miRNA21在潰瘍性結(jié)腸炎患者中表達(dá)的意義*

北京大學(xué)深圳醫(yī)院消化內(nèi)科 （廣東 深圳 518035）

何興楨 李 曦

miRNA21在潰瘍性結(jié)腸炎患者中表達(dá)的意義*

北京大學(xué)深圳醫(yī)院消化內(nèi)科 （廣東 深圳 518035）

何興楨 李 曦

目的研究潰瘍性結(jié)腸炎患者血清miRNA21的水平，并探討其在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)展中的意義。方法選取潰瘍性結(jié)腸炎患者25例及正常對(duì)照組20例，采用qRT-PCR方法檢測(cè)血清miRNA21的水平。結(jié)果潰瘍性結(jié)腸患者血清miRNA21的水平為1.32±0.24，正常對(duì)照組血清miRNA21的水平為1.11±0.17。潰瘍性結(jié)腸組有輕度升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論潰瘍性結(jié)腸炎患者血清miRNA21的表達(dá)上調(diào)，可能為潰瘍性結(jié)腸炎的治療及臨床診斷提供新的方向。

微小RNA21；潰瘍性結(jié)腸炎

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)中的一種，病變主要累及結(jié)直腸粘膜和粘膜下層，呈連續(xù)性彌漫性分布的慢性非特異性炎癥。近年來(lái)，我國(guó)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)[1]。2006年一項(xiàng)有關(guān)于潰瘍性結(jié)腸炎住院病例的回顧性分析顯示在中國(guó)潰瘍性結(jié)腸炎的患病率大約是11.6/10萬(wàn)[2]。目前潰瘍性結(jié)腸炎的病因和發(fā)病機(jī)制仍不明確，考慮可能與環(huán)境、遺傳、感染和免疫等多因素相互作用有關(guān)[3-5]。有研究認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎與微小RNA(MiRNA)參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控有關(guān)[6]。MicroRNA-21 (miR-21)作為在腫瘤及大多數(shù)炎癥性疾病中均顯著過表達(dá)的一種小分子核糖核酸[7-9]，本研究通過檢測(cè)其在潰瘍性結(jié)腸炎患者血清中的水平，與對(duì)照組對(duì)比，探討MicroRNA-21表達(dá)在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病及發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 一般資料收集2013年3月至2014年11月期間我院住院和門診就診病人。潰瘍性結(jié)腸炎患者入組標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病學(xué)組炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(2012廣州)制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷，所有入組患者均能確診為潰瘍性結(jié)腸炎(包括臨床類型、病情程度、病變范圍、病情分期、腸外表現(xiàn))。選取診斷潰瘍性結(jié)腸炎(活動(dòng)期，輕型或中型，E1或E2期)的患者。健康人入組標(biāo)準(zhǔn)：沒有嚴(yán)重器質(zhì)性病變，近期無(wú)感染病史的健康人群。

最后共收集符合條件的潰瘍性結(jié)腸炎組共25例，男性16例，女性9例，平均年齡(39.0±11.9)歲；正常對(duì)照組共20例，男性14例，女性6例，平均年齡(37.7±9.8)歲。

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)本的采集和處理：取得患者的血液標(biāo)本之后，將其放置直到血液凝固后析出血清，然后吸取上層液體和抗凝血液樣本，5000r/min，離心半徑10cm，離心15min，提取上清液

1.2.2 用常規(guī)qRT-PCR方法檢測(cè)方法：主要包括以下步驟：①總RNA提取，根據(jù)RNA提取試劑盒完成；②總RNA純度和完整性檢測(cè)；③逆轉(zhuǎn)錄；④定量PCR。大致具體過程如下：在采血后的24h內(nèi)，分別吸取200 μL血漿，使用miRcute miRNA提取試劑盒的操作方法，進(jìn)行miRNA的提取。完成后，吸取11μL的miRNA提取液，37℃反應(yīng)1h加多聚腺苷酸，然后吸取2μL反應(yīng)液37℃反應(yīng)1h進(jìn)行cDNA的合成。上述完成后，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法，檢測(cè)miR-21a的表達(dá)情況；采用20μL的反應(yīng)體系，每孔加入5μL的cDNA，0.5 μL上游引物和下游引物，10μL 2X stbr greenpcr master mix，6.5μL的雙蒸水。反應(yīng)條件如下：94℃反應(yīng)65s，94℃反應(yīng)15s，60℃反應(yīng)30s退火，72℃反應(yīng)32s延伸，反應(yīng)進(jìn)行42個(gè)循環(huán)。其中定量PCR用酶(SYBR Green PCR Master Mix)購(gòu)自TOYOBO公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料按均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)兩組患者血清miRNA21的水平進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

潰瘍性結(jié)腸患者血清miRNA21的水平為1.32±0.24，正常對(duì)照組血清miRNA21的水平為1.11±0.17，潰瘍性結(jié)腸組miRNA21的水平較正常對(duì)照組有輕度升高(t＝-3.036, P＝0.035)。

3 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎在西方國(guó)家的發(fā)病率較高，亞洲包括中國(guó)在內(nèi)的地區(qū)較西方國(guó)家低，但是近年來(lái)發(fā)病率呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。由于本病呈慢性過程，病程較長(zhǎng)，且大部分患者反復(fù)發(fā)作，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，對(duì)家庭和社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)。潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制目前還不明確，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生可能與炎癥損傷、免疫異常、遺傳等因素密切相關(guān)。針對(duì)遺傳因素，潰瘍性結(jié)腸炎與微小RNA關(guān)系已成為研究其發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性非蛋白編碼的小分子RNA，長(zhǎng)度約為18-25個(gè)核苷酸，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后水平性調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)，從而在細(xì)胞增值、分化、生長(zhǎng)發(fā)育以及凋亡等代謝過程中發(fā)揮重要作用[10]。McKenna LB等[11]研究發(fā)現(xiàn)Dicer1作為miRNA生成發(fā)展進(jìn)程中的關(guān)鍵酶，將該基因敲除后，模型小鼠的腸上皮細(xì)胞分化受損，防御功能受損，腸上皮細(xì)胞有大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，表明微小RNA在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展中起了重要的調(diào)節(jié)作用[11]。已發(fā)現(xiàn)許多的miRNA參與調(diào)節(jié)炎癥性反應(yīng)[12-14]，其中包括miR-21[12]，Gong等[14]揭示了miR-21有助于維持T細(xì)胞在正常效應(yīng)范圍，從而有助于在炎癥性反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。Wu[15]等使用miRNA基因芯片技術(shù)以及PCR技術(shù)分析炎癥性腸病患者和正常對(duì)照組患者腸粘膜組織的miRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-21在活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎患者中表達(dá)上調(diào)明顯。Takagi等[16]取12名活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎患者和12名健康對(duì)照者的結(jié)腸活檢標(biāo)本，檢測(cè)miRNA的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-15和miR-21的表達(dá)有上調(diào)。全基因組的關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)8個(gè)miRNA在潰瘍性結(jié)腸炎患者中明顯上調(diào)，其中包括參與腸道上皮屏障功能的miRNA-21[17]。本實(shí)驗(yàn)采用qRTPCR方法檢測(cè)潰瘍性結(jié)腸炎患者和健康對(duì)照組外周血的血清miRNA21，結(jié)果顯示潰瘍性結(jié)腸組miRNA21的水平較正常對(duì)照組有輕度升高(P＜0.05)。這和國(guó)內(nèi)外的眾多研究結(jié)果相符[15-17]。目前對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎患者，主張采用內(nèi)科綜合治療的手段[18]。探討miR-21的表達(dá)與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生的關(guān)系，有助于進(jìn)一步明確潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制，從而為潰瘍性結(jié)腸炎的治療及臨床診斷提供新的方向。

[1] Ng SC, Tang W, Ching JY, et al. Incidence and Phenotype of Inflammatory Bowel Disease Based onResultsFrom the Asia-Pacific Crohn's and Colitis Epidemiology Study[J]. Gastroenterology.2013;145(1):158-165.

[2] 王玉芳,歐陽(yáng)欽.3100例潰瘍性結(jié)腸炎住院病例回顧分析[J].中華消化雜志,2006,26(6):368-372.

[3] Fiocchi C. Genes and 'in-vironment': how will our concepts on the pathophysiology of inflammatory bowel disease develop in the future? [J].Dig Dis 2012; 30 (Suppl 3): 2-11.

[4] Mueller C. Danger-associated molecular patterns and inflammatory bowel disease: is there a connection?[J]. Dig Dis 2012; 30 (Suppl 3): 40-46.

[5] Bernstein CN. Why and where to look in the environment with regard to the etiology of infl ammatory bowel disease [J].Dig Dis 2012; 30 (Suppl 3): 28-32.

[6] Ventham NT,Kennedy NA, Nimmo ER, et al. Beyond Gene Discovery in Inflammatory Bowel Disease: The Emerging Role of Epigenetics [J].Gastroenterology.2013;145(2):293-308.

[7] Hatley ME, Patrick DM, Garcia MR, Richardson JA, Bassel-Duby R, et al. Modulation of K-Ras-dependent lung tumorigenesis by MicroRNA-21[J]. Cancer Cell.2010; 18(3): 282-293.

[8] Thum T, Gross C, Fiedler J, Fischer T, Kissler S, et al. MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signalling in fibroblasts [J]. Nature 2008;456(7224): 980-984.

[9] Asangani IA, Rasheed SA, Nikolova DA, Leupold JH, Colburn NH, et al. MicroRNA-21 (miR-21) post-transcriptionally downregulates tumor suppressor Pdcd4 and stimulates invasion, intravasation and metastasis in colorectal cancer [J].Oncogene 27(15): 2128-2136.

[10]WUWK ,LAWPT,LEECW, LEECW,et al. MicroRNA in colorectal cancer: from benchtop to bedside [J]. Carcinogenesis, 2011,32:247-253.

[11]McKenna LB,Schug J,Vourekas A,et al.MicroRNAs control intestinal epithelial differentiation, architecture, and barrier function[J]. Gastroenterology. 2010;139(5):1654-1664.

[12]Sheedy FJ, Palsson-McDermott E, Hennessy EJ. et al. Negative regulation of TLR4 via targeting of the proinflammatory tumor suppressor PDCD4 by the microRNA miR-21[J].Nat Immunol，2010,11(2) : 141-147.

[13]Liu G, Friggeri A, Yang Y, et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage in flammatory responses[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106( 37) : 15819-15824.

[14]Gong AY, Zhou R, Hu G, et al. MicroRNA-513 regulates B7-H1 translation and is involved in IFN-gamma-induced B7-H1 expression in cho langiocytes[J]. J Immunol, 2009,182(3) : 1325-1333.

[15]Wu F, Zikusoka M, Trindade A et al. MicroRNAs are differentially expressed in ulcerative colitis and alter expression of macrophage inflammatory peptide-2 alpha [J].Gastroenterology 2008; 135(5): 1624-1635. e24.

[16]Takagi T, Naito Y, Mizushima K, et al. Increased expression of microRNA in the inflamed colonic mucosa of patients with active ulcerative colitis[J].J Gastroenterol Hepatol, 2010, 25 (Suppl 1) :S129-S133.

[17]Chen WX, Ren LH, Shi RH. Implication of miRNAs for inflammatory bowel disease treatment: Systematic review[J]. World J Gastrointest Pathophysiol.2014;5(2):63-70.

[18]何旭, 龍毓靈, 范紅.重癥潰瘍性結(jié)腸炎內(nèi)科綜合治療 [J] 罕少疾病雜志,2001.8(4).

Analyze the Expression of miRNA21 in the Patients with Ulcerative Colitis*

HE Xing-zhen, LI Xi. Department of Gastroenterology Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China

ObjectiveAnalysis of miRNA21 in the patients with ulcerative colitis to investigate the pathogenesis of ulcerative colitis.Methods25 patients with ulcerative colitis and 20 healthy controls were detected. And the expression of miRNA21 was evaluated by using quantitative real-time polymerase chain reaction (QRT-PCR) analysis.ResultsmiRNA21 in serum of patients with ulcerative colitis was 1.32±0.24, higher than that 1.11±0.17 of the healthy control group, the difference had statistical signifcance (P＜0.05).ConclusionThe up-regulated expression of miRNA21 in the patients with ulcerative colitis might provide a new direction of therapy and clinical diagnosis for ulcerative colitis.

MiRNA21; Ulcerative Colitis

R574.1

A

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目，編號(hào)201302056

10.3969/j.issn.1009-3257.2016.01.011

2016-01-18

何興楨，女，消化內(nèi)科專業(yè)，主要研究方向：微小RNA在炎癥性腸病患者中差異性表達(dá)的機(jī)制及臨床意義。

李 曦