丹參注射液對人肝癌細胞14-3-3σ基因甲基化的影響

程 巍 高順良

丹參注射液對人肝癌細胞14-3-3σ基因甲基化的影響

程 巍 高順良

目的觀察肝癌組織14-3-3σ基因表達及其啟動子區(qū)域甲基化程度的改變，丹參注射液對人肝癌細胞株Huh-7細胞14-3-3σ基因表達及其啟動子區(qū)域甲基化的影響。方法收集2014—1月至2014年12月36例肝癌患者的肝癌組織及其癌旁組織，分別分離其RNA及DNA，針對14-3-3σ基因表達及其啟動子區(qū)域甲基化程度進行定量分析；使用丹參處理人肝癌細胞株Huh-7細胞，觀察丹參注射液處理后人肝癌細胞株Huh-7細胞侵襲能力及其14-3-3σ基因表達及其啟動子區(qū)域甲基化程度的改變。結果相較于癌旁組織，肝癌組織14-3-3σ基因的表達量顯著降低，且基因組DNA啟動子區(qū)域多個CpG位點呈連續(xù)性的甲基化水平增高；丹參注射液處理后人肝癌細胞株Huh-7細胞侵襲能力顯著降低；伴隨著14-3-3σ基因表達量增加，且其啟動子區(qū)域的多個CpG位點呈連續(xù)性的甲基化水平降低。結論肝癌組織14-3-3σ基因低表達與其啟動子區(qū)域的高甲基化水平相關；丹參注射液能抑制通過抑制14-3-3σ基因啟動子區(qū)域的多個CpG位點的甲基化，促進抑癌基因14-3-3σ表達，從而降低人肝癌細胞株Huh-7細胞的侵襲能力。

肝癌；14-3-3σ；DNA甲基化；丹參注射液

原發(fā)性肝癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，盡管隨著肝臟外科技術的進步，肝癌手術切除率明顯提高，但肝癌患者預后仍較差，5年生存率在40% ～50%左右[1-3]。原發(fā)性肝癌術后易于復發(fā)是影響其治療效果的難點，來自日本、法國和香港的研究報道，肝癌患者術后第一年復發(fā)20%～64%，術后三年內復發(fā)57%～81%[1-3]，復發(fā)病灶出現(xiàn)于殘肝，主要由于原發(fā)病灶肝內轉移或多中心發(fā)生，為了進一步提高肝癌患者根治術后的生存率，控制或減少復發(fā)是治療關鍵。腫瘤的耐藥性是導致復發(fā)最主要的原因，然而肝癌耐藥機制尚不明確。

DNA甲基化表觀遺傳學修飾的主要方式之一，它是指DNA的CG兩個核苷酸（CpG雙核苷酸）中的胞嘧啶被動的選擇性的添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC），這種序列的改變多發(fā)生于基因的5’-非編碼區(qū)，位于基因啟動的核心序列或者轉錄起始位點附近，并成簇存在[4]。它可以隨著DNA的復制而遺傳。DNA甲基化能引起染色質結構、DNA構象、DNA和基因組的穩(wěn)定性改變，從而影響基因的表達?；蚪MDNA的甲基化水平異常，多伴隨著基因組DNA的不穩(wěn)定性，與多種復雜疾病如糖尿病、前列腺癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關。

14-3-3σ基因主要存在于上皮細胞中，是14-3-3家族蛋白的一員，通過與多種信號分子相互作用，參與細胞的新陳代謝，細胞周期與凋亡，基因轉錄調控及信號轉導等多種生理及病理活動，尤其在DNA損傷后的細胞周期G2期阻滯，細胞分化中發(fā)揮重要作用[5]。研究[5]表明，14-3-3σ基因的異常表達主要與P53異常誘導或異常甲基化改變相關。本研究探討丹參對人肝癌細胞14-3-3σ基因甲基化的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 收治2014年1月—2014年12月經(jīng)過病理診斷為原發(fā)性肝細胞性肝癌的肝癌患者36例，收集每位入組對象的癌組織及癌旁組織。所有樣本收取均得到患者的同意。

1.2 細胞處理 Huh-7細胞系購自上海中科院，細胞庫，丹參處理組：加入終濃度為50mg/L丹參。

1.3 藥物及試劑 丹參注射液（規(guī)格：1mL/支），購自四川三精升和制藥有限公司，定量PCR購自TAKARA公司。

1.4 方 法

1.4.1 RT-實時定量PCR反應 使用日本TAKARA公司RNAiso Plus提取樣本中的RNA，總RNA采用PrimeScriptRT reagentKit（TAKARA公司）將1000ng純化的RNA逆轉錄合成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq Kit（TAKARA公司），10μL PCR反應體系組成如下。除cDNA外各成分按標本例數(shù)預混，分裝入各管，分別加入1μL的cDNA模板，以3dH2O代替cDNA作空白對照。PCR反應條件：預變性95℃ 10sec→熱循環(huán)95℃ 5sec，60℃ 30sec（共40個循環(huán)）。循環(huán)結果后，完成融解曲線，以檢驗PCR產(chǎn)物的純度。每個樣品重復3次，將得到的Ct值取平均值，以GAPDH的Ct平均值為內參照，計算14-3-3σ基因mRNA的相對量。實時熒光定量分析采用相對定量法，2-⊿ct⊿ct法。

1.4.2 MassARRAYTM EpiTYPER定量甲基化分析

使用天根組織/血液組織細胞基因組提取試劑盒分別提取肝癌，癌旁組織/人肝癌細胞株Huh-7細胞的基因組DNA，使用美國Zymo公司的試劑盒EZ DNA Methylation-Gold Ki（tZymo，catalog#D5006）對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽轉化，經(jīng)過試劑盒亞硫酸氫鹽處理之后，未甲基化的胞嘧啶（Cytosine，C）全部轉化為U[相當于DNA中的胸腺嘧啶（Thymine，T）]，而甲基化的胞嘧啶不受影響。具體操作步驟參照Zymo EZ DNA Methylation-Gold Kit推薦的操作步驟。使用UCSC Genome Browser查找14-3-3σ基因啟動子區(qū)域的CpG位點及Sequenom 公司推出的EpiDesigner軟件設計MassARRAYTM EpiTYPER定量甲基化引物。使用MassARRAYTM EpiTYPER定量甲基化平臺對選擇的靶基因進行定量甲基化水平的測定[6]。

1.4.3 細胞侵襲 6.5mm直徑8μm孔徑的Transwell孔鋪上Matrigel膠（用無血清的DMEM培養(yǎng)基1：5稀釋），置37°烘箱至少5h干燥。用5×104的細胞密度鋪板，上層加無血清的DMEM培養(yǎng)基，下層添加含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。48h后，未穿透的細胞用干凈棉球清洗，穿透下層Transwell孔的細胞用4%多聚甲醛固定，然后用結晶紫染色。

1.4.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0軟件。根據(jù)數(shù)據(jù)的正態(tài)或偏態(tài)分布及數(shù)據(jù)的類型，結果用均數(shù)±標準差（±s） 表示，根據(jù)數(shù)據(jù)的正態(tài)或偏態(tài)分布及數(shù)據(jù)的類型，采用Student t test或者non-parametric Mann-Whitney U tests比較各組數(shù)據(jù)的差異；對MassARRAYTM EpiTYPER DNA定量甲基化輸出的甲基化值均采用非參數(shù)統(tǒng)計方法Mann-Whitney U-test。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝癌與癌旁組織14-3-3σ基因表達情況、及其啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài) 肝癌組織14-3-3σ基因的表達水平顯著低于癌旁組織（封二圖1），MassARRAYTM EpiTYPER定量甲基化結果顯示，在肝癌組織14-3-3σ基因啟動子區(qū)域的多個CpG位點顯著（見表1）。提示有可能14-3-3σ基因在癌組織中受到抑制。

2.2 丹參對人肝癌細胞14-3-3σ基因表達及其啟動子區(qū)域CpG位點甲基化的影響 體外觀察發(fā)現(xiàn)，使用丹參處理肝癌細胞后48h，肝癌細胞的侵襲性明顯下降（封二圖2），因此我們進一步探討機制，發(fā)現(xiàn)使用丹參處理人肝癌Huh-7細胞48h可顯著上調抑癌基因14-3-3σ的表達（見表2），并且降低14-3-3σ基因啟動子區(qū)域CpG位點的甲基化水平（見表3）。

表1 肝癌與癌旁組織14-3-3σ基因表達及啟動子區(qū)域CpG位點定量甲基化狀態(tài)（%±s）

表1 肝癌與癌旁組織14-3-3σ基因表達及啟動子區(qū)域CpG位點定量甲基化狀態(tài)（%±s）

注：n=36，*P＜0.05

基因14-3-3σ_CpG_1 14-3-3σ_CpG_2.3.4 14-3-3σ_CpG_5.6.7 14-3-3σ_CpG_10.11.12.13 14-3-3σ_CpG_12.13 14-3-3σ_CpG_14.15.16癌旁組織10.28±10.8 38.10±11.7 32.83±15.3 45.47±13.2 26.21±14.8 21.47±10.7肝癌組織12.26±9.5 44.78±10.8 42.17±11.4 54.30±12.3 34.04±9.5 28.5±7.0 P值＞0.05 ＜0.05* ＜0.05* ＜0.05* ＜0.05* ＜0.05*

表2 丹參對肝癌細胞14-3-3σ基因表達的影響（±s）

表2 丹參對肝癌細胞14-3-3σ基因表達的影響（±s）

注：n=6，**P＜0.01

14-3-3σ相對表達量同型對照1.11±0.12丹參處理1.54±0.30 P值P＜0.01**

表3 丹參對14-3-3σ基因啟動子區(qū)域CpG位點甲基化程度的影響（%±s）

表3 丹參對14-3-3σ基因啟動子區(qū)域CpG位點甲基化程度的影響（%±s）

注：n=6，*P＜0.05

基因14-3-3σ_CpG_1 14-3-3σ_CpG_2.3.4 14-3-3σ_CpG_5.6.7 14-3-3σ_CpG_10.11.12.13 14-3-3σ_CpG_12.13 14-3-3σ_CpG_14.15.16同型對照5.88±3.7 63.12±9.5 39.75±10.0 51.62±6.7 29.75±8.6 36.88±8.8丹參處理7.75±6.5 51.3±9.2 29.00±8.9 42.75±5.9 15.00±7.5 18.25±3.8 P值＞0.05 ＜0.05* ＜0.05* ＜0.05* ＜0.05* ＜0.05*

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳學修飾的重要方式之一，具有高度時間和組織特異性。許多復雜疾病的發(fā)生，均與甲基化的改變相關。有研究報道，基因組的甲基化狀態(tài)改變會引起基因組的穩(wěn)定性的變化，從而引起疾病的發(fā)生。啟動子區(qū)域CpG島高甲基化導致抑癌基因失活，與對多種抗腫瘤藥物的耐藥性高度相關。

14-3-3σ被認為是一種抑癌基因，在控制細胞周期，修復DNA損傷及促細胞分化等具有廣泛的生理功能，直接參與人類腫瘤的形成與發(fā)展。研究表明，肝癌組織14-3-3σ基因的表達水平顯著降低，并伴隨著14-3-3σ基因啟動子區(qū)域的異常高甲基化[7]。這些位點的高甲基化可影響啟動子區(qū)域基因組結構的致密性，從而改變轉錄因子與之結合的能力，進而影響14-3-3σ基因的表達，無法表達相應的蛋白，發(fā)揮正常的抑癌功能。

丹參對細胞無損傷作用，但能增強化療藥物對腫瘤細胞毒性，能抑制糖蛋白功能，且藥源豐富，故認為丹參可能是有效且不良反應小的逆轉劑。體外實驗[8]證實，丹參酮對人ER陰性乳腺癌細胞抑制其生物學行為。本研究結果顯示，丹參處理人肝癌細胞48h后不僅能夠顯著上調抑癌基因14-3-3σ表達，并能顯著降低14-3-3σ基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。抑制癌細胞的侵襲能力。

［1］Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015［J］.CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.

［2］Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2015［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（1）：5-29.

［3］Cong WM，Wu MC.New insights into molecular diagnostic pathology of primary liver cancer：Advances and challenges ［J］.Cancer letters，2015，368（1）：14-19.

［4］Kanda M，Sugimoto H，Kodera Y.Genetic and epigenetic aspects of initiation and progression of hepatocellular carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2015，21（37）：10584-10597.

［5］Horie-Inoue K，Inoue S.Epigenetic and proteolytic inactivation of 14-3-3sigma in breast and prostate cancers［J］.Seminars in cancer biology，2006，16（3）：235-239.

［6］Watanabe T，Yachi K，Ohta T，et al.Non-promoter hypermethylation of zygote arrest 1（ZAR1）in human brain tumors ［J］.Brain tumor pathology，2011，28（3）：199-202.

［7］Wu YJ，Jan YJ，Ko BS，et al.Involvement of 14-3-3 Proteins in Regulating Tumor Progression of Hepatocellular Carcinoma［J］.Cancers（Basel），2015，7（2）：1022-1036.

［8］敬靜，鄭鴻，王靜，等.丹參酮ⅡA對人ER陰性乳腺癌細胞的生長抑制和多耐藥逆轉作用［J］.四川大學學報（醫(yī)學版），2007，38（3）：391-395.

（收稿：2015-10-22 修回：2016-03-10）

Effect of Radix Salviae Miltiorrhizae on DNA Methylation of 14-3-3σ in Human Hepatocellular Carcino-ma

CHENG Wei1,GAO Shunliang2. 1 Department of General Surgery, Longyou Hospital of TCM,Longyou (324400),China;2 Department of Hepatobiliary-Pancreatic Surgery,the Second Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou(310009),China

ObjectiveTo investigate the expression of 14-3-3σ and the methylation of its promoter in hepatocellular carcinomas（HCC）.To observe the effect that Salvia Miltiorrhiza on 14-3-3σ.MethodsHepatic cancer tissue and normal liver tissue were collected from 36 HCC patients between January 2014 and December 2014 to quantify the expression and methylation of 14-3-3σ.HCC cell line Huh-7 was treated with radix salvia miltiorrhiza to observe the change of the gene expression and methylation of 14-3-3σ.ResultsThe expression of 14-3-3σ significantly decreased in cancer tissue compared to that in the paired normal liver tissue.The DNA promoter CpG methylation was also increased.After treatment of radix salvia miltiorrhiza,the invasion of Huh-7 cells was reduced;the expression of 14-3-3σ was increased and the methylation was decreased.ConclusionThe low expression of 14-3-3σ is correlated with a high methylation level in HCC.Radix salvia miltiorrhiza can suppress the invasion of Huh-7 cells via inhibiting the promoter CpG methylation and increasing the expression of cancer suppressor gene 14-3-3σ.

hepatocellular carcinoma;14-3-3σ;DNA methylation;radix salvia miltiorrhiza injection

1浙江省龍游縣中醫(yī)院普外科（龍游324400）；2浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院肝膽胰外科（杭州 310009）

高順良，E-mail：gaoshunliang11112@126.com