粘紅酵母酪氨酸解氨酶在大腸桿菌中的異源表達

劉沛然， 堵國成， 周景文， 陳 堅*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

粘紅酵母酪氨酸解氨酶在大腸桿菌中的異源表達

劉沛然1，2， 堵國成1，2， 周景文1，2， 陳 堅*1，2

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

酪氨酸解氨酶是苯丙氨酸代謝途徑的關(guān)鍵酶之一。酪氨酸經(jīng)其催化生成對香豆酸，可進一步生成白藜蘆醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素類天然產(chǎn)物。作者選取來源于粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）的酪氨酸解氨酶，對其基因進行大腸桿菌（Escherichia coli）密碼子偏好性優(yōu)化，合成基因后于E.coli BL21（DE3）中成功表達。經(jīng)過硫酸銨分級沉淀、QFF陰離子交換層析、分子篩純化后得到了純化的酪氨酸解氨酶，比酶活達到1.78 U/mg。在相同的培養(yǎng)條件下，以不同的質(zhì)粒作為表達載體，獲得了不同的對香豆酸產(chǎn)量。其中以酪氨酸為底物發(fā)酵24 h，當以pET-32a（+）作為表達載體時，獲得最高的對香豆酸產(chǎn)量196.3 mg/L。經(jīng)密碼子優(yōu)化后的酪氨酸解氨酶基因可更好地應(yīng)用于苯丙素類物質(zhì)的合成途徑構(gòu)建，不同載體的應(yīng)用也為生物法生產(chǎn)對香豆酸提供了更多的選擇依據(jù)。

酪氨酸解氨酶；粘紅酵母；大腸桿菌；異源表達

對香豆酸（p-Coumaric acid），又名對羥基肉桂酸，是一種天然酚類，在植物中廣泛存在。對香豆酸具有抗菌[1]、抗癌[2]、抗氧化[3]、抗心血管疾病[3]及利膽利肝[4]等生理活性及藥用功能。對香豆酸也是醫(yī)藥與香料工業(yè)中常用的中間體，是多種具有較高商業(yè)價值的苯丙素類藥物、香精、化妝品、營養(yǎng)保健品的合成前體物質(zhì)[5]。目前常見的對香豆酸生產(chǎn)方法為化學(xué)合成法，但其有反應(yīng)溫度高、能耗大、有毒物質(zhì)參與等缺點[6]。因此，生物法生產(chǎn)對香豆酸因其環(huán)保、快捷、無季節(jié)限制等優(yōu)點成為更好的選擇。

在生物體內(nèi)，對香豆酸的合成有兩條途徑。一是以苯丙氨酸為底物，經(jīng)苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）催化生成肉桂酸 （Cinnamic acid），再經(jīng)細胞色素 P450酶系（CYP450）催化生成對香豆酸（p-Coumaric acid）[7]。而部分苯丙氨酸解氨酶被發(fā)現(xiàn)可以直接催化酪氨酸，生成對香豆酸，成為對香豆酸合成的另一途經(jīng)，催化反應(yīng)的酶也因此被命名為酪氨酸解氨酶（Tyrosine ammonia-lyase，TAL）[8]。在利用微生物生產(chǎn)對香豆酸時，以酪氨酸為底物，經(jīng)TAL一步催化生產(chǎn)對香豆酸是較為快捷的途徑。

除了在植物體內(nèi)存在，微生物體內(nèi)也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了 TAL的存在，如莢膜紅細菌（Rhodobacter capsulatus）[9]、 球 形 紅 細 菌 （Rhodobacters sphaeroides）[10]、絲孢酵母 （Trichosporon cutaneum）[11]、黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）[12]等。其中，來源于粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）的TAL具有較高的胞內(nèi)酶活力 （0.014 3 U/mg蛋白）和最低的PAL/TAL活性比系數(shù)（1.68）[13]。因此，作者以RgTAL為對象，進行密碼子偏好性優(yōu)化后在大腸桿菌（Escherichia coli）中表達，對RgTAL進行純化及酶學(xué)性質(zhì)的分析。此外，基于不同的表達載體，考察TAL催化酪氨酸產(chǎn)對香豆酸的情況。TAL的表達不僅實現(xiàn)了利用大腸桿菌生產(chǎn)對香豆酸，更為苯丙素類物質(zhì)的合成途徑構(gòu)建提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 菌株 E.coli JM109、E.coli BL21（DE3）及質(zhì)粒pET-32a（+）（Ampr）、pETDuet-1（Ampr）、pET-28a（+）（Kanr）、pACYCDuet-1（Cmr）、pRSFDuet-1（Kanr）、pCDFDuet-1（Smr）：均為作者所在實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑 KOD DNA聚合酶、DNA連接酶：TOYOBO東洋紡公司；氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、鏈霉素、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、M9CA培養(yǎng)基、質(zhì)粒提取試劑盒、感受態(tài)細胞制備試劑盒：上海生工生物公司；蛋白胨、酵母提取物：Oxoid公司；標準相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)上樣緩沖液、SDS-PAGE預(yù)制膠：Life Technologies公司；其它試劑均為國產(chǎn)或進口分裝。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）LB培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，高壓蒸汽滅菌。

2）TB培養(yǎng)基：12 g/L蛋白胨、24 g/L酵母提取物、10 g/L甘 油、17 mmol/L KH2PO4、72 mmol/L K2HPO4。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基：13.3 g/L M9CA培養(yǎng)基、2 g/L葡萄糖、1 mmol/L硫酸鎂、0.5 μg/mL鹽酸硫胺素，過濾除菌。

1.2 實驗方法

1.2.1 載體構(gòu)建 根據(jù)已知的RgTAL核酸序列[14]，利用http：//www.jcat.de/進行密碼子優(yōu)化，使其具有大腸桿菌密碼子偏好性。于基因兩端添加NcoI、XhoI酶切位點，形成pUC57-TAL克隆載體（基因合成由南京金斯瑞公司完成）。載體構(gòu)建采用分別雙酶切基因與載體后連接的方法進行。基因的酶切、連接、轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒的提取等操作步驟參照相應(yīng)試劑盒說明書進行。取菌液提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行雙酶切，核酸電泳驗證陽性克隆子。

1.2.2 誘導(dǎo)表達及胞內(nèi)粗酶液的制備 將菌液在相應(yīng)抗性的平板上劃線純化。挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基，37℃、220 r/min過夜培養(yǎng)（8~12 h）。以1%的接種體積分數(shù)轉(zhuǎn)接于TB培養(yǎng)基，37℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.8，冷卻至25℃后加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。取誘導(dǎo)培養(yǎng)一定時間的菌液，8 000 r/min離心收集菌體，以Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 8.5）洗滌兩次后重懸。利用超聲破碎儀破碎菌體至澄清，10 000 r/min離心后收集上清液，即為胞內(nèi)粗酶液。

1.2.3 純化方法 采用硫酸銨沉淀、陰離子交換層析、分子篩對TAL進行純化。收集200 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h的菌液，重懸于Tris-HCl緩沖液，超聲破碎后離心取上清液，進行硫酸銨分級沉淀。取飽和度為40%~60%的沉淀部分，以Tris-HCl緩沖液溶解后進行透析。經(jīng)過4次透析液的替換，透析約8~12 h后，使用微孔濾膜 （0.22 μm）處理酶液，進一步利用AKTA蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)進行純化。首先利用陰離子交換層析對酶液進行純化（Hitrap QFF，1 mL）。上樣緩沖液（A液）為50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，洗脫緩沖液（B液）為含1 mol/L NaCl的50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液。以A液平衡柱子后上樣，以15% B液洗去雜蛋白質(zhì)，15%~40%線性洗脫10 CV，收集洗脫蛋白質(zhì)。對收集的各段洗脫液進行酶活測定及SDS-PAGE分析，確定B液濃度為25%~33%時為目的蛋白質(zhì)的洗脫峰。進一步利用分子篩（HiLoad 16/60 Superdex 200）進行純化，對得到的洗脫峰進行酶活及SDS-PAGE分析，可得到純度較高的酶液。

1.2.4 酶活測定、動力學(xué)及熱穩(wěn)定性分析 測定酶活的反應(yīng)體系為1 mL，包含100 uL酶液、500 μL酪氨酸 （4 mmol/L），400 μL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 8.5），反應(yīng)液置恒溫40℃反應(yīng)30 min，測其310 nm處吸光度[15]。1 min內(nèi)生成1 μmol對香豆酸的酶量被定義為一個酶活單位。為測定動力學(xué)常數(shù)Km值的大小，在酶反應(yīng)體系中添加不同濃度的酪氨酸，使其終濃度為0.2~3.8 mmol/L，在相同條件下進行反應(yīng)，根據(jù)米氏方程，利用OriginPro 8.6軟件擬合后得到Km值的大小。對于蛋白的熱穩(wěn)定性分析，利用差示掃描量熱儀（MicroCal VP-Capillary DSC，GE）對TAL的變性溫度（Tm值）進行測定，操作步驟按照儀器說明書進行，掃描范圍為20~100℃，掃描速度為5 s/℃。

1.2.5 發(fā)酵生產(chǎn)對香豆酸 在相應(yīng)抗性的平板上對菌體進行劃線純化。挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基，37℃、220 r/min過夜培養(yǎng)（8~12 h）。以4%的接種體積分數(shù)轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基，以500 mmol/L的酪氨酸為底物，添加0.4 mmol/L IPTG，28℃進行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后離心發(fā)酵液，取上清液，利用高效液 相 色 譜 法 （High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定產(chǎn)物對香豆酸的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 表達載體的構(gòu)建

分別以限制性內(nèi)切酶 NcoI、XhoI雙酶切pUC57-TAL及大腸桿菌表達質(zhì)粒pET-32a（+）、pETDuet-1、pET-28a（+）、pACYCDuet-1、pRSFDuet-1、pCDFDuet-1，兩片段連接后得到重組質(zhì)粒，分別命 名 為 pET32a-TAL、pET-TAL、pET28a-TAL、pACYC-TAL、pRSF-TAL及pCDF-TAL，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）進行蛋白質(zhì)表達，見圖1。提取質(zhì)粒雙酶切驗證，核酸電泳得到2 000 bp左右的條帶，與Rgtal基因大?。? 082 bp）一致，見圖2。前期構(gòu)建載體過程中，為便于純化，曾設(shè)計引物使TAL與質(zhì)粒上的His-tag標簽融合表達。但利用標簽純化后的目的蛋白質(zhì)無法達到電泳純級別，因此改變酶切位點及引物，使重組蛋白質(zhì)兩端不帶有標簽，并改變純化方法，以獲得電泳純級別的蛋白質(zhì)。

2.2 誘導(dǎo)表達及酶活檢測

將含有表達載體的菌株在LB培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接TB培養(yǎng)基，待OD600達到0.8~1，以0.4 mmol/L的IPTG于25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。取培養(yǎng)12 h的菌體，以Tris-HCl緩沖液洗滌、重懸后超聲破碎。破碎后離心取上清液即為胞內(nèi)粗酶液，分別進行SDS-PAGE及酶活檢測。TAL蛋白質(zhì)的理論大小為75 000，pET32a載體啟動子后第一個起始密碼子距離NcoI酶切位點有約150 bp的距離，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄翻譯后的TAL蛋白質(zhì)變大，如圖3中1號泳道所示。連接在其他載體上的蛋白質(zhì)則維持原蛋白質(zhì)大小，如圖3中2~6號泳道所示。SDS-PAGE電泳得到的目的條帶明顯，說明蛋白質(zhì)得到了較好的表達。由目的蛋白質(zhì)電泳條帶的差異也不難看出，含有載體pET32a-TAL（1號泳道）的重組菌目的蛋白質(zhì)表達量最高，其次為pET-TAL及pCDF-TAL（2號、6號泳道），含有載體 pET28a-TAL、pACYC-TAL及pRSF-TAL（3-5號泳道）的表達量相對較低。檢測重組菌胞內(nèi)酶活，結(jié)果見表1，與胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)表達量的大小差異基本一致。

圖1 表達載體構(gòu)建示意Fig.1 Maps of different expression vectors

圖2 表達載體酶切驗證瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of expression vectors

圖3 基于不同載體的TAL蛋白質(zhì)表達SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysisofTAL withdifferent expression vectors

表1 基于不同表達載體的重組菌胞內(nèi)酶活Table 1 Enzyme activity ofstrains with differentexpression vectors

2.3 TAL的純化及性質(zhì)分析

TAL的純化過程經(jīng)由硫酸銨分級沉淀、陰離子柱純化、分子篩純化三個步驟。大腸桿菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)種類多、含量高，因此采用硫酸銨分級沉淀法，達到去除部分雜蛋白質(zhì)、濃縮目的蛋白質(zhì)的效果。經(jīng)酶活檢測及SDS-PAGE驗證，在硫酸銨濃度為40% ~60%時，目的蛋白質(zhì)析出。利用陰離子柱Hitrap QFF對蛋白質(zhì)進行純化，線性洗脫得到目的蛋白質(zhì)。進一步利用分子篩HiLoad 16/60 Superdex 200進行純化，得到單一的目的蛋白質(zhì)條帶，見圖4。對純化后的蛋白質(zhì)進行動力學(xué)分析，得到其Km值為382 μmol/L，Vmax值為0.91 μmol/（min·mg）。利用差示掃描量熱法測得TAL的變性溫度為 （73±2）℃，見圖5。

2.4 基于不同表達載體的發(fā)酵產(chǎn)對香豆酸對比

將含有不同載體的重組質(zhì)粒菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)，添加500 mmol/L的酪氨酸為底物，0.4 mmol/L IPTG、25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。含有pET32a-TAL、pET-TAL、pET28a-TAL、pACYC-TAL、pRSFTAL及pCDF-TAL的BL21菌株經(jīng)24 h誘導(dǎo)培養(yǎng)后，對香豆酸產(chǎn)量分別為196.3、170.8、108.2、48.7、89.6、168.8 mg/L，見圖6。由圖6可知，對香豆酸產(chǎn)量由大到小對應(yīng)的表達載體為pET32a-TAL＞pETTAL＞pCDF-TAL＞pET28a-TAL＞pRSF-TAL＞pACYC-TAL，與胞內(nèi)酶活的大小對比排序一致。在相同的誘導(dǎo)條件下，載體拷貝數(shù)、表達特定蛋白質(zhì)能力的差異均可影響蛋白質(zhì)表達，導(dǎo)致相同誘導(dǎo)條件下發(fā)酵所得對香豆酸產(chǎn)量的差異。在本研究涉及到的6種不同載體中，皆以T7啟動子作為表達的起始，而由圖1中pET32a-TAL的載體構(gòu)建示意圖可知，pET-32a（+）的T7啟動子與目的蛋白TAL之間存在一段序列。這段可與TAL融合表達的蛋白質(zhì)為硫氧還蛋白質(zhì)（TrxA-Tag），起到了增加可溶性蛋白質(zhì)比例的作用，因此含有載體pET32a-TAL的菌株得到了對香豆酸的最高產(chǎn)量196.3 mg/L。未經(jīng)密碼子優(yōu)化的Rgtal基因在大腸桿菌中表達，發(fā)酵24 h獲得了630 μmol/L（103 mg/L）的對香豆酸產(chǎn)量[13]。與之相比，含有pET32a-TAL表達載體的重組菌獲得的對香豆酸產(chǎn)量提高了1.9倍。

圖4 TAL純化過程的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the purification process of the TAL

圖5 TAL酶的差示掃描量熱曲線Fig.5 DSC curve of enzyme TAL

圖6 基于不同載體重組菌的酶活及發(fā)酵產(chǎn)對香豆酸情況Fig.6 Enzyme activity and p-coumaric acid production from strains with different expression vectors

3 結(jié)語

植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、臨床、化工、營養(yǎng)品等領(lǐng)域都有著重要的作用和廣泛的應(yīng)用。作為植物苯丙氨酸代謝途徑的重要中間產(chǎn)物，對香豆酸自身具有抗癌、抗氧化等作用，也是多種苯丙素類化合物的合成前體。酪氨酸解氨酶（TAL）可經(jīng)一步反應(yīng)由酪氨酸催化生產(chǎn)對香豆酸。為了實現(xiàn)對香豆酸在微生物體內(nèi)的高效積累，針對TAL的研究集中于發(fā)掘不同微生物來源的TAL，但其在宿主中的酶活較低。Vannelli等測定9種真菌的胞內(nèi)TAL活性，其酶活處于0.01～0.7 U/mg之間[11]，來源于R.glutinis的TAL酶活為 0.014 3 U/mg，然而其具有最低的PAL/TAL活性比系數(shù)（1.68）。因此，作者對來源于R.glutinis的TAL基因進行密碼子優(yōu)化并于大腸桿菌中實現(xiàn)了異源表達。對TAL進行純化后，比酶活達到1.78 U/mg，高于原始菌的酶活0.014 3 U/mg[13]。同時，基于6種不同的原核表達體系，分別構(gòu)建表達載體。將含有不同表達載體的重組菌發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)對香豆酸的產(chǎn)量產(chǎn)生差異。這說明由于質(zhì)?？截悢?shù)、載體元件、融合蛋白效應(yīng)等原因，基因的表達及其導(dǎo)致的發(fā)酵產(chǎn)量會產(chǎn)生不同程度的變化，這也為基于不同表達載體進行表達調(diào)控提供了依據(jù)和基礎(chǔ)。用于微生物轉(zhuǎn)化的TAL還存在著催化效率不理想、酶活性較低的缺點?？赏ㄟ^結(jié)構(gòu)性質(zhì)分析、基因突變、固定化等方法，實現(xiàn)TAL酶活性的提高，更好地應(yīng)用于天然產(chǎn)物的生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化。

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Heterologous Expression of Tyrosine Ammonia Lyase from Rhodotorula glutinis in Escherichia coli

LIU Peiran1，2， DU Guocheng1，2， ZHOU Jingwen1，2， CHEN Jian*1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

As one of the key enzyme in the phenylalanine metabolism pathway，tyrosine ammonia-lyase（TAL）catalyzes the formation of p-coumaric acid from L-tyrosine.p-Coumaric acid serves as a precursor of a wide array of anti-oxidative and anti-aging natural phenylpropanoid products，such as resveratrol and naringenin.In this study，the tal gene from Rhodotorula glutinis was selected，codon optimized and overexpressed in Escherichia coli BL21（DE3）.After treatment with ammonium sulfate precipitation，therecombinantTAL was purified with anion exchange chromatography and gel filtration chromatography，resulting in specific activity of 1.78 U/mg enzyme.Under the same culture conditions，different expression vectors were constructed to get different productions of p-coumaric acid.Among them，the strain with pET-32a（+）as expression vector gained the highest yield of p-coumaric acid，up to 196.3 mg/L after 24 h fermentation fromL-tyrosine.The optimized tal gene can facilitate the construction of phenylalanine metabolism pathway.Different expression vectors used in this study also offered more options for biological production of p-coumaric acid.

tyrosine ammonia lyase，Rhodotorula glutinis，Escherichia coli，heterologous expression

Q 814

A

1673—1689（2016）12—1241—06

2015-01-23

國家自然科學(xué)基金項目（31370130）；江南大學(xué)自主科研計劃重點項目（JUSRP51307A）。

*通信作者：陳 堅（1965—），男，江蘇揚州人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從食品生物技術(shù)及生化工程方面的研究。E-mail：jchen@jiangnan.edu.cn