定點(diǎn)突變提高畢赤酵母產(chǎn)葡萄糖氧化酶的氧化穩(wěn)定性

聞一凡， 顧 磊， 張 娟， 堵國成*

定點(diǎn)突變提高畢赤酵母產(chǎn)葡萄糖氧化酶的氧化穩(wěn)定性

聞一凡1，2， 顧 磊1，2， 張 娟1，2， 堵國成*1，2

(1．江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2．江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

通過定點(diǎn)突變的方法，將來源于黑曲霉Aspergillus niger的葡萄糖氧化酶的甲硫氨酸替換為亮氨酸，以期提高葡萄糖氧化酶的耐氧化性。野生型的葡萄糖氧化酶和突變酶M305L、M524L、M556L和M582L的基因分別在巴斯德畢赤酵母中分泌表達(dá)，對突變酶與野生型葡萄糖氧化酶純化后進(jìn)行性質(zhì)比較。結(jié)果表明：突變酶的耐氧化性與野生型葡萄糖氧化酶相比均有不同程度的提高，其中，突變酶M556L在100 mmol/L和500 mmol/L過氧化氫存在下的氧化穩(wěn)定性是野生型葡萄糖氧化酶的近2倍，且催化效率 （kcat/Km）提高至野生型葡萄糖氧化酶的2.08倍。定點(diǎn)突變后，突變酶的最適反應(yīng)溫度為35℃，與野生型葡萄糖氧化酶基本保持一致，同時(shí)，突變酶M524L的pH穩(wěn)定范圍由4.0~6.0擴(kuò)展到3.0~7.0。

葡萄糖氧化酶；重組；定點(diǎn)突變；黑曲霉；巴斯德畢赤酵母

葡萄糖氧化酶 （β-D-glucose：oxygen 1-oxidoreductase；EC1.1.3.4，簡稱GOD）是一種富含糖基的黃素蛋白，它利用分子氧作為電子受體，專一性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫[1]。葡萄糖氧化酶的主要來源是黑曲霉，但黑曲霉產(chǎn)葡萄糖氧化酶酶活低、催化效率低、雜蛋白質(zhì)多，使得其在實(shí)際應(yīng)用中有一定的局限性[2-3]。目前畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是倍受關(guān)注的真核表達(dá)系統(tǒng)，將黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在該系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)在近年來屢見不鮮。

GOD在食品保鮮、葡萄糖酸生產(chǎn)等工業(yè)領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值[4]。在制藥領(lǐng)域中，GOD可用來檢測葡萄糖含量；在食品工業(yè)中用來除去葡萄糖或者氧氣以提高各種產(chǎn)品的色澤、味道等，同時(shí)由于反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，也可起到殺菌作用[1，5]。在食品添加劑領(lǐng)域作為抗菌劑的應(yīng)用中，GOD的作用原理主要是產(chǎn)生的過氧化氫具有殺菌作用，然而，過氧化氫的積累會(huì)抑制GOD的活性而影響其本身的催化效率。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)過氧化氫濃度達(dá)到30 mmol/L時(shí)就會(huì)對GOD活性產(chǎn)生抑制作用[6]。提高GOD對氧的耐受性可使該酶在應(yīng)用中更加穩(wěn)定。

近年來，國內(nèi)外有很多關(guān)于提高酶耐氧化性的研究，其中包括用抗氧化性較強(qiáng)的氨基酸取代甲硫氨酸的方式來減少由于氨基酸殘基被氧化而引起的酶活降低甚至失活[7]。來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌屬US110的α-淀粉酶197位蛋氨酸被置換為丙氨酸后，該突變體在1.8 mol/L的H2O2的存在下處理60 min后保留了70%的活性[8]。Peng等人[9]通過將N-?；?D-氨基酸酰胺水解酶221位蛋氨酸替換為亮氨酸后，酶催化效率kcat/Km提高了2.4倍。

葡萄糖氧化酶的定向分子改造方面有很多相關(guān)研究[10-12]，但在提高其耐氧化性方面鮮有報(bào)道。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道，葡萄糖氧化酶的每個(gè)單體中除輔酶FAD外，有3個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基參與催化反應(yīng)，即412位的谷氨酸殘基和516、559位的組氨酸殘基。有多個(gè)證據(jù)指明His516是主要催化基團(tuán)[13-14]。

作者在前人研究的基礎(chǔ)上，選擇靠近關(guān)鍵氨基酸殘基的M305，M524，M556和M582等4個(gè)可能的關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變體的構(gòu)建以提高葡萄糖氧化酶的氧化穩(wěn)定性和催化效率。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

葡萄糖氧化酶基因GOD：由作者所在實(shí)驗(yàn)室從黑曲霉Aspergillus niger BBE11721中獲得并構(gòu)建在重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-GOD上；菌株大腸桿菌Escherichia coli JM109，載體pPIC9K（amp+）和畢赤酵母菌株P(guān)ichia pastoris GS115（His-）：均由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 LB培養(yǎng)基 胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。添加氨芐青霉素0.1 mg/mL用于質(zhì)粒篩選。

1.2.2 YPD培養(yǎng)基 胰蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L。一般用于種子活化。

1.2.3 BMGY生長培養(yǎng)基 胰蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，YNB 13.4 g/L，生物素0.4 mg/L，甘油10 g/L，0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液，pH 6.0。一般用于發(fā)酵基本培養(yǎng)。

1.2.4 BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基 胰蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，YNB 13.4 g/L，生物素0.4 mg/L，甲醇體積分?jǐn)?shù)1%，0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液，pH 6.0。一般用于發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.5 MD培養(yǎng)基 YNB 13.4 g/L，生物素0.4 mg/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L。添加遺傳霉素0.25 mg/mL，用于陽性轉(zhuǎn)化子初篩。

1.3 工具酶和生化試劑

Phusion high-fidelity DNA polymerase、限制性內(nèi)切酶 DpnI和限制性內(nèi)切酶 MSSI：Thermo Scientific公司；DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)粒提取試劑盒和YNB：上海生工生物公司；葡萄糖：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰聯(lián)茴香胺、葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶：Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 方法

1.4.1 培養(yǎng)方法

1）E.coli種子培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基裝液量為10%，采用250 mL搖瓶進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為10 h，轉(zhuǎn)速為200 r/min。

2）P.pastoris種子培養(yǎng)條件：種子甘油管保藏在-80℃超低溫冰箱中，劃線活化菌種后，挑單菌落，接種于50 mL YPD中（50 mL培養(yǎng)基/500 mL三角瓶中），于30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。

3）P.pastoris發(fā)酵培養(yǎng)條件：將培養(yǎng)好的種子液接種到50 mL（500 mL三角瓶）液體生長培養(yǎng)基BMGY中，其中接種體積分?jǐn)?shù)為10%。置于搖床中，培養(yǎng)溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min。培養(yǎng)24 h后離心收集全部菌體，生理鹽水洗滌2次，重懸后菌體全部轉(zhuǎn)入50 mL（500 mL三角瓶）液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中，置于30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，每24小時(shí)補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)1%的甲醇，誘導(dǎo)產(chǎn)酶。

1.4.2 定點(diǎn)突變 以重組質(zhì)粒pPIC9K-GOD為模板，設(shè)計(jì)突變引物，進(jìn)行全質(zhì)粒PCR。反應(yīng)體系含5×FD PCR buffer 5 μL，DNTP Mixture 2 μL，模板DNA 1 μL，上游引物各1 μL，Phusion高保真DNA聚合酶0.5 μL，加雙蒸水至終體積為25 μL。5×FD PCR buffer 5 μL，DNTP Mixture 2 μL，模板DNA 1 μL，下游引物各1 μL，phusion酶0.5 μL，DMSO 1.5 μL，加雙蒸水至終體積為25 μL。反應(yīng)5個(gè)循環(huán)后，將對應(yīng)PCR反應(yīng)液混合，繼續(xù)反應(yīng)25個(gè)循環(huán)。PCR條件：8℃預(yù)變性3 min；98℃變性15 s；53℃退火30 s；72℃延伸11 min（5個(gè)循環(huán)）；72℃延伸10 min?；旌虾髷U(kuò)增條件：98℃預(yù)變性3 min；98℃變性15 s；53℃退火30 s；72℃延伸11 min（25個(gè)循環(huán)）；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物 DpnI消化，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含氨芐青霉素LB平板上。挑取陽性克隆子培養(yǎng)后測序。

1.4.3 重組葡萄糖氧化酶工程菌的構(gòu)建與表達(dá)

將測序成功突變質(zhì)粒pPIC9K-GOD用MSSI單酶切使之線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母P.pastoris GS115，轉(zhuǎn)化液涂布于MD平板上，30℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。挑取200個(gè)轉(zhuǎn)化子，點(diǎn)種到含0，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L的遺傳霉素（G418）的YPD培養(yǎng)基平板上，30℃同步培養(yǎng)2 d后，鑒定轉(zhuǎn)化子的G418抗性，在含高濃度遺傳霉素（G418）平板上生長較好的為高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子，將被用于后續(xù)發(fā)酵表達(dá)。電轉(zhuǎn)化及篩選方法參見操作手冊[15]。由于G418抗性水平大致依賴于所整合的細(xì)菌卡那霉素基因數(shù)目，因而也反映了重組質(zhì)粒的整合拷貝數(shù)。

將篩選獲得的高拷貝酵母工程菌作為生產(chǎn)菌株，將其接種于YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行種子活化，在30℃、200 r/min下培養(yǎng)24 h，然后以10%接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接到基本發(fā)酵培養(yǎng)基BMGY中，并在30℃、200 r/min下培養(yǎng)24 h。然在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)到OD600為1.6~1.7時(shí)轉(zhuǎn)入50 mL（500 mL三角瓶）液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中，置于30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，每24小時(shí)補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)1%的甲醇，誘導(dǎo)產(chǎn)酶，每隔12小時(shí)取樣，即為粗酶液。以表達(dá)野生型，即未經(jīng)突變的產(chǎn)重組 GOD的 P.pastoris GS115為對照菌株。

1.4.4 葡萄糖氧化酶的純化 將酶液于4 000 r/min離心5 min，收集發(fā)酵上清液，置于10 000的透析袋中，在1 L A液（20 mmol/L磷酸二氫鈉溶液）中進(jìn)行透析除鹽，以保證陰離子交換柱的吸附性質(zhì)。收集透析后的發(fā)酵液，12 000 r/min離心30 min，收集上清液。蛋白質(zhì)的純化采用HitrapTM Q FF（1 mL）陰離子交換層析柱。使用B液（20 mmol/L磷酸二氫鈉-1M氯化鈉溶液）梯度洗脫，流速1 mL/min，分步收集洗脫峰中的樣品，經(jīng)過酶活測定，確定目的樣品所在的收集管，得到電泳純的目標(biāo)蛋白質(zhì)。

1.5 分析方法

1.5.1 葡萄糖氧化酶酶活測定 酶活力單位定義：在35℃、pH 6.0的條件下，1 min從1 μmol的β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H2O2所需的酶量為一個(gè)葡萄糖氧化酶酶活力單位，以U/mL表示。葡萄糖氧化酶酶活測定方法見文獻(xiàn)[16]。

1.5.2 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定 用Bio-Rad公司生產(chǎn)的Brandford蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定試劑盒測定，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 米氏常數(shù)（Km），催化效率（kcat/Km）的測定 在35°C、pH 6.0的條件下，以β-D-葡萄糖和苯醌為催化反應(yīng)底物，改變葡萄糖濃度（2~100 mmol/L）和苯醌濃度（0.5~10 mmol/L）。分別測定GOD酶活力隨時(shí)間變化曲線，獲得GOD酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax，同時(shí)計(jì)算 kcat。酶液統(tǒng)一蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度至100 μg/mL。

1.5.4 酶的耐氧化性測定 用Brandford試劑盒將野生型葡萄糖氧化酶和突變酶的酶液統(tǒng)一到同一蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，采用無載體交聯(lián)技術(shù)固定化野生型葡萄糖氧化酶與突變酶。取100 μL酶液，加入通用過氧化物酶，緩慢滴加聚乙二醇2 000，之后加入25%戊二醛，將混合物放入搖床（30℃，100 r/min）培養(yǎng)，用10 mmol/L丙二酸鈉緩沖液（pH 5.0）充分懸浮混合液，8 000 r/min離心30 min），收集上清液，并重復(fù)上述操作，直到上清液中無法檢測到酶活。

將固定化后的野生型葡萄糖氧化酶和突變酶放在不同濃度H2O2（10、20、50、100、500 mmol/L）中處理，處理溫度為35℃，處理時(shí)間為2 h，緩沖液為丙二酸鈉緩沖液（pH 5.0，10 mmol/L）。處理后離心，倒掉上清液，并用緩沖液洗沉淀直到上清液中無法檢測到過氧化氫。將沉淀用等體積的緩沖液溶解，離心并充分重懸后測定剩余酶活。

1.5.5 最適pH值和酸堿穩(wěn)定性的分析 測定不同pH條件對葡萄糖氧化酶酶活力和穩(wěn)定性影響時(shí)，pH范圍為2.0~9.0，所需不同pH的緩沖液包括：pH為2.0~8.0時(shí)20 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；pH為9.0時(shí)采用20 mmol/L Tris-鹽酸緩沖液。pH對葡萄糖氧化酶穩(wěn)定性測定時(shí)，處理?xiàng)l件為將高濃度純化后的葡萄糖氧化酶用不同pH的緩沖液溶解，35℃處理1 h，測定相應(yīng)殘留酶活力。相對酶活力（100%）的定義為不同pH處理?xiàng)l件下，最高酶活力為100%。

1.5.6 最適溫度和熱穩(wěn)定性的分析 測定葡萄糖氧化酶最適反應(yīng)溫度時(shí)，溫度變化范圍為10~70℃，緩沖液為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 5.5，20 mmol/L）和檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 （pH 6.0，20 mmol/L）。葡萄糖氧化酶的溫度穩(wěn)定性測得的條件為55、60、65℃處理30 min，緩沖液為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 5.5，20 mmol/L）和檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 （pH 6.0，20 mmol/L）。相對酶活力（100%）的定義為不同反應(yīng)溫度條件下，測得的最高酶活活力為100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變位點(diǎn)的確定

據(jù)報(bào)道，多種酶在應(yīng)用過程中氧化失活的主要原因是甲硫氨酸（Met）殘基在強(qiáng)氧化環(huán)境下會(huì)被氧化成其含硫衍生物[17]。位于活性位點(diǎn)周圍的甲硫氨酸，氧化后生成的含硫衍生物支鏈形狀較大。較大的含硫衍生物會(huì)導(dǎo)致酶活性位點(diǎn)立體阻礙，致使酶與底物不能完美結(jié)合，酶活力會(huì)降低甚至失活。為了提高葡萄糖氧化酶耐氧化特性，可以采用不易被氧化且體積較小氨基酸進(jìn)行突變，例如亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）、異亮氨酸（Ile）、丙氨酸（Ala）、蘇氨酸（Thr）[18]。理論上來說，甲硫氨酸突變?yōu)榱涟彼?，提高蛋白質(zhì)的疏水性，減少空間位置阻力，增強(qiáng)酶和底物的相互作用，在酶促反應(yīng)中，底物過渡態(tài)的電荷與酶蛋白活性中心附近的電荷有相互作用，蛋白質(zhì)細(xì)微結(jié)構(gòu)的變化也會(huì)影響到基態(tài)和過渡態(tài)之間的能量差，而影響反應(yīng)的活化能。葡萄糖氧化酶反應(yīng)包括氧化半反應(yīng)和還原半反應(yīng)，有多個(gè)證據(jù)指明His516是主要催化基團(tuán)。His516，His559和Glu412是參與酶反應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸殘基。通過對GOD酶分子3-D結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，M305，M524，M556和M582是位于活性位點(diǎn)周圍的4個(gè)Met位點(diǎn)，見圖1。對這4個(gè)Met殘基的分子改造可能對葡萄糖氧化酶耐氧化提高具有關(guān)鍵性的作用。

圖1 葡萄糖氧化酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Model structure of glucose oxidase

2.2 重組葡萄糖氧化酶菌株的構(gòu)建、篩選表達(dá)和重組葡萄糖氧化酶的純化

以含有野生型葡萄糖氧化酶基因的重組質(zhì)粒pPIC9K-GOD為模板，利用互補(bǔ)PCR引物擴(kuò)增，得到含有突變的雙鏈環(huán)，轉(zhuǎn)化E.coli JM109中。通過氨芐抗性篩選和測序分析，確定突變位點(diǎn)與目標(biāo)設(shè)計(jì)的突變位點(diǎn)一致。

將測序正確的 4個(gè)突變體轉(zhuǎn)化到 P.pastoris GS115中進(jìn)行表達(dá)。通過利用不同濃度梯度的遺傳霉素的平板篩選方法，篩選到具有高拷貝數(shù)的陽性轉(zhuǎn)化子，并通過搖瓶發(fā)酵使得突變酶分泌表達(dá)。

突變體粗酶液經(jīng)過陰離子柱純化后，收集的酶蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示單一條帶，說明已經(jīng)純化到相對分子質(zhì)量約為66 000的均一目的蛋白質(zhì)條帶，從而可以進(jìn)行下一步的酶學(xué)性質(zhì)研究，見圖2。

圖2 GOD純化后的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE analysis of glucose oxidase

2.3 突變酶與野生型葡萄糖氧化酶耐氧化性比較

對于確定酶的耐氧化性的方法，目前較常用的是比較其在不同濃度過氧化氫條件下的穩(wěn)定性。葡萄糖氧化酶在反應(yīng)過程中會(huì)產(chǎn)生過氧化氫，酶活測定原理一般是通過測定所產(chǎn)生的過氧化氫的量來計(jì)算酶活，如果直接用液體酶液，在測定剩余酶活時(shí)會(huì)產(chǎn)生誤差。因此，首先通過無載體交聯(lián)固定化的方法將葡萄糖氧化酶固定，把固定化酶放入不同濃度的過氧化氫中一段時(shí)間后，將固定化酶離心，用緩沖液洗滌，重懸，然后測定固定化酶的剩余酶活，比較分子改造后的酶與野生型葡萄糖氧化酶的氧化穩(wěn)定性。

對不同濃度H2O2條件下葡萄糖氧化酶穩(wěn)定性變化見圖3。隨著H2O2濃度逐漸升高，葡萄糖氧化酶酶活殘留逐漸降低。同時(shí)相比于野生型葡萄糖氧化酶，突變酶的耐氧化性均有不同程度的提高。其中突變酶M556L在100 mmol/L和500 mmol/L過氧化氫存在下是對照酶的兩倍。

圖3 野生型葡萄糖氧化酶與突變酶的耐氧化性比較Fig.3 Oxidative stability of the wild-type and glucose oxidase mutants

結(jié)果表明，Met殘基在酶氧化敏感性方面的關(guān)鍵性。當(dāng)Met 556被Leu替代時(shí)，突變體酶的耐氧化性提高幅度最大。由此可以推斷，Met 556應(yīng)該是GOD耐氧化性提高的關(guān)鍵位點(diǎn)。Met殘基被氧化后氧化衍生物側(cè)鏈體積增大，導(dǎo)致活性位點(diǎn)空間位阻，由此可以致使酶活力降低甚至失活。Met 305位點(diǎn)雖然不位于酶催化區(qū)域中心，但其在酶催化中心附近，該位點(diǎn)被替代后突變體耐氧化性也獲得較大提高。

2.4 突變酶與野生型葡萄糖氧化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)比較

表1顯示，M556L和M305L的比酶活與野生型葡萄糖氧化酶相比都有所提高，其中突變酶M556L和M305L比酶活分別提高至野生型葡萄糖氧化酶的1.5倍和1.25倍；與野生型葡萄糖氧化酶相比，4個(gè)突變體的Km均降低，酶的Km值與酶底物結(jié)合能力相關(guān)。一般來說，Leu是小分子氨基酸，利用小分子氨基酸對其他大分子氨基酸進(jìn)行突變會(huì)導(dǎo)致酶的底物結(jié)合能力增加，其原因可能是由于突變后酶催化位點(diǎn)周圍靜電作用導(dǎo)致的。

表1 野生型葡萄糖氧化酶和突變酶的比酶活及動(dòng)力學(xué)常數(shù)Table 1 Kinetic parameters and specific activities of GOD and its mutants

多數(shù)情況下，耐氧化性定點(diǎn)突變會(huì)可能會(huì)導(dǎo)致酶的轉(zhuǎn)化數(shù)降低，突變體底物結(jié)合能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致酶kcat/Km增大。突變酶M556L和M305L的催化效率均有所提高，其中，M556L是對照菌株所產(chǎn)酶的2.08倍，M524L基本不變，而M582L略微降低。其中M556L在親和力提高了41.5%的情況下，轉(zhuǎn)化數(shù)也稍有提高，為21.7%。這可能是由于M556L比較靠近活性中心的關(guān)鍵催化氨基酸。類似的例子有Holland等通過對黑曲霉GOD基因進(jìn)行飽和突變發(fā)現(xiàn)，當(dāng)132位的蘇氨酸突變成絲氨酸時(shí)，特異性常數(shù)kcat/Km從8.39 mmol/（L·s）提高為23.8 mmol/（L·s），同時(shí)對底物親和力降低了3%[19]。本研究中突變酶M556L在未損失對底物親和力的同時(shí)，催化效率有所提高，具有較好的效果。

2.5 突變酶與野生型葡萄糖氧化酶酶學(xué)性質(zhì)比較2.5.1 最適pH值和酸堿穩(wěn)定性的分析 在35℃下測定野生型葡萄糖氧化酶和突變酶在pH 2.0~9.0時(shí)的酶活性，確定GOD的最適pH值，結(jié)果見圖4。葡萄糖氧化酶GOD耐氧化性分子改造前后，與野生型葡萄糖氧化酶相比，M524L和M556L最適pH無明顯變化，突變酶M305L、M582L的略有降低。

圖4 不同pH對GOD和突變體酶活性的影響Fig.4 Optimum pH value of the wild-type and glucose oxidase mutants

酸堿穩(wěn)定性結(jié)果見圖5。分子改造后突變體M305L、M582L穩(wěn)定pH范圍與野生型葡萄糖氧化酶相比較，沒有發(fā)生顯著變化。突變體M524L的穩(wěn)定pH范圍由5.0~6.0變寬至4.0~7.0。同時(shí)突變體M524L在pH 4.0或7.0條件下穩(wěn)定性也增強(qiáng)顯著。在pH 4.0條件下處理后，酶活殘留由野生型葡萄糖氧化酶的45.0%提高至60.1%；在pH 7.0條件下處理后，酶活殘留由野生型葡萄糖氧化酶的40.2%提高至58%。通常來說，大部分酶的pH作用范圍都比較窄，黑曲霉來源的葡萄糖氧化酶的pH作用范圍一般是5~6，偏酸性。pH穩(wěn)定性的提高對葡萄糖氧化酶實(shí)際應(yīng)用有重要作用。

圖5 不同pH對GOD和突變體穩(wěn)定性的影響Fig.5 pH stability of the wild-type and glucose oxidase mutants

2.5.2 最適溫度和熱穩(wěn)定性的分析 酶對溫度的改變非常敏感，酶活與溫度的變化一般是呈指數(shù)變化的。測定10、20、30、40、50、60、70℃的突變酶的酶活力，確定突變酶的最適反應(yīng)溫度。溫度對突變酶酶活的影響見圖6。突變酶的最適溫度是35℃，與野生型葡萄糖氧化酶相比基本不變。

圖6 野生型葡萄糖氧化酶與突變酶的最適反應(yīng)溫度比較Fig.6 Optimum temperature of the wild-type and glucose oxidase mutants

將野生型和突變株酶液分別放置于不同溫度中保溫30 min后，迅速放置冰上，并測定野生型葡萄糖氧化酶與突變酶的剩余酶活，評價(jià)酶的熱穩(wěn)定性。如圖7所示，野生型葡萄糖氧化酶與突變酶的酶活均有所降低，與野生型葡萄糖氧化酶相比，突變M524L的熱穩(wěn)定性更高，在60℃的條件下能夠保持52%的酶活力，同時(shí)M556L的熱穩(wěn)定性與野生型葡萄糖氧化酶相比也有所提高，在60℃，剩余酶活由40%提高到50%。

圖7 野生型葡萄糖氧化酶與突變酶熱穩(wěn)定性比較Fig.7 Thermostability of the wild-type and glucose oxidase mutants

3 結(jié)語

Met 305、Met 556、Met 524和Met 582氨基酸殘基分別通過單點(diǎn)突變替代成Leu后，突變體耐氧化性均有所提高。這進(jìn)一步證明位于活性位點(diǎn)周圍的4個(gè)Met位點(diǎn)對該酶的耐氧化性提高具有重要影響?；钚灾行母浇陌被釟埢难趸敲富钍艿揭种频脑蛑唬被崽鎿Q可以增強(qiáng)酶的耐氧化性，提高酶的穩(wěn)定性。

多數(shù)情況下，耐氧化性定點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致突變體底物結(jié)合能力增強(qiáng)，從而引起酶kcat/Km增大，提高酶的催化能力。這一觀點(diǎn)在本研究中得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證。突變株M556L在未損失酶與底物親和力的情況下產(chǎn)酶的催化效率是野生型葡萄糖氧化酶的2.08倍，這使得該突變株非常具有應(yīng)用前景。底物結(jié)合能力增加可能是由于突變后酶催化位點(diǎn)周圍靜電作用導(dǎo)致的。

葡萄糖氧化酶在實(shí)際應(yīng)用中易被氧化、穩(wěn)定性差的報(bào)道較多，但并未提到具體的解決方法以提高該酶的耐氧化性。作者參考了其它酶的研究方法，通過一定的改進(jìn)，對葡萄糖氧化酶的定向改造進(jìn)行探討，提高了該酶對過氧化氫的耐受力，獲得了穩(wěn)定性好、催化效率高的突變體，為其工業(yè)化應(yīng)用奠定了的基礎(chǔ)，也為今后對該酶的研究提供了新的線索和方向。

[1]BANKAR SB，BULE MV，SINGHALR S，etal.Glucose oxidase-an overview[J].Biotechnology Advances，2009，27：489-501.

[2]CAVALCANTI A，SHIRINZADEH B，KRETLY L C.Medical nanorobotics for diabetes control[J].Nanomedicine：Nanotechnology，Biology and Medicine，2008，4：127-138.

[3]LIU Q，XU X，REN G，et al.Enzymatic biofuel cells[J].Prog Chem，2006，18：1530-1537.

[4]WONG C M，WONG K H，CHEN X D.Glucose oxidase：natural occurrence，function，properties and industrial applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2008，78：927-938.

[5]BHATTI H N，SALEEM N.Characterization of glucose oxidase from Penicillium notatum[J].Food Technology and Biotechnology，2009，47：331.

[6]BAO J，KOUMATSU K，F(xiàn)URUMOTO K.Deactivation kinetics of immobilized glucose oxidase for production of calcium gluconate in an external loop airlift bioreactor[J].Biochemical Engineering Journal，2004，22：33-41.

[7]YANG H，LIU L，WANG M，et al.Structure-based engineering of methionine residues in the catalytic cores of alkaline amylase from Alkalimonas amylolytica for improved oxidative stability[J].Applied and Environmental Microbiology，2012，78：7519-7526.

[8]KHEMAKHEM B，ALI M B，AGHAJARI N，et al.Engineering of the α-amylase from Geobacillus stearothermophilus US100 for detergent incorporation[J].Biotechnology and Bioengineering，2009，102：380-389.

[9]PENG I，LO K Y，HSU C H，et al.Increasing the storage and oxidation stabilities of N-acyl-D-amino acid amidohydrolase bysite-directed mutagenesis of critical methionine residues[J].Process Biochemistry，2012，47：1785-1790.

[10]ZHU Z，WANG M，GAUTAM A，etal.Directed evolution ofglucose oxidase from Aspergillus nigerfor ferrocenemethanol-mediated electron transfer[J].Biotechnology Journal，2007，2：241-248.

[11]PRODANOVIC R，OSTAFE R，SCACIOC A，et al.Ultrahigh throughput screening system for directed glucose oxidase evolution in yeast cells[J].Combinatorial Chemistry&High Throughput Screening，2011，14：55-60.

[12]HORAGUCHI Y，SAITO S，KOJIMA K，et al.Construction of mutant glucose oxidases with increased dye-mediated dehydrogenase activity[J].International Journal of Molecular Sciences，2012，13：14149-14157.

[13]Leskovac V，Trivic S，Wohlfahrt G，et al.Glucose oxidase from Aspergillus niger：the mechanism of action with molecular oxygen，quinones，andone-electronacceptors[J].The International Journal of Biochemistry&Cell Biology，2005，37：731-750.

[14]HECHT H，KALISZ H，HENDLE J，et al.Crystal structure of glucose oxidase from Aspergillus niger Refined at 2.3 ? reslution [J].Journal of Molecular Biology，1993，229：153-172.

[15]CREGG J M，HIGGINS D R.Pichia Protocols[M].New Jersey：Humana Press，2007.

[16]SANDIP B.BANKAR，Mahesh V.Bule，Rekha S.Singhal.Optimization of Aspergillus niger fermentation for the production of glucose oxidase[J].Food Bioprocess Technology，2009，2：344-352.

[17]VOGTW.Oxidationofmethionylresiduesinproteins：tools，targets，andreversal[J].Free Radical Biology and Medicine，1995，18：93-105.

[18]LIN L L，LO H F，CHIANG W Y，et al.Replacement of methionine 208 in a truncated Bacillus sp.TS-23 α-amylase with oxidation-resistant leucine enhances its resistance to hydrogen peroxide[J].Current Microbiology，2003，46：211-216.

[19]劉瑜，李丕武.黑曲霉葡萄糖氧化酶高產(chǎn)基因工程菌研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2013，7：4. LIU Yu，LI Peiwu.Review on high-level Aspergillus niger glucose oxidase production engineering strains[J].Biotechology Bulletin，2013，7：4.（in Chinese）

Enhancing Oxidative Stability of Glucose Oxidase from Aspergillus niger by Site-Directed Mutagenesis

WEN Yifan1，2， GU Lei1，2， ZHANG Juan1，2， DU Guocheng*1，2
(1.SchoolofBiotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2. Key Laboratory ofIndustrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Aiming to improve the catalytic activity and oxidative stability of glucose oxidase from Aspergillus niger.This work conducted site-directed mutagenesis based on an analysis of the protein structure.Four methionines（M582L，M524L，M556L and M305L）were selected as the mutation sites and individually replaced with leucine.The native GOD and the mutated GOD were separately expressed in P.pastoris GS115.In the presence of H2O2（10 mM，20 mM，50 mM，100 mM，and 500 mM）at 35℃for 2 h，the oxidative stability of the mutants increased compared to the wild-type under most of the circumstances.Meanwhile，M556L showed a higher（2 folds than the wild-type）oxidative stability of all in the presence of both 100 mM and 500 mM H2O2for 2 h.Compared to the wild-type enzyme，the kcat/Kmvalue of M556L increased（2.08 folds than the wild-type）.The thermol stability of the mutants remained unchanged while the stable pH range of M524L was extended from4.0-6.0 to 3.0-7.0 compared to the wild-type.It is a fact that a more stable enzyme with higher oxidative stability is an ideal choice in most of the industrial application of GOD.

recombinant，glucose oxidase，site-directed mutagenesis，Aspergillus niger，Pichia pastoris

Q 939.97

A

1673—1689（2016）12—1260—08

2014-09-27

國家863計(jì)劃項(xiàng)目（2011AA100905）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31470160）。

*通信作者：堵國成（1965—），男，江蘇常州人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵過程優(yōu)化與控制、酶工程與技術(shù)、代謝工程技術(shù)方面的研究。E-mail：gcdu@jiangnan.edu.cn