階段控溫提高透明質(zhì)酸酶在畢赤酵母中的表達(dá)

張 娜， 李江華*， 金 鵬， 堵國(guó)成， 陳 堅(jiān)， 康 振

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

階段控溫提高透明質(zhì)酸酶在畢赤酵母中的表達(dá)

張 娜1，2， 李江華*1，2， 金 鵬1，2， 堵國(guó)成1，2， 陳 堅(jiān)1，2， 康 振1，2

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

透明質(zhì)酸酶（Hyalurondiase，HAase）是一種具有醫(yī)藥作用的水解酶，為了提高HAase在重組畢赤酵母中的分泌表達(dá)量，對(duì)重組畢赤酵母誘導(dǎo)階段的溫度進(jìn)行了優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，降低誘導(dǎo)溫度可以提高HAase的產(chǎn)量，其中兩階段控制溫度誘導(dǎo)策略效果最為顯著。誘導(dǎo)階段0~60 h溫度控制在25℃，60~96 h溫度控制在22℃，HAase酶活最高為1.18×106U/mL，是誘導(dǎo)溫度為30℃時(shí)（4.53×105U/mL）的2.6倍。此外，采用兩階段控制溫度誘導(dǎo)策略有利于細(xì)胞活性的提高和AOX1啟動(dòng)子的表達(dá)。兩階段控制溫度誘導(dǎo)策略還可以應(yīng)用到其他酵母表型中，為畢赤酵母高效表達(dá)外源蛋白質(zhì)提供一種新思路。

透明質(zhì)酸酶；畢赤酵母；兩階段控制溫度；分泌表達(dá)

透明質(zhì)酸酶（Hyalurondiase，HAase）是一種降解透明質(zhì)酸的水解酶，廣泛存在于動(dòng)物組織與微生物中。根據(jù)HAase的作用機(jī)制，將其分為3大類[1]：第一類為內(nèi)切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，作用于β-1，4-糖苷鍵，主要產(chǎn)物為四糖，主要來(lái)源于哺乳動(dòng)物；第二類為內(nèi)切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，作用于β-1，4-糖苷鍵，通過(guò)β-消去機(jī)制得到4，5-不飽和雙糖，主要來(lái)源于細(xì)菌；第三類為內(nèi)切-β-葡糖苷酸酶，作用于β-1，3-糖苷鍵，主要來(lái)源于水蛭。目前市場(chǎng)上出售的HAase主要是從活體的牛和羊的睪丸組織中提取，存在雜蛋白質(zhì)較多，純度較低，免疫原性較強(qiáng)等問(wèn)題。而重組的水蛭HAase沒(méi)有任何交叉感染，因此重組水蛭HAase可以應(yīng)用于治療臨床醫(yī)療如眼科、內(nèi)科和外科手術(shù)等。此外重組水蛭HAase能專一性的降解透明質(zhì)酸，產(chǎn)物在窄普基質(zhì)范圍內(nèi)[2-3]，可以用它來(lái)獲得小分子透明質(zhì)酸。

近年來(lái)，HAase已經(jīng)在枯草芽孢桿菌和畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，HAase在枯草芽孢桿菌中的產(chǎn)量達(dá)到1.50×104U/mL[4]，在畢赤酵母中的產(chǎn)量為6.31× 104U/mL[5]，這說(shuō)明畢赤酵母作為HAase的表達(dá)宿主具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)通過(guò)基因工程手段表達(dá)重組HAase也突破了水蛭原料來(lái)源的限制和繁瑣提取分離步驟等因素的限制，能夠推動(dòng)HAase在醫(yī)療和科研上的廣泛應(yīng)用。然而目前報(bào)道的畢赤酵母中的HAase的表達(dá)量依然較低距離實(shí)現(xiàn)工業(yè)化還有一段距離，因此如何提高HAase在畢赤酵母中的表達(dá)量是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。外源蛋白質(zhì)在畢赤酵母中表達(dá)，發(fā)酵培養(yǎng)條件是提高其表達(dá)量很重要的因素，在發(fā)酵培養(yǎng)條件中，溫度是影響細(xì)胞生長(zhǎng)和目的蛋白質(zhì)產(chǎn)率及穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素[6-8]。降低溫度可以降低細(xì)胞的死亡率，同時(shí)也可以降低目的蛋白質(zhì)的降解[9-10]，提高AOX轉(zhuǎn)錄水平[11]。

作者在構(gòu)建表達(dá)重組HAase的畢赤酵母重組菌株的基礎(chǔ)上研究誘導(dǎo)溫度對(duì)HAase表達(dá)的影響，通過(guò)改變誘導(dǎo)溫度來(lái)提高HAase的表達(dá)量，同時(shí)為提高外源蛋白質(zhì)在畢赤酵母工程菌中的高效表達(dá)提供一種新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 P.pastoris GS115-HAase由作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，其特性以P.pastoris GS115為宿主，整合來(lái)自水蛭的透明質(zhì)酸酶基因 （GenBank登錄號(hào)KJ026763），同時(shí)具有His+和Mut+表型。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）YPD活化培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物 10，蛋白胨20，葡萄糖20。裝液量為50 mL培養(yǎng)基/500 mL三角瓶。

2）分批發(fā)酵培養(yǎng)基 BSM （g/L）：CaSO4·2H2O 0.93，K2SO418.2，MgSO4·7H2O 14.9，KOH 4.13，甘油40.0；85%磷酸 26.7 mL，PTM1 4.35 mL。裝液量為800 mL培養(yǎng)基/3 L發(fā)酵罐。

3）PTM1（g/L）：CuSO4·5H2O 6，KI 0.09，MnSO4· H2O 3，H3BO30.02，MoNa2O4·H2O 0.2，CoCl20.5，ZnCl220，F(xiàn)eSO4·7H2O 65，生物素 0.2；濃H2SO45.0 mL。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng) 劃線活化菌種，挑取單菌落接種于YPD培養(yǎng)基中，于30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.2 高密度分批發(fā)酵培養(yǎng) 將搖瓶培養(yǎng)的YPD種子液以10%的接種體積分?jǐn)?shù)接種到3 L全自動(dòng)發(fā)酵罐（LiFlus GM BioTRON，Korea）中，溫度控制在30℃，使用25%氨水調(diào)節(jié)pH 5.5，初始攪拌轉(zhuǎn)速為500 r/min，通氣量為2.5 L/min，溶氧維持在30%以上。培養(yǎng)28 h，OD600約70~80待甘油耗盡，流加50 g/dL甘油（含12 mL/L PTM1），停止補(bǔ)料待甘油再次耗盡，OD600約220（干重約60 g/L），流加100%甲醇（含12 mL/L PTM1），甲醇的質(zhì)量濃度控制在18 g/L[12]，誘導(dǎo)溫度分別采用30、25、22℃及兩階段控制溫度誘導(dǎo)策略。

1.2.3 菌體濃度測(cè)定

1）OD600測(cè)定方法：將發(fā)酵液用pH 6.0的磷酸鹽緩沖液稀釋合適倍數(shù)，在600 nm下測(cè)定吸光值。

2）菌體干重的測(cè)定方法：取10 mL發(fā)酵液，10 000 r/min離心10 min，菌體使用pH 6.0磷酸鹽緩沖液重懸，洗滌兩次，放置于105℃烘箱，烘干至恒質(zhì)量，稱量并計(jì)算菌體干重（g/L）。

1.2.4 細(xì)胞活力測(cè)定 亞甲基蘭染色法[10]：將稀釋好的發(fā)酵液以1∶1加入0.4%亞甲基蘭，染色2~3 min。

細(xì)胞活力=（細(xì)胞總數(shù)-染色的細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)。

1.2.5 醇氧化酶AOX活力測(cè)定 醇氧化酶活力單位（1U）定義為：每分鐘產(chǎn)生1 μmoL的過(guò)氧化氫所需的酶量。酶活力測(cè)定方法見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。

1.2.6 水蛭透明質(zhì)酸酶活力測(cè)定 水蛭透明質(zhì)酸酶的活力單位定義為：在pH 5.5和38℃下，每小時(shí)從透明質(zhì)酸中釋放1 μg葡萄糖還原當(dāng)量的還原糖所需的酶量。

酶活力測(cè)定方法采用DNS法[14]。具體的測(cè)定方法為：反應(yīng)體系共3 mL，2 mL DNS溶液中分別加入0，50，75，100，125，150，175，200 μL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 （2 mg/mL），加水補(bǔ)足到3 mL，沸水浴煮沸10 min，冷卻至室溫，加水補(bǔ)足到10 mL，在540 nm下測(cè)定吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)，以葡萄糖質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品的測(cè)定需要配置如下試劑：2 mg/mL透明質(zhì)酸，50 mmol/L、pH 5.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液。反應(yīng)體系1 mL，800 μL透明質(zhì)酸，稀釋一定倍數(shù)的發(fā)酵上清液，緩沖液補(bǔ)足1 mL，38℃水浴鍋中反應(yīng)15 min，用1 mL反應(yīng)的樣品代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得還原當(dāng)量的葡萄糖質(zhì)量濃度，根據(jù)水蛭透明質(zhì)酸酶的活力定義，進(jìn)一步求得透明質(zhì)酸酶酶活。

2 結(jié)果與分析

溫度對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)和重組蛋白質(zhì)的表達(dá)具有很重要的影響，主要通過(guò)影響菌體的生長(zhǎng)和細(xì)胞代謝。溫度升高菌體胞內(nèi)代謝加速，使得菌體過(guò)早的老化，過(guò)低的溫度影響胞內(nèi)酶的活性，從而影響胞內(nèi)代謝，最終影響菌體的生長(zhǎng)和重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。

2.1 誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體濃度和HAase表達(dá)的影響

畢赤酵母生長(zhǎng)溫度為28~30℃，考慮到過(guò)高的溫度會(huì)造成菌體過(guò)早的衰老，一定程度的降低溫度有利于重組酶的表達(dá)，因此考察了不同溫度（30、25、22℃）對(duì)HAase表達(dá)的影響，發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖1—3。不同誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體干重影響較小，對(duì)HAase表達(dá)較大。當(dāng)溫度為30℃時(shí)，誘導(dǎo)72 h，菌體干重最高達(dá)到182.7 g/L，HAase酶活最高為4.53×105U/mL。72 h后，隨著溶氧反彈，菌體干重緩慢降低，同時(shí)HAase酶活也緩慢下降，可能溫度過(guò)高造成細(xì)胞不利的影響；誘導(dǎo)溫度為25℃時(shí)，誘導(dǎo)90 h菌體干重最高為187.6 g/L，HAase酶活最高為8.56×105U/mL，為誘導(dǎo)溫度30℃的1.89倍；誘導(dǎo)溫度為22℃時(shí)，誘導(dǎo)90 h菌體干重最高為189.8 g/L，HAase酶活最高為1.04×106U/mL，為誘導(dǎo)溫度30℃的2.3倍。由不同誘導(dǎo)溫度對(duì)HAase表達(dá)的影響可知，降低溫度有利于HAase的表達(dá)。

圖1 誘導(dǎo)溫度為30℃時(shí)的分批發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)HAase酶活的影響Fig.1 Effect of induction temperature 30℃ on the HAase by fed-batch fermentation

圖2 誘導(dǎo)溫度為25℃時(shí)的分批發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)HAase酶活的影響Fig.2 Effect of induction temperature 25℃ on the HAase by fed-batch fermentation

圖3 誘導(dǎo)溫度為22℃時(shí)的分批發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)HAase酶活的影響Fig.3 Effect of induction temperature 22℃ on the HAase by fed-batch fermentation

2.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)細(xì)胞活力的影響

前期研究表明，表達(dá)階段溫度降低與細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞活性呈現(xiàn)正相關(guān)[9]，對(duì)不同誘導(dǎo)溫度下的細(xì)胞活力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。誘導(dǎo)溫度為30℃時(shí)，誘導(dǎo)48 h時(shí)細(xì)胞活力降低到80%，誘導(dǎo)96 h時(shí)細(xì)胞活力下降到40%以下。誘導(dǎo)溫度為25℃時(shí)，誘導(dǎo)0~60 h，細(xì)胞活力維持在90%以上，60~96 h，細(xì)胞活力維持在80%以上。誘導(dǎo)溫度為22℃時(shí)，誘導(dǎo)0~ 96 h細(xì)胞活力維持在90%以上。由不同誘導(dǎo)溫度對(duì)細(xì)胞活力的影響可知，高溫對(duì)細(xì)胞活力不利，可能是溫度過(guò)高導(dǎo)致細(xì)胞提前衰亡，從而影響細(xì)胞活力。

圖4 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.4 Effect of different induction temperature on the cell viability

2.3 誘導(dǎo)溫度對(duì)醇氧化酶AOX酶活力影響

溫度還能影響AOX酶活性，降低溫度可提高AOX基因轉(zhuǎn)錄水平3~5倍[14]，故考察不同誘導(dǎo)溫度對(duì)AOX酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。誘導(dǎo)溫度為30℃時(shí)，誘導(dǎo)36 h，AOX酶活達(dá)到最高值1 251 U/mL。誘導(dǎo)96 h，AOX酶活下降為804 U/mL；當(dāng)誘導(dǎo)溫度為25℃時(shí)，誘導(dǎo)60 h，AOX酶活最高達(dá)到1 530 U/mL。誘導(dǎo)96 h時(shí)，AOX酶活為1 410 U/mL；誘導(dǎo)溫度為22℃時(shí)，誘導(dǎo)60 h，AOX酶活最高為1 653 U/mL。誘導(dǎo)96 h，AOX酶活力維持在1 621 U/mL且較穩(wěn)定。由溫度對(duì)AOX酶活的影響可知，降低溫度能夠提高AOX酶活力。

2.4 兩階段控制溫度誘導(dǎo)策略對(duì)HAase表達(dá)影響

由不同誘導(dǎo)溫度下細(xì)胞活力與醇氧化酶AOX酶活力的影響，結(jié)合HAase的發(fā)酵過(guò)程，發(fā)現(xiàn)當(dāng)誘導(dǎo)溫度分別為25℃與22℃時(shí)，誘導(dǎo)0~60 h，細(xì)胞活力維持在90%以上，AOX酶活力達(dá)到最高，且HAase酶活力增加速度幾乎相同。60~96 h，兩個(gè)誘導(dǎo)溫度下有明顯的區(qū)別，誘導(dǎo)溫度為25℃時(shí)，細(xì)胞活力下降到80%，AOX酶活力緩慢下降。而誘導(dǎo)溫度為22℃時(shí)，細(xì)胞活力維持在90%以上，AOX酶活力幾乎穩(wěn)定且HAase酶活力增加速度加快?；诖搜芯拷Y(jié)果，我們提出了一個(gè)兩階段控制溫度誘導(dǎo)策略即誘導(dǎo)0~60 h，溫度控制為25℃；60~96 h，溫度控制為22℃，結(jié)果見(jiàn)圖6。采用兩階段控制溫度誘導(dǎo)策略，誘導(dǎo)60~72 h細(xì)胞活力和AOX酶活力緩慢增加，72~96 h幾乎不變，同時(shí)HAase表達(dá)速度加快，誘導(dǎo)96 h，菌體干重為190 g/L，HAase酶活最高達(dá)到1.18×106U/mL，是誘導(dǎo)溫度30℃的2.6倍。因此，兩階段控制溫度誘導(dǎo)策略比單一的降低溫度更有利于外源蛋白質(zhì)的表達(dá)。

圖5 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)醇氧化酶AOX酶活力的影響Fig.5 Effect of different induction temperature on the AOX activity

圖6 兩階段控制溫度誘導(dǎo)策略的分批發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)HAase表達(dá)影響Fig.6 Effect of two-stage temperature induction strategy on the HAase by fed-batch fermentation

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)研究不同誘導(dǎo)溫度對(duì)細(xì)胞活力、AOX酶活力以及HAase酶活力的影響，確定了一種最適誘導(dǎo)表達(dá)HAase的策略，即兩階段控制溫度誘導(dǎo)策略，采用此策略后，HAase酶活最高達(dá)到1.18×106U/ mL，是誘導(dǎo)溫度30℃的2.6倍，實(shí)現(xiàn)了HAase在畢赤酵母中的高效表達(dá)，說(shuō)明兩階段控制溫度誘導(dǎo)策略更能提高HAase的表達(dá)，為畢赤酵母提高外源蛋白質(zhì)表達(dá)提供了一種新思路，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)HAase的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。此外進(jìn)一步通過(guò)對(duì)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的上游進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高HAase的表達(dá)。

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Enhanced Expression of Hyalurondiase in Pichia pastoris by Two-Stage Temperature Induction Strategy

ZHANG Na1，2， LI Jianghua*1，2， JIN Peng1，2， DU Guocheng1，2， CHEN Jian1，2， KANG Zhen1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Hyalurondiases（HAase）are a kind of hydrolases with medicine values.In order to improve the expression of HAase in the recombinant Pichia pastoris，the effect of induction temperature on HAase expressed was investigated in the recombinant P.pastoris.The result showed that the production of HAase could be improved with the decrease of induction temperatures，especially，two-stage temperature induction strategy.In this strategy，temperature was controlled at 25℃during the induction stage 0～60 h，and then shifted to 22℃after 60 h.HAase activity reached to 1.18×106U/mL，2.6 fold improvement compared to induction temperature at 30℃（4.53×105U/mL）.In addition，two-stage temperature induction strategy had an advantage on cell viability and alcohol oxidase activity，which offered a new strategy for expression of exogenous protein in the recombinant P.pastoris.

hyalurondiase，Pichia pastoris，two-stage control temperature，secretion expressed

Q 93

A

1673—1689（2016）12—1273—05

2014-10-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31670092）；江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（BE2014607）。

*通信作者：李江華（1966—），男，江西修水人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事酶技術(shù)發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化與控制方面的研究。E-mail：lijianghua@jiangnan.edu.cn