響應面法優(yōu)化沙棗葉黃酮提取工藝研究

王志杰　劉偉　崔燕　王翔飛

【摘要】目的：利用響應面法優(yōu)化沙棗葉黃酮的提取工藝。方法：在單因素試驗基礎上，選擇料液比、提取時間、提取溫度及提取pH值為考查因素，采用響應曲面法優(yōu)化提取工藝條件。結果：最優(yōu)提取工藝：料液比1∶16、提取時間8h、提取溫度60℃、提取pH值為8。結論：采用該提取工藝所得總黃酮提取率為6.49%，與響應曲面擬合所得方程預測值6.52%符合良好。

【關鍵詞】沙棗葉；黃酮；工藝優(yōu)化；響應面法

【中圖分類號】R284.2 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）01-0009-03

沙棗（Elaeagnu sangustifolia L.）又名香柳、桂香柳、銀柳、七里香等，屬胡禿子科落葉小喬木或灌木，我國主要分布于西北各省[1]。新疆沙棗資源蘊藏量大，生長快，易繁殖，藥用價值高，且各地均有分布[2]。沙棗葉干燥后搓碎加水服用，對肺炎有很好的療效；沙棗葉含有的苷類、生物堿、咖啡酸、綠原酸、黃酮類等物質，具有抗心律失常[3]、降低血清膽固醇、抑制血小板聚集、抗病毒、增強免疫力等作用[4]。前期研究發(fā)現，沙棗葉水提取物可降低小鼠肝組織自發(fā)性MDA的生成，減輕CCl4、H2O2、Fe2+-VitC誘導的肝臟脂質過氧化反應，具有良好的抗脂質過氧化作用[5]。

黃酮是一類在植物界中分布廣泛、具有多種生物活性的多酚類化合物。沙棗作為一種自由基清除劑，是理想的天然抗氧化劑之一，李紅等[5]報道了沙棗黃酮提取液對多種自由基均具有較強的清除能力。本文以沙棗葉中總黃酮為研究對象，以水作為提取溶劑，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法分析優(yōu)化沙棗葉黃酮提取工藝條件。

1 儀器與材料

1.1 儀器 722N 可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；恒溫水浴鍋。

1.2 材料 蘆丁對照品（批號：100080-200707，中國藥品生物制品檢定所）；沙棗（采自新疆石河子市）由新疆石河子大學藥學院譚勇教授鑒定為Elaeagnu sangustifolia L.；所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 蘆丁標準工作曲線的建立 以蘆丁為標準品的分光光度法測定沙棗中黃酮類化合物[5-9]。精密稱取經120℃干燥至恒重的蘆丁對照品10.0mg，置于10mL容量瓶，加70%乙醇適量，使充分溶解，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，所得溶液含蘆丁對照品1mg/ml。準確吸取1.0mg/ml蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0ml，分別置于25ml的容量瓶中，依次加入5% NaNO2溶液0.3ml，搖勻，放置6min，再加入10% Al（NO3）3溶液0.3ml，搖勻，放置6min，加入4%NaOH溶液4.0ml，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min，在510nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，對照品溶液的濃度（mg/ml）為橫坐標，分析得出線性回歸方程為Y=0.0948x-0.0523，r=0.9991，線性關系良好。

2.2 總黃酮含量的測定 吸取待測提取液5ml置于25ml容量瓶，參照上述方法測吸光度，根據蘆丁標準溶液濃度（C）與吸光度（A）的回歸方程，計算蘆丁的含量?？傸S酮的提取率公式：總黃酮提取率（%）=（提取液濃度×體積×稀釋倍數/原料質量）×100%。

2.3 提取工藝優(yōu)化試驗 設置不同的液料比、提取時間、提取溫度、pH值，觀察不同單因素對提取率的影響。在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以A（料液比）、B（提取時間）、C（提取溫度）和D（pH值）為自變量，以總黃酮得率（%）為響應值，設計四因素三水平的響應面分析試驗。試驗數據使用Design-Expert8.0軟件進行分析，并得到響應面分析圖和方差分析表。試驗因素及水平見表1。

3 結果與分析

3.1 提取條件對總黃酮提取效果的影響

3.1.1 液料比對提取效果的影響 分別稱取1g干燥的沙棗葉粉末4份，分別置于100ml三角燒瓶中，在提取溶液為蒸餾水，提取時間為4h、溫度為室溫、提取2次的條件下，分別加10、15、20、25倍水量提取總黃酮，按照制作標準曲線的方法考察液料比對沙棗葉黃酮提取效果的影響。沙棗葉黃酮的得率分別為0.12%、0.39%、0.38%、0.36%，因選料液比為1∶15。

3.1.2 提取時間對提取效果的影響 分別稱取1g干燥的沙棗葉粉4份，分別置于100ml三角燒瓶中，在提取溶液為蒸餾水、料液比為1∶15、溫度為室溫、提取2次、提取時間為4、6、8、10h的條件下，按照制作標準曲線的方法考察提取時間對沙棗葉黃酮提取效果的影響。比較總黃酮得率分別為2.34%、3.69%、4.01%、3.98%，當提取時間為8h時，提取效果最佳。

3.1.3 提取溫度對提取效果的影響 分別稱取1g干燥的沙棗葉粉4份，分別置于100ml三角燒瓶中，在提取溶液為蒸餾水、料液比為1∶15、提取時間為6h、提取1次的條件下，設置提取溫度為20、40、60、80℃，分別按照制作標準曲線的方法考察提取溫度對沙棗葉黃酮提取效果的影響。經計算各溫度下的提取率分別是3.36%、3.40%、3.82%、3.59%，當提取溫度達到60℃時提取效果最佳。

3.1.4 pH對提取效果的影響 分別稱取1g干燥的沙棗葉粉4份，分別置于100ml三角燒瓶中，在提取溶液為蒸餾水、料液比為1∶15，提取時間為6h、提取溫度為60℃，提取1次的條件下，設置pH值為6、8、10，按照制作標準曲線的方法考察pH對沙棗葉黃酮提取效果的影響。提取率分別為0.27%、0.32%、0.38%、0.37%，從結果可以看出，隨著pH值的增加，對提取效果的影響逐漸增大，當pH超過8，提取效果最優(yōu)。

3.2 沙棗葉黃酮提取工藝響應面法優(yōu)化分析 響應面試驗共有29個試驗點，設計及結果如表2。采用響應面分析法分析試驗結果，得到以總黃酮得率為響應值的回歸方程為：黃酮得率=6.47+0.45A+0.11B+0.044C+0.063D-0.088AB-0.25AC+0.035AD-0.045BC+0.022BD-0.048CD-1.17A2-0.45B2-0.41C2-0.49D2（r=0.9758）。由表3可知，以黃酮得率為響應值時，模型P<0.0001，表明該二次方程模型高度顯著，可用于指導沙棗葉總黃酮提取試驗設計。各因素對黃酮提取量的影響由大到小依次為料液比>提取時間>Ph值>提取溫度，總黃酮提取率的變化有97.58%來源于所選變量的變化。由表3可知，一次項A，交互項AC，二次項A2、B2、C2、D2均具有極顯著差異（P<0.01）；失擬項P>0.05，說明擬合度良好，未知因素對于實驗結果的干擾很小。

響應面分析法的圖形是特定的響應值對應的各因素構成的一個三維空間，直觀地反映出各因素對響應值的影響，從試驗所得的響應面分析圖上可以分析出它們之間的相互作用[10]，各因素間交互作用的響應面圖，見圖2。

由圖2可看出，在料液比較小的情況下，提取時間、提取溫度、pH值的增加，曲面向下彎曲，說明料液比與三者的交互作用抑制了總黃酮的浸出，由等高線可以分析出，料液比在較小的情況下等高線排列緊密，后三者與對于總黃酮的浸出影響較大，隨著這三者的增加，得率呈現上升趨勢，但到達一定程度后又開始下降。同理可分析其他因素見得相互作用。

3.3 驗證試驗 經過Design-Expert 8.0軟件的分析，可以得出沙棗葉總黃酮提取的最佳條件為料液比為1∶15.96，提取時間為8.20h，提取溫度為59.73℃，pH值為8.15，總黃酮的得率為6.51%?？紤]可操作性，將工藝參數修正最佳條件料液比為1∶16，提取時間為8.00h，提取溫度為60℃，pH值為8，按造修正后的工藝參數進行驗證試驗，結果總黃酮的得率為6.49%，與預測值之間的相對偏差為0.46%，因而說明該工藝參數準確可靠。

4 結論

在單因素試驗基礎上，選擇固液比、提取時間、提取溫度及提取pH值為考查因素，采用響應曲面優(yōu)化提取工藝條件，以總黃酮得率為響應值，采用響應面試驗設計方法優(yōu)化沙棗葉黃酮提取工藝。結果表明，采用Box-Behnken法建立沙棗葉總黃酮提取工藝模型得率高，并能很好地預測試驗結果。

參考文獻

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（收稿日期：2015.09.22）