[J]. Bio Techniques,2009, 46(3): 167-172. DOI: 10.2144/000113072.

［24］Trangoni MD, Gioffré AK, Cerón Cucchi ME, Caimi KC, Ruybal P, Zumárraga MJ, Cravero SL. LAMP technology: Rapid identification of Brucella and Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis[J]. Brazil J Microbiol, 2015, 46(2): 619-626. DOI: 10.1590/S1517-838246220131206.

［25］Chen Z, Wang Y, Wang Z, Ke Y, Zhen Q, Yuan X, Zhang W, Lu Y, Yu Y, Song H, Huang L. Improvement and advancement of early diagnosis of human brucellosis in window period[J]. Clin Infect Dis, 2013, 57(2): 322-323. DOI: 10.1093/cid/cit198.

2016-04-18)

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 03. 021

廣東省醫(yī)學科學技術(shù)研究基金項目（B2016101）

楊智聰（E-mail:gdgzcdc@21cn.com）