putA與vgb基因?qū)Ψ词?4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量的影響

張勝利， 林 凡， 劉合棟， 張震宇*， 孫付保， 夏紫薇

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

putA與vgb基因?qū)Ψ词?4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量的影響

張勝利1，2，3， 林 凡1，2，3， 劉合棟1，2，3， 張震宇*1，2，3， 孫付保1，2，3， 夏紫薇1

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

反式-4-羥基-L-脯氨酸是在自然界中分布最廣泛的一種羥脯氨酸，在醫(yī)藥、化工、食品和美容業(yè)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。為了在生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的過程中減少菌體對底物脯氨酸的降解，利用Red/ET同源重組系統(tǒng)敲除putA基因，并比較野生型菌株與缺失型菌株在不同培養(yǎng)基中的反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量，再引入vgb基因，考察該基因?qū)Ψ词?4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明：putA基因的缺失能阻止菌體降解脯氨酸；碳源充足的情況下，GC培養(yǎng)基更有利于反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)；putA基因缺失型菌株能將被消耗的脯氨酸全部轉(zhuǎn)化為反式-4-羥基-L-脯氨酸；vgb基因的存在能顯著提高反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量。

反式-4-羥基-L-脯氨酸；大腸桿菌；生物轉(zhuǎn)化；基因敲除；透明顫菌血紅蛋白

羥基-L-脯氨酸， 也叫羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp），是亞氨基酸L-脯氨酸羥基化后的產(chǎn)物。根據(jù)羥脯氨酸羥基所在位置不同，可形成4種立體異構(gòu)體，分別是反式-4-羥基-L-脯氨酸、順式-4-羥基-L-脯氨酸、反式-3-羥基-L-脯氨酸和順式-3-羥基-L-脯氨酸。其中反式-4-羥基-L-脯氨酸（trans-4-hydroxy-L-proline，4-THOP）在自然界最為常見，在許多領(lǐng)域已發(fā)現(xiàn)其重要用途。在醫(yī)藥方面，4-THOP已大量應(yīng)用于碳青霉烯類抗生素、消炎藥等醫(yī)藥的合成[1]；在化工合成方面，4-THOP是合成多種化合物的必不可少的手性原料[2][3]；在家禽養(yǎng)殖中添加4-THOP，可防止因甘氨酸合成不足而造成的營養(yǎng)不良[4]；同時，4-THOP在新生兒食品營養(yǎng)方面可作為營養(yǎng)物質(zhì)來補充甘氨酸、丙酮酸和葡萄糖[5]；在美容業(yè)方面，4-THOP具有消除氧化劑和調(diào)整細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的作用，因此許多高檔護膚品中都添加有羥脯氨酸，以期保養(yǎng)皮膚和延緩衰老[6]。因此，4-THOP作為稀有氨基酸產(chǎn)品，在醫(yī)藥保健、材料化工、動物飼料、食品營養(yǎng)和護膚美容等行業(yè)都具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域和廣闊的市場空間，大力推進(jìn)羥脯氨酸產(chǎn)品的研究開發(fā)具有顯著的商業(yè)價值。

目前4-THOP的生產(chǎn)方法主要有膠原水解法和生物轉(zhuǎn)化法。傳統(tǒng)的水解提取法主要從富含膠原的生物組織中提取4-THOP[7-9]，這種生產(chǎn)方法逐步暴露出生產(chǎn)和純化步驟多、雜酸含量高、產(chǎn)率低、成本高、原料利用率低、環(huán)境污染大、廢水廢渣難處理等弊端[10]。隨著環(huán)保壓力增加和原料價格上漲，傳統(tǒng)的水解提取法將會逐步淡出市場。相對應(yīng)地，隨著工業(yè)生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，微生物合成法卻日益展現(xiàn)出水解提取法無法比擬的獨特優(yōu)勢。生物轉(zhuǎn)化法通過L-脯氨酸-反式-4-羥化酶，將外源添加的[11-13]或細(xì)胞自身積累的[14]游離脯氨酸（Pro）羥基化為4-THOP，見圖1。因其高度的立體及結(jié)構(gòu)選擇性、原材料來源廣泛、整體生產(chǎn)成本低的優(yōu)點，正逐漸成為4-THOP生產(chǎn)的主要方法[15]。1961年，Katz等[16]發(fā)現(xiàn)游離羥脯氨酸作為前體物參與鏈霉菌放線菌素的合成，即羥脯氨酸可經(jīng)微生物酶代謝合成。1995年，Matsuoka等[17]篩出一株分泌4-THOP的真菌，經(jīng)鑒定 該 真 菌 為 Clonostachys cylindrospora SANK 14591，在以脯氨酸為底物的發(fā)酵液中23℃培養(yǎng)9 d，4-THOP的積累量為13.8 mg/L。Shibasaki等[11]將指孢囊菌RH1（Dactylosporangium sp.RH1）中的脯氨酸-4-羥化酶基因置于強啟動子的調(diào)控下，在大腸桿菌中表達(dá)并在發(fā)酵罐中發(fā)酵100 h后，4-THOP的積累量達(dá)到可工業(yè)化發(fā)酵水平（41 g/L）。

圖1 從L-脯氨酸到反式-4-羥基-L-脯氨酸的生物轉(zhuǎn)化過程Fig.1 Biotransformation process from L-proline to trans-4-hydroxy-L-proline

作者所在實驗室率先在國內(nèi)開展生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)4-THOP的研究，將脯氨酸-4-羥化酶基因（hypt4基因）置于一個強組成型啟動子的控制下，構(gòu)建出不用添加誘導(dǎo)劑，將外源脯氨酸高效轉(zhuǎn)化為4-THOP的重組大腸桿菌[12]，并對該菌株進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，使得4-THOP的終產(chǎn)量達(dá)到42.5 g/L[12-13]。大腸桿菌中putA基因表達(dá)的蛋白質(zhì)具有脯氨酸脫氫酶活性，是脯氨酸降解途徑中的關(guān)鍵酶，Shibasaki等[11]在利用大腸桿菌W1485生產(chǎn)4-THOP的過程中，發(fā)現(xiàn)野生型菌株中脯氨酸被消耗完，但4-THOP的產(chǎn)量只有被消耗脯氨酸的87%，而以putA基因缺失型大腸桿菌作為宿主菌，發(fā)酵生產(chǎn)4-THOP時，則能將被消耗的脯氨酸全部轉(zhuǎn)化為4-THOP，終產(chǎn)量為41 g/L。所以有必要敲除putA基因來阻止大腸桿菌降解脯氨酸，以實現(xiàn)被消耗的脯氨酸完全轉(zhuǎn)化為4-THOP。另外，從脯氨酸到4-THOP的生物轉(zhuǎn)化過程中，需要氧分子參與，見圖1。如果提高細(xì)胞內(nèi)的溶氧量，則有可能會提高4-THOP的產(chǎn)量，而且透明顫菌 （Vitreoscilla sp.）血紅蛋白（VHb）已被克隆到多種微生物中，并成功提高了其氧氣攝入能力[18]。目前，尚沒有將透明顫菌血紅蛋白應(yīng)用于4-THOP生產(chǎn)研究的相關(guān)報道。李瑋等[19]通過改造脯氨酸-4-羥化酶分子結(jié)構(gòu)，提高了該酶催化效率；Yi等[20]使用T7啟動子控制脯氨酸-4-羥化酶基因在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)，通過提高脯氨酸-4-羥化酶的表達(dá)量，增強4-THOP的生產(chǎn)能力。

基于此，作者在實驗室已構(gòu)建的4-THOP生產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上，擬敲除大腸桿菌中編碼脯氨酸降解途徑中關(guān)鍵酶的putA基因，然后構(gòu)建透明顫菌血紅蛋白基因 （vgb基因）與脯氨酸-4-羥化酶基因（hypt4基因）共表達(dá)質(zhì)粒，在搖瓶水平上探討putA基因與vgb基因?qū)ν庠刺砑拥母彼岬挠行мD(zhuǎn)化率及4-THOP產(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 本研究所用菌種及質(zhì)粒見表1。

表1 所用菌種、質(zhì)粒及它們的來源Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 主要酶及試劑 Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、1 kb DNA Ladder、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、胰蛋白胨、氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）：購自生工生物工程（上海）有限公司；L-阿拉伯糖、電轉(zhuǎn)感受態(tài)用甘油：購自BBI；T4 DNA連接酶、PrimerSTAR HS DAN聚合酶、限制性內(nèi)切酶及DL5000 DNA Marker：購自Takara公司；酵母提取物：購自O(shè)xoid公司；其他試劑：均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 引物 所用引物的合成均由生工生物工程（上海）有限公司合成。所用的敲除及鑒定用引物序列見表2。

表2 敲除和鑒定用引物Table 2 Primers for deletion and identification

1.1.4 培養(yǎng)基

1）LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化鈉10 g/L。固體培養(yǎng)基添加1.5 g/dL瓊脂粉。

2）M9培養(yǎng)基：Na2HPO46 g/L，KH2PO43 g/L，NH4Cl 1 g/L，NaCl 0.5 g/L，CaCl23 mg/L，MgSO41 mmol/L，脯氨酸2 g/L。固體培養(yǎng)基添加1.5 g/dL瓊脂粉。

3）LBP培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化鈉10 g/L，脯氨酸10 g/L。

4）GT培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g/L，甘油 5 g/L，胰蛋白胨 8 g/L，（NH4）2SO45 g/L，K2HPO41 g/L，NaCl 2 g/L，MgSO40.2 g/L，CaCl20.015 g/L，F(xiàn)eSO43 mmol/L。

5）GC培養(yǎng)基：葡萄糖 8 g/L，甘油 10 g/L，玉米漿 8 g/L，（NH4）2SO413 g/L，K2HPO41.5 g/L，NaCl 2 g/L，MgSO40.3 g/L，CaCl20.015 g/L，F(xiàn)eSO44 mmol/L。

氨芐青霉素和卡那霉素的質(zhì)量濃度分別為100 μg/mL和50 μg/mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 大腸桿菌基因組DNA的提取 大腸桿菌基因組的提取方法參見文獻(xiàn)[23]。

1.2.2 基因敲除用打靶片段的制備 以pKD4為模板，P1、P2為引物，PrimerSTAR HS DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴增，Dpn I處理后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，以膠回收產(chǎn)物作為打靶片段敲除大腸桿菌W3110的putA基因。

以大腸桿菌W3110 putA：：kan的基因組為模板，Y1、Y2為引物，Taq和Pfu DNA聚合酶以1∶1的比例混勻進(jìn)行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，以膠回收產(chǎn)物作為敲除大腸桿菌BL21（DE3）putA基因的打靶片段。

1.2.3 大腸桿菌putA基因的敲除 大腸桿菌W3110和BL21（DE3）putA基因的敲除方法參見文獻(xiàn)[24]，驗證用菌落PCR的引物為Y1、Y2。

1.2.4 野生型菌株及缺失型菌株對脯氨酸的消耗分別挑取大腸桿菌 W3110、W3110ΔputA、BL21（DE3）、BL21（DE3）ΔputA的單菌落，接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。按照1%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于新的30 mL的LBP培養(yǎng)基中（250 mL的搖瓶），接種后取樣測定脯氨酸的初始濃度，37℃、220 r/min培養(yǎng)24 h后，取樣測定生物量（以O(shè)D600表示）及脯氨酸的殘留量，每種菌做3個平行樣。1.2.5 putA基因的缺失對4-THOP的影響 分別挑 取 大 腸 桿 菌 W3110/pUHT4、W3110ΔputA/ pUHT4、BL21 （DE3）/pUHT4、BL21（DE3）ΔputA/ pUHT4的單菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，待OD600大約為1.5左右時，按6%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于GT和GC培養(yǎng)基 （250 mL的搖瓶裝液量30 mL，并添加60 uL的600 g/L的脯氨酸母液，脯氨酸的初始濃度約為10 mmol/L）中，取樣測定脯氨酸的初始濃度，35℃、220 r/min培養(yǎng)24 h后，取樣測定生物量（以O(shè)D600表示）、脯氨酸的殘留量及4-THOP的產(chǎn)量，每種菌做3個平行樣。

1.2.6 vgb基因與hypt4基因共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

透明顫菌血紅蛋白基因（vgb基因）序列見GenBank accession no.M30794.1，利用自身的溶氧誘導(dǎo)型啟動子控制基因的表達(dá)。為了便于基因操作，在透明顫菌血紅蛋白基因溶氧誘導(dǎo)啟動子前插入EcoR I酶切位點，同時，在血紅蛋白基因終止密碼子后插入Nde I酶切位點。該基因片段由上海旭冠合成，將合成后的基因及pUHT4質(zhì)粒同時進(jìn)行EcoR I和Nde I雙酶切，膠回收雙酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶于16℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中。挑單菌落用V1、V2為引物做菌落PCR，挑取PCR條帶正確的菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒做單雙酶切驗證。選擇菌落PCR及單雙酶切均正確的質(zhì)粒，送上海生工測序，序列正確的即為含有vgb基因與hypt4基因的共表達(dá)質(zhì)粒pUHVT4。

1.2.7 透明顫菌血紅蛋白對4-THOP的影響 將pUHVT4質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌W3110ΔputA及大腸桿菌BL21（DE3）ΔputA菌株中，可獲得重組大腸桿菌W3110ΔputA/pUHVT4、BL21（DE3）ΔputA/ pUHVT4。分別挑取大腸桿菌W3110ΔputA/pUHT4、W3110ΔputA/pUHVT4、BL21（DE3）ΔputA/pUHT4、BL21（DE3）ΔputA/pUHVT4的單菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，待OD600大約為1.5左右時，按6%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于GT和GC培養(yǎng)基中，250 mL的搖瓶裝液量30 mL，并添加60 uL的600 g/L的脯氨酸母液，脯氨酸的初始濃度約為10 mmol/L，35℃、220 r/min培養(yǎng)24 h后，取樣測定生物量（以O(shè)D600表示）和4-THOP的產(chǎn)量。每種菌做3個平行樣。

1.2.8 脯氨酸及4-THOP的定量測定 脯氨酸的定量測定參見文獻(xiàn)[25]；4-THOP的定量測定參見文獻(xiàn)[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌中putA基因的敲除

大腸桿菌中putA基因表達(dá)的蛋白質(zhì)具有脯氨酸脫氫酶及吡咯啉-5-羧酸脫氫酶活性，在脯氨酸的降解途徑中起關(guān)鍵作用，因此在使用大腸桿菌生產(chǎn)4-THOP的過程中，有必要敲除putA基因，打斷大腸桿菌的脯氨酸降解途徑，使得被消耗的脯氨酸全部轉(zhuǎn)化為4-THOP。作者采用Red/ET同源重組系統(tǒng)敲除putA基因，首先制備出打靶片段。

以pKD4為模板，P1、P2為引物，擴增出一段兩端分別與大腸桿菌putA基因兩端序列同源的，中間為卡那霉素抗性基因的DNA片段，經(jīng)0.8 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小與理論值1 595 bp一致（圖2（a）），在經(jīng)過Dpn I處理及膠回收后，所得的產(chǎn)物即可作為大腸桿菌W3110的putA基因敲除用打靶片段。

對于大腸桿菌BL21（DE3）的putA基因的敲除，采用長同源臂的打靶片段，以大腸桿菌W3110 putA：：kan菌株的基因組為模板，Y1、Y2為引物，擴增出一段DNA片段，經(jīng)0.8 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小與理論值2 188 bp一致（圖2（b）），經(jīng)過膠回收后，所得的產(chǎn)物即可作為大腸桿菌BL21（DE3）的putA基因敲除用打靶片段。

將打靶片段通過電轉(zhuǎn)化至含有pKD46的大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素的LB平板上。然后將長出的單菌落點在M9P平板和新的含有卡那霉素的LB平板上，取能在含有卡那霉素的LB平板上生長但不能在M9P平板上生長的單菌落，做菌落PCR鑒定，電泳檢測PCR產(chǎn)物大小。若以大腸桿菌野生型菌株為菌落PCR模板時，擴增出的條帶理論大小為4 574 bp；若卡那霉素抗性基因替代putA基因整合到大腸桿菌的基因組上時，擴增出的條帶理論大小為2 188 bp。通過平板篩選及菌落PCR鑒定可以證明putA基因被成功敲除。再將質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)化到已丟失pKD46的陽性重組子中，通過熱誘導(dǎo)完成卡那霉素抗性基因的消除及pCP20質(zhì)粒的丟失，并以Y1、Y2為引物做菌落PCR，以進(jìn)一步確認(rèn)卡那霉素抗性基因的消除。若卡那抗性基因被從基因組上消除時，擴增出的條帶理論大小為814 bp，結(jié)果見圖3（大腸桿菌W3110）和圖4（大腸桿菌BL21（DE3））?？梢钥闯?，各個條帶的大小均與理論值一致，即實現(xiàn)了大腸桿菌W3110及BL21（DE3）中putA基因的敲除。

圖2 putA基因敲除用打靶片段的電泳分析Fig.2 Electrophoresis analysis of PCR products

圖3 大腸桿菌W3110野生型菌株及 putA基因缺失型菌株P(guān)CR電泳圖譜Fig.3 Identification of E.coli W3110 putA knockout by colony PCR

圖4 大腸桿菌BL21（DE3）野生型菌株及putA基因缺失型菌株P(guān)CR電泳圖譜Fig.4 Identification of E.coli BL21（DE3）putA knockout by colony PCR

2.2 野生型菌株與putA基因缺失型菌株對脯氨酸消耗的比較

為了測定putA基因的缺失對大腸桿菌消耗脯氨酸的影響，對大腸桿菌W3110、W3110ΔputA和大腸桿菌BL21（DE3）、BL21（DE3）ΔputA分別在LBP培養(yǎng)基中培養(yǎng)。結(jié)果表明，大腸桿菌W3110和BL21（DE3）均能消耗脯氨酸，而其對應(yīng)的putA缺失型菌株則不能消耗脯氨酸，即putA基因的敲除確實能打斷大腸桿菌的脯氨酸降解途徑，結(jié)果見圖5。由于野生型菌株能利用脯氨酸，所以生物量 （以O(shè)D600表示）要遠(yuǎn)大于缺失型菌株的，而且因為搖瓶培養(yǎng)時水分的蒸發(fā)導(dǎo)致了缺失型菌株的脯氨酸殘留量比脯氨酸初始含量高一些。在相同的培養(yǎng)條件下，W3110與BL21（DE3）的野生型菌株消耗了基本相同的脯氨酸 （分別為 （34.37±0.59）mmol/L，（35.16±3.52）mmol/L），但 W3110的生物量卻比BL21（DE3）的低 （OD600分別為4.85±0.19，5.86± 0.09），說明相比于W3110，BL21（DE3）能更有效的利用碳源。

圖5 大腸桿菌野生型菌株與對應(yīng)的缺失型菌株的對脯氨酸消耗及生物量的比較Fig.5 Comparation of proline consumption and biomass between wild types and mutants

2.3 putA基因的缺失對脯氨酸轉(zhuǎn)化及4-THOP產(chǎn)量的影響

將含有脯氨酸-4-羥化酶基因的質(zhì)粒pUHT4分別導(dǎo)入到野生型菌株與缺失型菌株后，將重組菌株接種于GT與GC培養(yǎng)基中 （250 mL的搖瓶裝液量30 mL，接種時加入60 uL的600 g/L的脯氨酸母液，使培養(yǎng)基中脯氨酸濃度大概為10 mmol/L），然后在35℃、220 r/min的搖床中搖瓶發(fā)酵24 h，測定putA基因的缺失對外源添加的脯氨酸的轉(zhuǎn)化率及4-THOP產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖6。putA基因缺失型菌株不能降解脯氨酸，Shibasaki等[11]發(fā)現(xiàn)putA基因缺失菌株能將被消耗的脯氨酸全部轉(zhuǎn)化為4-THOP，所以putA基因缺失型菌株的脯氨酸有效轉(zhuǎn)化率（即4-THOP的產(chǎn)量與被消耗的脯氨酸量的比值）的理論值應(yīng)為100%。相同條件下，野生型菌株的生物量及4-THOP的產(chǎn)量均大于缺失型菌株的，但同時消耗的脯氨酸也增多，野生型菌株消耗的脯氨酸未能完全轉(zhuǎn)化為4-THOP，缺失型菌株則能將消耗的脯氨酸全部轉(zhuǎn)化為4-THOP，即野生型菌株的脯氨酸有效轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于缺失型菌株的，見表3。無論是生物量還是4-THOP的產(chǎn)量都是最高的；W3110的生物量和4-THOP的產(chǎn)量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于相同條件下的BL21（DE3）的量。這些搖瓶發(fā)酵結(jié)果說明：大腸桿菌 BL21（DE3）比W3110更適合用于4-THOP的生產(chǎn)；在碳源供應(yīng)充足的情況下，GC培養(yǎng)基比GT培養(yǎng)基更有利于脯氨酸向4-THOP的轉(zhuǎn)化；野生型菌株的生物量及4-THOP的產(chǎn)量均大于其對應(yīng)的缺失型菌株的，但這卻是建立在降解外源添加的脯氨酸的基礎(chǔ)上才得以實現(xiàn)，putA基因缺失型菌株能有效阻止菌體降解脯氨酸，使得被消耗的脯氨酸全部的轉(zhuǎn)化為4-THOP。

2.4 構(gòu)建vgb基因與hypt4基因共表達(dá)質(zhì)粒

vgb基因在其自身的溶氧誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)控下，能在環(huán)境溶氧濃度較低的情況下表達(dá)出VHb蛋白，將外界環(huán)境中的氧氣轉(zhuǎn)運至菌體細(xì)胞內(nèi)，從而提高菌體的氧氣攝入能力。vgb基因與pUHT4質(zhì)粒的連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，對長出的單菌落用V1、V2為引物進(jìn)行菌落PCR驗證，結(jié)果見圖7。vgb基因及其溶氧誘導(dǎo)型啟動子的大小為575 bp，色氨酸串聯(lián)啟動子（Ptrp2）大小為225 bp，脯氨酸-4-羥化酶基因（hypt4基因，在Ptrp2的調(diào)控之下）的大小為819 bp，因此PCR條帶大小為理論值一致。

表3 脯氨酸的有效轉(zhuǎn)化率Table 3 Effective transformation rate of proline

圖7 重組質(zhì)粒pUHVT4的菌落PCR驗證Fig.7 Identification of recombinant plasmid pUHVT4 by colony PCR

對菌落PCR驗證正確的菌落提取質(zhì)粒，分別用EcoR I單酶切、EcoR I和BamH I雙酶切、Nde I和BamH I雙酶切，結(jié)果見圖8。pUC19質(zhì)粒大小為2 686 bp，各個酶切條帶大小與理論值一致。pUHVT4的質(zhì)粒電泳譜見圖9。

2.5 vgb基因?qū)Ω彼徂D(zhuǎn)化及4-THOP產(chǎn)量的影響

將構(gòu)建好的羥化酶基因及vgb基因的共表達(dá)質(zhì)粒pUHVT4和只含羥化酶基因的pUHT4質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌W3110和BL21（DE3）的putA基因缺失型菌株中，將重組菌株接種于GT與GC培養(yǎng)基中（250 mL的搖瓶裝液量30 mL，接種時加入60 uL的600 g/L的脯氨酸母液，使培養(yǎng)基中脯氨酸濃度大概為10 mmol/L），然后在35℃、220 r/min的搖床中搖瓶發(fā)酵24 h，比較vgb基因?qū)?-THOP產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖10。在GT培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株，其生物量比GC培養(yǎng)中培養(yǎng)的低，但4-THOP產(chǎn)量卻較GC培養(yǎng)基的高；在相同的培養(yǎng)基中，含有vgb基因的生物量比未攜帶vgb基因的菌株的稍高，但4-THOP的產(chǎn)量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未攜帶vgb基因的菌株的。對于大腸桿菌W3110ΔputA，vgb基因在GT培養(yǎng)基中使4-THOP的產(chǎn)量提高了20%，在GC培養(yǎng)基中4-THOP的產(chǎn)量提高了25%；對于大腸桿菌BL21（DE3）ΔputA，在GT培養(yǎng)基中4-THOP的產(chǎn)量提高了31%，在GC培養(yǎng)基中4-THOP的產(chǎn)量提高了27%。且在GT培養(yǎng)基中，大腸桿菌BL21（DE3）ΔputA/pUHVT4的4-THOP產(chǎn)量為 （0.94± 0.07）mmol/L，而大腸桿菌W3110 ΔputA/pUHVT4的產(chǎn)量為（0.12±0.004）mmol/L，脯氨酸的實際轉(zhuǎn)化率 （即4-THOP的產(chǎn)量與脯氨酸初始濃度的比值）則分別為9.4%與1.2%；在GC培養(yǎng)基中，大腸桿菌BL21 （DE3） ΔputA/pUHVT4 和 W3110ΔputA/ pUHVT4的 4-THOP的產(chǎn)量分別為 （0.76±0.03）mmol/L和（0.05±0.01）mmol/L，相對應(yīng)的脯氨酸實際轉(zhuǎn)化率分別為7.6%與0.5%。由搖瓶發(fā)酵結(jié)果可知，vgb基因在大腸桿菌中的表達(dá)確實能提高4-THOP的產(chǎn)量。

圖8 pUHVT4的酶切驗證Fig.8 Identification of pUHVT4 by restriction enzymes digestion

圖9 質(zhì)粒pUHVT4的示意圖Fig.9 Sketch map of plasmid pUHVT4

圖10 vgb基因?qū)?-THOP產(chǎn)量的影響Fig.10 Effect of vgb gene on 4-THOP yield

3 結(jié)語

作者成功敲除了大腸桿菌 W3110和BL21（DE3）的 putA基因，并比較了野生型菌株和putA基因缺失型菌株在GT與GC培養(yǎng)基中的生長狀況及4-THOP的產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，W3110菌株的4-THOP產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于BL21（DE3）菌株的，即W3110不適合用于生產(chǎn)4-THOP；野生型菌株在GC培養(yǎng)基中培養(yǎng)時4-THOP產(chǎn)量要高于在GT培養(yǎng)基中培養(yǎng)的產(chǎn)量，對于putA基因缺失型菌株則相反；野生型菌株的4-THOP產(chǎn)量比putA基因缺陷型菌株的高，但這是以降解脯氨酸為代價的，導(dǎo)致野生型菌株的脯氨酸有效轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于缺失型菌株的，putA基因缺失型菌株能將被消耗的脯氨酸完全轉(zhuǎn)化為4-THOP。

作者成功構(gòu)建了vgb基因與hypt4基因共表達(dá)質(zhì)粒pUHVT4，并導(dǎo)入大腸桿菌W3110和BL21（DE3）的putA基因缺失型菌株中，在GT與GC培養(yǎng)基中比較了vgb基因的表達(dá)對菌株生物量及4-THOP產(chǎn)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，vgb基因的表達(dá)對生物量的增加有正向的作用，但并不明顯；對4-THOP的產(chǎn)量的增加則有極為明顯的促進(jìn)作用，4-THOP的產(chǎn)量至少增加了20%。說明vgb基因適合用于大腸桿菌，并能提高4-THOP的產(chǎn)量。

作者在搖瓶水平上探討了對putA與vgb基因?qū)?-THOP產(chǎn)量的影響，下一步將以大腸桿菌BL21（DE3）ΔputA/pUHVT4為生產(chǎn)菌株，采用GC培養(yǎng)在發(fā)酵罐水平進(jìn)行小試，以確定其將外源添加的脯氨酸轉(zhuǎn)化為4-THOP的生產(chǎn)可行性。

參考文獻(xiàn)：

[1]REMUZON P.Trans-4-hydroxy-L-proline，a useful and versatile chiral starting block[J].Tetrahedron Letters，1996，52（44）：13803-13835.

[2]VIJAY K A，RAMA R K.Trans-4-hydroxy-l-proline：a novel starting material for N-alkylpyrroles synthesis[J].Tetrahedron Letters，2011，52（25）：3237-3239.

[3]REDDY V P，KUMAR A V，RAO K R.New strategy for the synthesis of N-aryl pyrroles：Cu-catalyzed C-N cross-coupling reaction of trans-4-hydroxy-l-proline with aryl halides[J].Tetrahedron Letters，2011，52（7）：777-780.

[4]WU G，BAZER F W，BURGHARDT R C，et al.Proline and hydroxyproline metabolism：implications for animal and human nutrition[J].Amino Acids，2011，40（4）：1053-1063.

[5]WU G，BAZER FW，DAVIST A，etal.Arginine metabolismand nutrition in growth，health and disease[J].Amino Acids，2009，37（1）：153-168.

[6]LAM M，SULINDRO M.Aging skin[J].Anti-Aging Research Brief，Academy of Anti-Aging Research MMIII，2001（1）：1-8.

[7]施強，桑立紅，王在震.從骨膠中提取L-羥基脯氨酸和L-脯氨酸[J].食品科學(xué)，1998，19（10）：26-29. SHI Qiang，SANG Lihong，WANG Zaixia.Extracting L-hydroproline and proline from boneglue[J].Food Science，1998，19（10）：26-29.（in Chinese）

[8]高煥春，李文英.從骨膠水解液中分離L-羥脯氨酸和L-脯氨酸[J].天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，1997，2：33-37. GAO Huanchun，LI Wenying.Isolating L-hydroproline and proline from hydrolytic liquor of boneglue[J].Journal of Tianjin University of Light Industry，1997，2：33-37.（in Chinese）

[9]呂紅線.從骨膠中制備L-羥脯氨酸的研究[J].山東輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，1997，11（4）：53-56. LV Hongxian.Study on L-HYP preparation from osseocolla[J].Journal of Shandong Institute of Light Industry，1997，11（4）：53-56.（in Chinese）

[10]張自強，趙東旭，楊新林.羥脯氨酸的研究與開發(fā)[J].氨基酸與生物資源，2006，28（1）：55-58. ZHANG Ziqiang，ZHAO Dongxu，YANG Xinlin.Research and development of hydroproline[J].Amino Acids&Biotic Resources，2006，28（1）：55-58.（in Chinese）

[11]SHIBASAKI T，MORI H，OZAKI A.Enzymatic production of trans-4-hydroxy-L-proline by regio-and stereospecific hydroxyproline of L-proline[J].Biosci Biotechnol Biochem，2000，64（4）：746-750.

[12]劉合棟，袁春偉，張震宇.脯氨酸-4-羥化酶在大腸桿菌中的密碼子優(yōu)化表達(dá)及對反式-4-羥脯氨酸生物合成的作用[J].生物加工過程，2014，12（6）：44-51. LIU Hedong，YUAN Chunwei，ZHANG Zhenyu，et al.Expression of codon optimized proline-4-hydroprolase in Escherichia coli and its effect on trans-4-hydroxyproline biosynthesis[J].Chinese Journal of Bioprocess Engineering，2014，12（6）：44-51.（in Chinese）

[13]袁春偉，何艷春，張勝利，等.重組大腸桿菌BL21（pUC19-Hyp）產(chǎn)羥脯氨酸的補料分批培養(yǎng)[J].生物加工過程，2014，12（4）：43-48. YUAN Chunwei，HE Yanchun，ZHANG Zhenyu，et al.Production of hydroproline by fed-batch culture of novel recombinant Escherichia coli BL21（pUC19-Hyp）[J].Chinese Journal of Bioprocess Engineering，2014，12（4）：43-48.（in Chinese）

[14]SHIBASAKI T，HASHIMOTO S，MORI H，et al.Construction of a novel hydroxyproline-producing recombinant Escherichia coli by introducing a proline 4-hydroxylase gene[J].J Biosci Bioeng，2000，90（5）：522-525.

[15]BACH T M H，TAKAGI H.Properties，metabolisms，and applications of（L）-proline analogues[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（15）：6623-6634.

[16]KATZE，PROCKOP D J，UNDENFRIEND S.Precursors ofthe hydroxyproline and ketoproline in actinomycin[J].The Journal of Biological Chemistry，1962，237（5）：1585-1588.

[17]MATSUOKA T，SERIZAWA N，HOSOYA T，et al.Microbial process for the production of trans-4-hydroxy-L-proline[P].美國專利：US 5334517.1994-08-02.

[18]ZHANG L，LI Y，WANG Z，et al.Recent developments and future prospects of Vitreoscilla hemoglobin application in metabolic engineering[J].Biotechnology Advances，2007，25（2）：123-136.

[19]李瑋，張金秀，王立安，等.一種編碼高活性反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶的基因片段及其應(yīng)用[P].中國專利：201310235337.6，2013-09-04.

[20]YI Y，SHENG H，LI Z，et al.Biosynthesis of trans-4-hydroxyproline by recombinant strains of Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli[J].BMC biotechnology，2014，14：44.

[21]張君，方宏清.大腸桿菌BL21（DE3）lpxM突變株的構(gòu)建[J].生物技術(shù)通訊，2006，17（4）：489-492. ZHANG Jun，F(xiàn)ANG Hongqing.Construction of a mutant E.coli BL21（DE3）with inactivated lpxM[J].Letters in Biotechnology，2006，17（4）：489-492.（in Chinese）

[22]康振，耿艷平，祁慶生，等.好氧發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸工程菌株的構(gòu)建[J].生物工程學(xué)報，2008，24（12）：2081-2085. KANG Zhen，GENG Yanping，QI Qingsheng，et al.Construction of engineered Escherichia coli for aerobic succinate production [J].Chin J Biotech，2008，24（12）：2081-2085.（in Chinese）

[23]AUSUBEL F M，BRENT R，KINGSTON R E，et al.精編分子生物學(xué)實驗指南第五版[M].金由辛，包慧中，趙麗云，等，譯.北京：科學(xué)出版社，2008：55.

[24]DATSENKO K A，WANNER B L.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97（12）：6640-6645.

[25]職明星，李秀菊.脯氨酸測定方法的改進(jìn)[J].河南科技學(xué)院學(xué)報，2005，33（4）：10-12. ZHI Mingxing，LI Xiuju.Improvement on the method for measuring proline content[J].Plant Physiology Journal，2005，33（4）：10-12.（in Chinese）

[26]KOIKE K，LI Y，SEO M，et al.Free 4-Hydroxyproline content in serum of bedridden aged people is elevated due to fracture[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin，2000，23（1）：101-103.

Effects of putA and vgb Genes on trans-4-Hydroxy-L-Proline Production

ZHANG Shengli1，2，3， LIN Fan1，2，3， LIU Hedong1，2，3， ZHANG Zhenyu*1，2，3， SUN Fubao1，2，3， XIA Ziwei1
（1.SchoolofBiotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.Key Laboratory ofIndustrial
Biotechnology of the Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Key Laboratory of
Carbohydrate Chemistry and Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Trans-4-hydroxy-L-proline iswidely distributed in nature and applied in the pharmaceutical，chemical，food and cosmetic products.In order to interrupt the bacterial degradation of proline during the biosynthesis process of trans-4-hydroxy-L-proline，putA gene was deleted using Red/ET homologous recombination system.Wild types and mutants were cultured in GT and GC media，and the trans-4-hydroxy-L-proline yields were compared to obtain the optimal strain and medium.On the other hand，vgb gene was introduced into the cell and its effecton trans-4-hydroxy-L-proline production was studied.The results show that the knockout of putA gene can prevent the degradation of proline，and with an adequate supply of the carbon source，GC medium is better for producing trans-4-hydroxy-L-proline than GT medium.Moreover，all of theconsumed proline can be transformed to trans-4-hydroxy-L-proline in putA deletion mutants.By contrast，the presence of vgb gene can significantly improve trans-4-hydroxy-L-proline production.

trans-4-hydroxy-L-proline，Escherichia coli，biotransformation，gene knockout，Vitreoscilla hemoglobin

Q 815

A

1673—1689（2016）12—1307—10

2015-02-03

國家自然科學(xué)基金項目（30800018，30970058）；江蘇省自然科學(xué)基金項目（BK2012554）；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目（200802951036）；工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室主任基金項目（KLIB-ZR200801）。

*通信作者：張震宇（1976—），男，江蘇張家港人，理學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事重要微生物產(chǎn)品的制備及發(fā)酵工藝方面的研究。E-mail：zhangzy@jiangnan.edu.cn