洪 軍, 白玉珍, 馬肖夢, 韓 莎, 孔 麗
(河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院,河南 平頂山 467036)
一株鰱魚腸道中嗜水氣單胞菌拮抗菌株的篩選、鑒定及特性
洪 軍, 白玉珍, 馬肖夢, 韓 莎, 孔 麗
(河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院,河南 平頂山 467036)
從鰱魚腸道中篩選嗜水氣單胞菌的拮抗菌株,并對生長培養(yǎng)條件進(jìn)行研究,以期為鰱魚養(yǎng)殖過程中嗜水氣單胞菌病的生物防治提供理論依據(jù)。通過對鰱魚腸道中嗜水氣單胞菌拮抗菌株的分離、篩選,并對其中拮抗作用較穩(wěn)定的菌株進(jìn)行生理生化、分子鑒定以及生長培養(yǎng)特性優(yōu)化。經(jīng)過多次篩選得到了15株拮抗效果較好的目標(biāo)菌株,其中拮抗作用較穩(wěn)定的S4為氣單胞菌屬,是偏堿性革蘭氏陰性短桿菌;通過單因素和正交實驗表明,S4最佳生長培養(yǎng)條件為1.5 g/dL淀粉,1.5 g/dL牛肉膏,1 g/dL氯化鈣,32℃,pH 8.5,接種體積分?jǐn)?shù)3%。研究結(jié)果為嗜水氣單胞菌的防治及拮抗菌S4的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
嗜水氣單胞菌;鰱魚;拮抗作用;菌株鑒定;S4;生長培養(yǎng)條件
我國淡水資源豐富,鰱魚是我國四大淡水魚之一,產(chǎn)量最高[1]。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是淡水養(yǎng)殖魚類暴發(fā)性傳染病的主要病原菌之一,它能引發(fā)多種水生動物的傳染病,導(dǎo)致水產(chǎn)動物的出血癥,給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。治療該菌引發(fā)的疾病主要使用化學(xué)藥物、抗生素、中草藥提取物等[3-4],如應(yīng)用大量抗生素,雖然在一定時期內(nèi)取得了令人滿意的效果,但因抗生素易產(chǎn)生耐藥、藥物殘留及毒副作用,長期在動物飼料中添加和濫用抗生素不僅影響動物和人類的健康,而且還導(dǎo)致“超級病菌”的出現(xiàn),威脅著人類的生存。因此探索利用有益微生物進(jìn)行生物防治成為必然。目前已有許多關(guān)于通過分離篩選拮抗微生物進(jìn)行防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害的報道,且取得較好的效果[5-6]。生物防治作為綜合防治水產(chǎn)病害的措施之一正倍受關(guān)注,它符合環(huán)境保護(hù)和有機(jī)化食品的要求,對生態(tài)平衡和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有特別重要的意義。
目前關(guān)于從鰱魚體內(nèi)分離篩選拮抗嗜水氣單胞菌菌株及相關(guān)研究未見報道。因此,作者擬以平頂山白龜山水庫中野生的鰱魚為研究對象,從其腸道粘膜中分離菌株進(jìn)行篩選,以致病性鰱魚嗜水氣單胞菌為指示菌,采用濾紙片法和打孔法等分離拮抗效果好、遺傳穩(wěn)定的菌株進(jìn)行生理生化和16S rRNA分子鑒定以及生長培養(yǎng)特性優(yōu)化,旨在為鰱魚養(yǎng)殖過程中嗜水氣單胞菌病的生物防治和將來商品化的拮抗微生物制劑的制備提供理論依據(jù)。
1.1 實驗材料
實驗菌:鰱魚腸道單菌;病原菌:嗜水氣單胞菌(XS91-4-1),從患出血性敗血癥的鰱魚中分離,購于中科院水生研究所;試驗用魚:來自平頂山白龜山水庫中野生健康鰱魚;培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂和營養(yǎng)肉湯,其中營養(yǎng)肉湯在培養(yǎng)條件優(yōu)化實驗中,作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基使用;指示菌:金黃色葡萄球菌(ATCC25922)、大腸桿菌(ATCC25922)、嗜水氣單胞菌(GIM1.172)、綠膿桿菌(CCTCC2620)、巨大芽孢桿菌(CICC0.217)、F41:均由作者所在實驗室保存。
1.2 實驗方法
1.2.1 鰱魚腸道中微生物的分離 參照蔣啟歡[7]等的方法,在無菌條件下用解剖刀刮取除腸道內(nèi)容物后,用無菌生理鹽水沖洗3次,然后用解剖剪將腸道剪短,用研磨器研碎,并加無菌生理鹽水適量,振蕩均勻后靜置,取上層液。將上層液按100、101、102倍梯度稀釋,取稀釋液各100 μL用涂布棒均勻涂布平板,最后將平板分別倒置,37℃培養(yǎng)24~36 h。選擇合適稀釋度的平板,挑取可疑菌落進(jìn)行平板劃線,并經(jīng)多次劃線得到純化細(xì)菌。
1.2.2 拮抗菌株的篩選 采用瓊脂平板擴(kuò)散法[6],將病原性嗜水氣單胞菌培養(yǎng)過夜,調(diào)整菌液密度為107CFU/mL,取100 μL涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上,打孔,取疑似拮抗菌株50 μL加入孔中,再置于28℃培養(yǎng)24 h,觀察孔穴周圍是否產(chǎn)生抑菌圈,對產(chǎn)生抑菌圈的菌落進(jìn)行分離純化,反復(fù)篩選后-80℃超低溫冰箱保存。
1.2.3 拮抗菌株的抗菌譜測定 采用瓊脂平板擴(kuò)散法[8],將指示菌(大腸桿菌、綠膿桿菌等)培養(yǎng)過夜后,調(diào)整菌液密度為107CFU/mL,取100 μL涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上,打孔,分別向各孔中加入培養(yǎng)20 h的拮抗菌菌液50 μL,每個樣品做3個重復(fù),用空白培養(yǎng)基作對照。分別在37℃或28℃下培養(yǎng) 24 h,測量孔穴周圍抑菌圈直徑。
1.2.4 拮抗菌生理生化鑒定及分子鑒定
1)拮抗菌生理生化鑒定:參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第八版)[9],將篩選到的菌株進(jìn)行鑒定。鑒定項目包括形態(tài)觀察、革蘭氏染色、各項生理生化指標(biāo)等。
2)分子鑒定:從拮抗菌中選取其中一株S4,對其16S rDNA基因序列的測定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,測序所需的上游引物 Seq forward (5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)和下游引物Seq reverse(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACG AC-3′)由生工生物工程(上海)股份有限公司提供,該公司同時協(xié)助完成測序工作。所得序列提交到NCBI的RefSeq數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析,搜集相似序列,然后用MEGA5.1軟件中的 N-J法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,設(shè)置自展值為1 000。
1.2.5 拮抗菌株S4培養(yǎng)特性研究
1)生長曲線的測定:參照Niall等[10]的方法。待測菌S4和嗜水氣單胞菌于營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)20 h后,取l0 μL菌液分別加入含250 μL營養(yǎng)肉湯的96孔板各孔中,每個樣品做6個平行,以空白培養(yǎng)基作對照。將96孔板分別置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),轉(zhuǎn)速80 r/min,每隔1小時用酶標(biāo)儀測定各孔OD630值,連續(xù)測定32 h,根據(jù)OD630值繪制生長曲線。
2)最佳接種體積分?jǐn)?shù)的確定:將拮抗菌按1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于裝有5 mL營養(yǎng)肉湯的試管中,于37℃、160 r/min培養(yǎng)16 h后,取200 μL加入96孔板各孔中用酶標(biāo)儀測定各孔OD630值,每個處理作6個重復(fù)。
3)最佳碳源的確定:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,按1 g/dL分別添加淀粉、甘露醇、麥芽糖、乳糖、果糖、葡萄糖制成培養(yǎng)基,分別按最佳接種體積分?jǐn)?shù)接種,于37℃、160 r/min培養(yǎng)16 h后,取200 μL加入96孔板各孔中,用酶標(biāo)儀測定各孔OD630值,每個處理作6個重復(fù)。
4)最佳氮源的確定:添加選出的最佳碳源,分別用1 g/dL的酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、亞硝酸鈉作氮源替換蛋白胨和牛肉膏制成培養(yǎng)基,分別按最佳接種體積分?jǐn)?shù)接種,于37℃、160 r/min培養(yǎng)16 h后,取200 μL加入96孔板各孔中,用酶標(biāo)儀測定各孔OD630值,每個處理作6個重復(fù)。
5)無機(jī)鹽的選擇:用上述實驗獲得的最佳碳源和氮源來替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源和氮源,選擇磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)、硫酸鎂、氯化鈣、氯化鈉4種不同的無機(jī)鹽替換氯化鈉,分別以1%制成培養(yǎng)基后,分別按最佳接種體積分?jǐn)?shù)接種,于37℃、160 r/min培養(yǎng)16 h后,取200 μL加入96孔板各孔中用酶標(biāo)儀測定各孔OD630值,每個處理作6個重復(fù)。
6)最適初始pH值的確定:用最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽,制成優(yōu)化培養(yǎng)基,將拮抗菌分別按最佳接種體積分?jǐn)?shù)分別接種于pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.5的制成優(yōu)化培養(yǎng)基中,于37℃、160 r/min培養(yǎng)16 h后,取200 μL加入96孔板各孔中用酶標(biāo)儀測定各孔OD630值,每個處理作6個重復(fù)。
7)最佳培養(yǎng)溫度的確定:待測菌S4培養(yǎng)16 h后,分別按最佳接種體積分?jǐn)?shù)接種于最適pH的優(yōu)化培養(yǎng)基中,分別于20、28、37、42℃且轉(zhuǎn)速為160 r/min培養(yǎng)16 h后,取200 μL加入96孔板各孔中用酶標(biāo)儀測定各孔OD630值,每個處理作6個重復(fù)。
8)優(yōu)化條件的正交試驗:在單因素的基礎(chǔ)上選取對拮抗菌S4影響較大的溫度、氯化鈣、淀粉、牛肉膏4個因素;按四因素三水平進(jìn)行正交試驗設(shè)計進(jìn)一步優(yōu)化S4的生長培養(yǎng)條件,采用正交軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及極差分析。若P<0.05,則表示有顯著差異。
2.1 拮抗菌株的篩選
從表1可知,從鰱魚腸道中分離到120多個菌株,從中分離篩選獲得15株對嗜水氣單胞菌具有不同拮抗能力的拮抗菌株。其中S12、S46拮抗效果較好,但是在多次篩選的實驗過程中S4、S50拮抗作用較穩(wěn)定。
2.2 拮抗菌株的抗菌譜測定
從15株菌株中選取3株拮抗菌進(jìn)行抗菌譜的測定,結(jié)果見表2。其中S4、S50抗菌譜較窄,S941抗菌譜較廣。
2.3 拮抗菌S4生理生化及分子鑒定
菌株S4在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后,菌落邊緣整齊、圓形、中央凸起、表面光滑、菌落濕潤粘稠、呈乳白色。在油鏡下觀察呈短桿狀,革蘭氏染色后呈陰性,無芽孢。部分生理生化鑒定,結(jié)果見表3。
經(jīng)過測序,獲得菌株S4的16S rRNA基因序列為 (1 490 bp): 在 GenBank序列登錄號為KP340798,在GenBank數(shù)據(jù)庫中通過BLAST方法比對, 菌株 S4與多株氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)的相似性達(dá)99%~100%。采用MEGA 5.1軟件用N-J法構(gòu)建進(jìn)化樹,可知S4與殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種 (Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida A449)遺傳距離最近,相似度達(dá)95%,初步判斷為此拮抗菌株為氣單胞菌屬,見圖1。但是否為同一進(jìn)化支,將根據(jù)此菌的生長培養(yǎng)特性進(jìn)一步探討。
表1 拮抗菌株對嗜水氣單胞菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of antagonistic bacterial strains on Aeromonas hydrophila
注:透明圈直徑為減去打孔器直徑(6 mm)。抑菌能力:“+++”表示:(10 mm<抑菌直徑);“++”表示:(5 mm<抑菌直徑<10 mm);“+”表示:(抑菌直徑<5 mm)
表2 抗菌譜的測定Table 2 Determination of the antibacterial spectrum
表3 拮抗菌株S4的部分生理生化特征Table 3 Results of physiological and biochemicalidentification of antagonistic strains S4
圖1 根據(jù)16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences
2.4 S4培養(yǎng)特性研究
2.4.1 生長曲線的測定 拮抗菌S4和嗜水氣單胞菌的生長曲線見圖2。由圖2可知,此兩種菌按1%接種體積分?jǐn)?shù)接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,拮抗菌S4培養(yǎng)14 h后達(dá)到了穩(wěn)定期,而嗜水氣單胞菌在培養(yǎng)12 h左右時達(dá)到了穩(wěn)定期,此后至32 h時均為穩(wěn)定期。后續(xù)試驗均按達(dá)到穩(wěn)定期時培養(yǎng)16 h測定。
2.4.2 最佳接種體積分?jǐn)?shù)的確定 由圖3接種體積分?jǐn)?shù)對拮抗菌S4的生長影響可知,接種體積分?jǐn)?shù)對S4的生長影響比較小,但總的趨勢為隨接種體積分?jǐn)?shù)的增加,拮抗菌S4的生長密度先增大后減小,最佳接種體積分?jǐn)?shù)可以初步定為3%。
圖2 嗜水氣單胞菌和S4的生長曲線Fig.2 Growth curve of Aeromonas hydrophila and S4
圖3 接種體積分?jǐn)?shù)對拮抗菌S4生長的影響Fig.3 Effects of inoculum amount on S4 growth
圖4 不同碳源對拮抗菌S4生長的影響Fig.4 Effects of different carbon sources on S4 growth
圖5 不同氮源對S4生長的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on S4 growth
圖6 不同無機(jī)鹽對拮抗菌S4生長的影響Fig.6 Effects of different inorganic salts on S4 growth
2.4.6 最適初始pH值的確定 用1 g/dL淀粉,1 g/dL牛肉膏,1 g/dL氯化鈣分別調(diào)節(jié)pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0制成的優(yōu)化培養(yǎng)基中,拮抗菌S4按3%接種體積分?jǐn)?shù)接種培養(yǎng)16 h,不同pH對拮抗菌S4的生長影響見圖7??芍猵H值對拮抗菌S4的生長影響比較大,最佳pH值為8.5,表明此菌為嗜堿性細(xì)菌。
圖7 不同pH對拮抗菌S4生長的影響Fig.7 Effects of different pH on S4 growth
2.4.7 最佳培養(yǎng)溫度的確定 不同溫度對拮抗菌S4的生長影響見圖8??芍獪囟葘卓咕鶶4的生長影響比較小,最佳溫度為37℃。
2.4.8 優(yōu)化條件的正交試驗 正交實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表4—5。由表5可知,按極差大小順序排列出因素的主次為D>C>A>B,即溫度>氯化鈣>淀粉>牛肉膏,按直觀分析及極差分析最佳組合為A3B3C2D1和A3B2C2D1。經(jīng)進(jìn)一步驗證,S4的最佳生長培養(yǎng)條件組合為:淀粉(1.5 g/dL),牛肉膏(1.5 g/dL),氯化鈣(1 g/dL),溫度為32℃。由表6的方差分析可知,溫度對S4的生長影響顯著。
圖8 不同溫度對拮抗菌S4生長的影響Fig.8 Effects of different temperatures on S4 growth
表4 正交試驗因素水平表Table 4 Level designation of orthogonal test
表5 L9(34)正交實驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 5 L9(34)orthogonal experiment design and results
表6 方差分析表Table 6 Variance analysis
作者以平頂山市白龜山水庫中鰱魚腸道的微生物為研究對象,以抑制病原菌嗜水氣單胞菌效果為依據(jù),根據(jù)體外拮抗試驗篩選出15株有明顯拮抗活性的菌株。拮抗微生物因具有不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性,對人畜安全無毒,不污染環(huán)境,無殘留,能保持生態(tài)平衡,工藝較簡單以及不少拮抗微生物同時具有提高生命力等特點(diǎn)而引起越來越多人們的關(guān)注和重視,在水產(chǎn)動物病害的生物防治中發(fā)揮著重要的作用。目前報道較多分離出的拮抗微生物主要有芽孢桿菌類、乳酸菌類、光合細(xì)菌類和酵母類等拮抗菌株,有些拮抗菌株已進(jìn)入商品化。關(guān)于魚類中病原菌拮抗菌株的篩選及應(yīng)用方面較多,如曹海鵬等[11]從養(yǎng)殖池污泥中分離篩選了一 株優(yōu)良的鱘源嗜水氣單胞菌拮抗芽孢桿菌;蔣啟歡等[12]從養(yǎng)殖的銀鯽腸道中分離純化出一株拮抗嗜水氣單胞菌的芽孢桿菌;Hagi等[13]從鯉腸道內(nèi)分離出10株益生菌,鑒定后發(fā)現(xiàn)來自于10個種和5個屬;Villamil等[14]研究了6株乳酸桿菌及其產(chǎn)物-乳酸對養(yǎng)殖鹵蟲的影響,發(fā)現(xiàn)加入乳酸桿菌(1×108個/mL)和乳酸的實驗組,鰻弧菌的數(shù)量明顯減少,而且體外拮抗實驗也表明,乳酸桿菌的胞外產(chǎn)物可以抑制鰻弧菌的生長。
在本研究中,針對1株拮抗效果較穩(wěn)定的拮抗菌S4經(jīng)部分生理生化、16S rDNA鑒定,初步判斷為氣單胞菌屬,此菌作為致病性嗜水氣單胞菌拮抗菌株未見報道。通過分子進(jìn)化樹表明,與殺鮭氣單胞菌的遺傳距離最近(95%),但是否為同一進(jìn)化支,此菌的生長培養(yǎng)特性有待進(jìn)一步研究。為了更好地了解此菌的生長特性和培養(yǎng)條件,利用瓊脂平板擴(kuò)散法和單因素正交實驗對此菌的抗菌譜和生長培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,此菌具有較窄的抗菌活性,pH為8.5左右,屬嗜堿性細(xì)菌,單因素實驗時,最佳培養(yǎng)溫度為37℃,優(yōu)化后最適培養(yǎng)溫度為32℃,方差分析表明,溫度對S4的生長影響有顯著差異。
與目前報道的典型殺鮭氣單胞菌的生長培養(yǎng)條件為22~25℃,生長pH為7差別較大,優(yōu)化后的生長溫度與大多數(shù)氣單胞菌的生長溫度為30℃接近。這些研究結(jié)果表明,S4可能屬于氣單胞菌屬,但具體的哪個種有待進(jìn)一步鑒定。作為致病菌的拮抗菌,在養(yǎng)殖系統(tǒng)使用中如何使其大量繁殖,縮短培養(yǎng)時間至關(guān)重要。因此,對S4的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明,在培養(yǎng)基為1.5 g/dL淀粉,1 g/dL牛肉膏,1 g/dL氯化鈣中,接種體積分?jǐn)?shù)以3%生長最佳。優(yōu)化之后,對其生長曲線及拮抗效果進(jìn)行研究。結(jié)果表明,菌體生長的延滯期縮短,穩(wěn)定期延長,并提高了拮抗效果。通過最佳生長和培養(yǎng)條件的研究,S4將來作為微生物菌劑使用時,菌種制備可以縮短培養(yǎng)時間,提高產(chǎn)量,降低成本,達(dá)到高效目的。
S4作為一種致病菌的拮抗菌株,能否作為飼料添加劑或抗菌藥物應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中,此菌的抑菌機(jī)制、安全性檢驗以及菌株拮抗效果規(guī)模化發(fā)酵條件優(yōu)化還有待于進(jìn)一步的研究。本研究為嗜水氣單胞菌的防治及拮抗菌S4的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
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Screening,Identification and Properties of One Antagonistic Strain Against Aeromonas hydrophila from Hypophthalmichthys molitrix Intestinal Tract
HONG Jun, BAI Yuzhen, MA Xiaomeng, HAN Sha, KONG Li
(College of Life Science and Engineering,Henan University of Urban Construction,Pingdingshan 467036,China)
In order to provide the theory basis for prevention and treatment the disease caused by Aeromonas hydrophila in the process of Hypophthalmichthys molitrix breeding,the strains which have the strong and stable abilities against A.hydrophila from H.molitrix intestinal tract were screened and their growth and culture conditions were studied.Antagonistic strains against A. hydrophila were separated and screened from H.molitrix intestinal tract.Then,the physiological and biochemical,molecular identification and the optimization of growth conditions of the stable antagonistic bacterium were determined.After many times of screening,15 antagonistic strains were got.Among them,the more stable antagonistic bacterium is number S4,which was an alkalineGram-negative bacillus brevis bacteria and belonged to Aeromonas genus.Orthogonal test indicated that the optimal growth conditions were 1.5 g/dL starch,1.5 g/dL beef extract,1 g/dL CaCL2,32℃,pH 8.5 and inoculation quantity 3%.The results provide the theoretical basis for the prevention of A.hydrophila and the application of antagonistic bacterium S4.
Aeromonas hydrophila,Hypophthalmichthys molitrix,antagonistic effect,strains identification,S4,growth and culture conditions
2.4.4 氮源試驗 不同氮源對拮抗菌S4的生長影響見圖5??芍煌磳卓咕鶶4的生長影響比較大,依次為:牛肉膏>蛋白胨>酵母浸粉>尿素>硫酸銨>亞硝酸鈉,其中蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏作為生長氮源較好。
2.4.5 無機(jī)鹽的選擇 不同無機(jī)鹽對拮抗菌S4的生長影響見圖6??芍煌瑹o機(jī)鹽對拮抗菌S4的生長影響差異比較小,依次為:氯化鈣>硫酸鎂>磷酸氫二鉀>氯化鈉,最佳無機(jī)鹽為氯化鈣。
TQ 920.1
A
1673—1689(2016)12—1285—07
2015-02-26
國家自然科學(xué)基金項目(31540060);2014年度河南城建學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項目;河南城建學(xué)院博士啟動基金項目。
洪 軍(1977—),女,河南商丘人,農(nóng)學(xué)博士,副教授,主要從事抗微生物菌劑的研發(fā)及多肽作用機(jī)理方面的研究。
E-mail:hongjun@hncj.edu.cn