DNA羥甲基化在惡性黑素瘤的進(jìn)展

王丹 楊盛波 黃進(jìn)華

DNA羥甲基化在惡性黑素瘤的進(jìn)展

王丹 楊盛波 黃進(jìn)華

DNA羥甲基化指在TET蛋白酶家族催化下，將5甲基胞嘧啶氧化成5羥甲基胞嘧啶的過程，是DNA主動(dòng)去甲基化的關(guān)鍵中間步驟，主要通過動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)DNA甲基化水平，影響基因表達(dá)。DNA羥甲基化過程可被TET蛋白、三羧酸循環(huán)相關(guān)酶、維生素C、微小RNA等多種因素調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，和血液系統(tǒng)惡性腫瘤及多種實(shí)體腫瘤類似，惡性黑素瘤中同樣存在5羥甲基胞嘧啶含量降低，DNA羥甲基化調(diào)控因素異常等現(xiàn)象，提示DNA羥甲基化可能與惡性黑素瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后等相關(guān)。

黑色素瘤；5-甲基胞嘧啶；DNA甲基化；異檸檬酸脫氫酶；DNA羥甲基化

表觀遺傳學(xué)最令人矚目的研究進(jìn)展之一，是發(fā)現(xiàn)TET（ten-eleven translocation）蛋白可將5甲基胞嘧啶（5mC）氧化成為5羥甲基胞嘧啶（5hmC），該過程即為DNA羥甲基化，可通過動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)DNA甲基化水平，影響基因表達(dá)，參與機(jī)體生長發(fā)育、自身免疫性疾病及多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程。

1 DNA羥甲基化及其調(diào)控

1.1 DNA羥甲基化與DNA主動(dòng)去甲基化：相對(duì)于DNA甲基化過程而言，目前對(duì)DNA去甲基化機(jī)制仍知之甚少?，F(xiàn)已知DNA去甲基化方式分為被動(dòng)去甲基化和主動(dòng)去甲基化。被動(dòng)去甲基化過程是指在細(xì)胞分裂過程中，因DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）1活性降低或識(shí)別能力有限等原因，導(dǎo)致新分裂生成的細(xì)胞無法維持原有的甲基化狀態(tài)，而導(dǎo)致DNA甲基化程度降低的過程。DNA主動(dòng)去甲基化過程不依賴于DNA的復(fù)制，在酶的催化作用下，以5mC為起始，逐步轉(zhuǎn)化為未甲基化的胞嘧啶（C）。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物中TET蛋白家族在鐵離子（Fe2+）及α酮戊二酸（α-KG）存在的條件下，可將5mC氧化為5hmC，實(shí)現(xiàn)DNA羥甲基化。目前認(rèn)為，以DNA羥甲基化為起始的DNA主動(dòng)去甲基化，可通過以下兩種機(jī)制實(shí)現(xiàn)：①氧化去甲基化途徑：5hmC可繼續(xù)在TET酶作用下，逐步氧化成5氟胞嘧啶（5fC）和5胞嘧啶羧基（5caC），生成的5fC和5caC均可被胸腺嘧啶DNA糖苷酶識(shí)別，并進(jìn)一步激活堿基切除修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)C的生成［1］；②脫氨基去甲基化途徑：5hmC可以在活化誘導(dǎo)性胞嘧啶脫氨酶/載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽樣蛋白的脫氨基作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?羥甲基尿嘧啶（5hmU），5hmU可在胸腺嘧啶DNA糖苷酶啟動(dòng)的堿基切除修復(fù)機(jī)制下轉(zhuǎn)變?yōu)?胞嘧啶。DNA羥甲基化在機(jī)體中發(fā)揮作用可能主要通過參與DNA主動(dòng)去甲基化，從而動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)5mC水平，最終影響基因表達(dá)。一般認(rèn)為，基因調(diào)控序列（尤其是啟動(dòng)子區(qū)域）的甲基化可抑制基因轉(zhuǎn)錄，反之去甲基化則激活基因轉(zhuǎn)錄。其次，DNA羥甲基化可能直接通過5hmC來發(fā)揮生物學(xué)作用。5hmC被喻為繼5mC之后、基因組中的“第六類堿基”，是另外一種重要的DNA堿基修飾形式，5hmC可能通過取代5mC而解除后者所行使的生物學(xué)功能，或自身招募其他效應(yīng)蛋白來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。

作者單位：410013 長沙，中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院皮膚科

1.2 DNA羥甲基化的調(diào)控：DNA羥甲基化過程存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，目前認(rèn)為該過程主要可被TET蛋白、異檸檬酸脫氫酶（IDH）、維生素C、miRNA等多種因素調(diào)控。TET蛋白在DNA羥甲基化過程中起關(guān)鍵作用。TET蛋白本質(zhì)上是一種加氧酶，該家族主要包括3個(gè)成員：TET1-3，相對(duì)應(yīng)的編碼基因分別位于10q21、4q24、2p13，彼此在羧基末端催化結(jié)構(gòu)域享有高度同源性，均可催化5mC進(jìn)行氧合修飾合成5hmC［2］。TET1和TET3蛋白中均含有一段保守的CXXC（Cys-Xaa-Xaa-Cys）氨基酸序列，該區(qū)域?qū)γ芗姆羌谆疌pG雙核苷酸有著很強(qiáng)的親和力，可能是其與DNA結(jié)合的關(guān)鍵部位。由于在進(jìn)化過程中染色體發(fā)生倒置，TET2的CXXC保守序列位于基因的上游，已演變成為功能較獨(dú)立的基因，稱之為CXXC4/5，能結(jié)合未甲基化的CpG二核苷酸，可直接與TET2的催化域相互作用［3］。研究表明，CXXC4/5可下調(diào)TET2蛋白的表達(dá)，并呈劑量依賴性，從而減少 5hmC 的生成［4］。

IDH主要包括IDH1、IDH2兩個(gè)成員，可催化異檸檬酸脫氫生成TET酶的關(guān)鍵輔因子α-KG。惡性腫瘤中IDH突變不僅使TET酶所需輔因子α-KG減少，而且可增加α-KG的同分異構(gòu)體2-羥基戊二酸的合成［5］。2-羥基戊二酸可競爭性抑制α-KG與靶蛋白的結(jié)合，從而干擾依賴α-KG因子的多種酶的活性，包括TET酶及組蛋白去甲基化酶等［6］。最新研究發(fā)現(xiàn)，三羧酸循環(huán)中另外兩種重要的酶琥珀酸脫氫酶和延胡索酸酯酶的突變可通過類似機(jī)制干擾TET酶的活性，且通常高甲基化基因更容易被影響［7-8］。此外，近年研究發(fā)現(xiàn)，生理水平的維生素C極有可能作為TET蛋白活化的輔因子，促進(jìn)5mC轉(zhuǎn)化為 5hmC［9］。同樣，miR-125b、miR-29b、miR-29c、miR-101和miR-7等多種miRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平，通過靶向干擾TET mRNA的表達(dá)來參與調(diào)節(jié)DNA 羥甲基化過程［10］。

2 DNA羥甲基化與皮膚惡性黑素瘤

惡性黑素瘤是一種起源于黑素細(xì)胞的腫瘤，惡性程度高，易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，在所有皮膚腫瘤中致死率最高。近年研究發(fā)現(xiàn)，惡性黑素瘤中存在5hmC含量降低，以及TET蛋白表達(dá)降低、IDH突變、維生素C轉(zhuǎn)運(yùn)異常等導(dǎo)致DNA羥甲基化異常的因素，提示DNA羥甲基化可能與惡性黑素瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。

2.1 5-hmC與惡性黑素瘤：近年，多位學(xué)者運(yùn)用免疫組化、免疫熒光等方法比較不同病理分期的惡性黑素瘤及良性痣組織切片中5hmC含量，發(fā)現(xiàn)惡性黑素瘤中5hmC總體含量較良性痣顯著降低［11-13］，并且惡性程度越高，5hmC含量越低［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)，5hmC總體含量下降的程度與惡性黑素預(yù)后相關(guān)指標(biāo)Breslow深度、局部皮膚潰瘍以及總體生存率等均有明顯的正相關(guān)性［11］。淋巴結(jié)內(nèi)良性痣細(xì)胞與惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移淋巴組織病理表現(xiàn)高度相似，常規(guī)HE染色切片常難以鑒別。Lee等［14］應(yīng)用5hmC特異性免疫組化及免疫熒光比較兩者間5hmC含量，發(fā)現(xiàn)惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織切片中5hmC水平均明顯下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，肢端型、黏膜型等常見的黑素瘤疾病亞型中，5hmC含量較Spitz痣等良性痣明顯降低。以上研究提示，臨床上對(duì)皮膚惡性黑素瘤組織切片5hmC含量的測(cè)定，可有效地指導(dǎo)早期診斷及預(yù)后評(píng)估。此外，Uchiyama等［13］還發(fā)現(xiàn)，惡性黑素瘤組織無論是否取自光暴露部位，5hmC均表現(xiàn)出相似的低水平，提示5hmC低含量與常見的環(huán)境危險(xiǎn)因素紫外線可能無明顯關(guān)聯(lián)。

Lian等［11］用DNA羥甲基化免疫共沉淀-芯片檢測(cè)全基因組DNA羥甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在惡性黑素瘤全基因組中，無論啟動(dòng)子、外顯子、內(nèi)含子還是基因間結(jié)構(gòu)中均可見到5hmC含量較低。KEGG pathway數(shù)據(jù)庫分析顯示，羥甲基化差異基因多涉及細(xì)胞間粘著連接、Wnt信號(hào)通路、腫瘤相關(guān)信號(hào)通路、黑素合成等信號(hào)通路。Gene Ontology數(shù)據(jù)庫顯示，羥甲基化異常改變的基因多與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝、發(fā)育等內(nèi)容相關(guān)。

2.2 TET與惡性黑素瘤：TET2在多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤中存在突變，部分TET2突變導(dǎo)致該酶表達(dá)下調(diào)或失活［15］。Lian 等［11］用反轉(zhuǎn)錄 PCR 研究發(fā)現(xiàn)，在惡性黑素瘤中TET1、2、3表達(dá)均明顯下調(diào)，且TET2下降最明顯。Gambichler等［12］用免疫組化方法研究發(fā)現(xiàn)，TET2的表達(dá)量在不同病理分期惡性黑素瘤中均顯著降低，且腫瘤惡性程度越高，TET2表達(dá)水平越低，同時(shí)5hmC含量越低。提高體外惡性黑素瘤細(xì)胞A2058中TET2表達(dá)可有效地提高其全基因組5hmC含量，分析發(fā)現(xiàn)，5hmC含量顯著改善的基因多與細(xì)胞間信息傳遞、基因表達(dá)調(diào)控等相關(guān)，用TET2過表達(dá)的A2058細(xì)胞構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)TET2過表達(dá)可明顯抑制移植瘤體的生長［11］。Song等［16］復(fù)制了與惡性黑素瘤危險(xiǎn)度相關(guān)的13個(gè)基因位點(diǎn)，單核苷酸多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，其中名為rs4698934的核苷酸，位于TET2內(nèi)含子的第106139387個(gè)位點(diǎn)上，部分患者該位點(diǎn)發(fā)生突變，因此，TET2該位點(diǎn)的突變可能與惡性黑素瘤發(fā)生相關(guān)。

2.3 IDH與惡性黑素瘤：IDH1/2已被證明在多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤及實(shí)體腫瘤中存在突變，且常伴有 2-HG 表達(dá)的異常上調(diào)［15］。Shibata 等［17］發(fā)現(xiàn)，惡性黑素瘤中IDH1/2突變率可高達(dá)10%，且常伴有原癌基因BRAF和KIT基因的突變。研究發(fā)現(xiàn)，惡性黑素瘤中IDH2蛋白的表達(dá)也顯著下調(diào)，但I(xiàn)DH1蛋白的表達(dá)變化并不明顯［11-12］。在斑馬魚黑素瘤模型中，提高IDH2的表達(dá)，不僅可逆轉(zhuǎn)5-hmC的低表達(dá)，而且能有效延長其無瘤生存期［11］。提示IDH基因突變等其他因素可能導(dǎo)致IDH蛋白的表達(dá)下調(diào)或者功能異常，參與惡性黑素瘤的發(fā)生。

近年來體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)的多種IDH1和IDH2特異性抑制劑，均可有效地減少2-HG的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)細(xì)胞正常分化，逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性傾向［15］。為研發(fā)特異性改善異常DNA羥甲基化的藥物提供更多可能性，不僅給惡性黑素瘤，更為各種惡性腫瘤的靶向治療帶來了希望。

2.4 維生素C與惡性黑素瘤：體外培養(yǎng)惡性黑素瘤細(xì)胞中鈉依賴性維生素C轉(zhuǎn)運(yùn)受體表達(dá)顯著下調(diào)，補(bǔ)充生理劑量維生素C可提高惡性黑素瘤細(xì)胞中5hmC的含量，并有效抑制其惡性轉(zhuǎn)化［9］。

3 結(jié)語

雖然惡性黑素瘤中，全基因組5-hmC缺少已經(jīng)比較明確，但具體基因如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因、凋亡相關(guān)基因等特異性DNA羥甲基化異常尚待進(jìn)一步研究。多種逆轉(zhuǎn)DNA羥甲基化異常的特異性抑制劑及補(bǔ)充維生素C等手段，目前僅被證明在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮作用。開展更多更深入的研究認(rèn)識(shí)DNA羥甲基化在惡性黑素瘤中的作用及具體機(jī)制，將有助于惡性黑素瘤的診斷與治療。

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DNA hydroxymethylation in malignant melanoma

Wang Dan,Yang Shengbo,Huang Jinhua.Department of Dermatology,Third Xiangya Hospital,Central South University,Changsha 410013,China

DNA hydroxymethylation refersto a chemicalmodification processin which 5-methylcytosine （5mC） is converted to 5-hydroxymethylcytosine （5hmC） by the ten-eleven translocation （TET）protein family.This conversion is an important intermediate step in active DNA demethylation,which can influence gene expressions by dynamically regulating DNA methylation levels.DNA hydroxymethylation can be modulated by TET proteins,the Krebs cycle-related enzymes,vitamin C,miRNAs,etc.Like patients with hematological malignancies or other solid cancers,those with cutaneous malignant melanoma have been reported to have decreased 5-hydroxymethylcytosine levels and abnormal DNA hydroxymethylation,hinting that DNA hydroxymethylation is related to the occurrence,development and prognosis of cutaneous malignant melanoma.

Melanoma;5-Methylcytosine;DNA methylation;Isocitratedehydrogenase;DNA hydroxymethylation

Jinhua Huang,Email:huangjinhua60@126.com

2015-04-27）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.02.018

黃進(jìn)華，Email:huangjinhua60@126.com

本文主要縮寫：5mC：5甲基胞嘧啶，5hmC：5羥甲基胞嘧啶，DNMT：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，α-KG：α酮戊二酸，5fC：5氟胞嘧啶，5caC：5胞嘧啶羧基，5hmU：5羥甲基尿嘧啶，IDH：異檸檬酸脫氫酶