雷公藤紅素抑制舌鱗癌細胞和人單核/巨噬細胞分泌血管內皮生長因子實驗研究

賴河青馮紅超宋宇峰

雷公藤紅素抑制舌鱗癌細胞和人單核/巨噬細胞分泌血管內皮生長因子實驗研究

賴河青1馮紅超2宋宇峰3

目的探討雷公藤紅素（Tri）對人單核/巨噬細胞（THP-1細胞）、舌鱗癌細胞（Tca8113細胞）分泌血管內皮生長因子（VEGF）、血管內皮生長因子-C（VEGF-C）的影響。方法在酸性微環(huán)境中，加入不同濃度的Tri，分別與Tca8113細胞、THP-1細胞+Tca8113細胞、THP-1細胞一起培養(yǎng)72h，ELISA法檢測細胞上清液中VEGF、VEGF-C含量，分析Tri對這兩種生長因子的影響。結果隨著Tri濃度以0、5、10、20、50μg/mL逐漸增高，各組的VEGF、VEGF-C值逐漸降低，且均與Tri濃度成負相關（P均＜0.001）。VEGF值：THP-1組分別為（57.41±2.13）、（53.12±1.23）、（46.43±2.11）、（44.24±1.14）、（38.15±0.93）μmol/L；Tca8113組分別為（61.45±2.73）、（58.14±1.63）、（55.33±2.15）、（50.22±1.66）、（41.11±1.45）μmol/L；THP-1+Tca8113組分別為（56.72±2.13）、（54.22±1.23）、（47.42± 2.14）、（43.52±1.16）、（39.12±0.83）μmol/L。VEGF-C值：THP-1組分別為（61.25±1.13）、（55.34± 2.11）、（51.23±1.30）、（48.22±2.13）、（45.21±1.62）μmol/L；Tca8113組分別為（61.33±2.16）、（57.43± 2.35）、（53.12±2.62）、（49.43±2.34）、（43.13±1.65）μmol/L；THP-1+Tca8113組分別為（60.35±2.13）、（55.74±2.15）、（50.13±1.61）、（47.42±2.14）、（40.11±1.55）μmol/L。THP-1+Tca8113細胞中各Tri劑量組VEGF、VEGF-C水平與THP-1細胞中各Tri劑量組的VEGF、VEGF-C水平相近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但均低于Tca8113細胞中各Tri各劑量組VEGF、VEGF-C水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論隨Tri濃度的增加，Tri對THP-1和Tca8113細胞分泌VEGF、VEGF-C因子的抑制作用逐漸增強， THP-1細胞可提高Tri對VEGF、VEGF-C的抑制作用，有助于抑制舌癌的生長和轉移。

舌鱗狀細胞癌；雷公藤紅素；THP-1細胞；VEGF；VEGF-C

人單核/巨噬細胞（THP-1細胞）可以釋放多種細胞促瘤因子,包括血管內皮生長因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）、血管內皮生長因子-C（VEGF-C）等，VEGF、VEGF-C在促進腫瘤血管和淋巴管的生長方面起著重要作用[1]。在有氧環(huán)境下腫瘤細胞仍然進行糖酵解，即所謂的Warburg效應,導致生長旺盛的腫瘤細胞伴隨大量酸性代謝產物的排出，從而形成腫瘤細胞外的酸性微環(huán)境[2]。腫瘤酸性微環(huán)境是腫瘤細胞生長的特殊環(huán)境，特點是間質壓力高、組織血供不足、營養(yǎng)相對缺乏、高酸低氧等特點[3]。在腫瘤治療過程中，利用THP-1細胞還可以提高其治療的效果。有研究[4]認為可能正是由于微環(huán)境的影響,使THP-1細胞出現(xiàn)了功能上的改變。因此，對于THP-1細胞在腫瘤酸性微環(huán)境中功能變化的探討，具有非常重要的臨床意義。我們將THP-1細胞與Tca8113細胞在不同濃度的Tri中共同培養(yǎng)，研究Tri對THP-1細胞功能的影響，報道如下。

1 實驗材料

1.1 人THP-1細胞 細胞系：THP-1細胞株（四川大學衛(wèi)生部移植工程和移植免疫重點實驗室）；人舌鱗癌細胞：Tca-8113細胞株（中國科學院細胞庫）。

1.2 主要試劑 Tri（99.9%）（Sigma公司）；人VEGF 及VEGF-C ELISA試劑盒（上海西唐公司）；雙抗（北京試劑廠）；RPMI-1640培養(yǎng)液（HyClone公司）；PBS液（武漢博士德公司）；二甲基亞砜（DMSO）（北京試劑廠）；0.25%含EDTA胰酶/胎牛血清（杭州四季青公司）。

1.3 主要儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific Forma公司）、EclipseE600倒置熒光顯微鏡（Nikon公司）、酶標儀（美國通用公司）、托盤天平（星潤達公司）、恒溫培養(yǎng)箱（美國通用公司）、超凈工作臺（美國通用公司）。

2 方法

2.1 配制Tri 實驗開始前，分別將Tri母液加入含

2%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液之中，然后將濃度調整為0、5、10、20、50μg/mL，最后用5.5%NaHCO3溶液及1mol鹽酸溶液，將pH調配至6.6，-20℃冰箱保存[4]。

2.2 復蘇凍存的THP-1細胞株 從-196℃液氮中取出凍存管后，迅速將其投入到盛有37℃溫水的杯中，使之快速解凍，用吸管將液體吸入到15mL的無菌離心管內，置于離心機里，調速為1500r/min，離心5min，離心結束后，上清液用吸管吸棄，加進pH值為7.2含10%胎牛血清、青霉素100μg/mL、鏈霉素100μg/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基，直至5mL，在飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)傳代。

2.3 實驗分組 設THP-1細胞組、THP-1+Tca8113細胞組及Tca8113細胞組,各組細胞濃度分別為1× 106個/mL（THP-1+Tca8113細胞組中THP-1、Tca 8113各為0.5×106），各細胞組以Tri的濃度梯度為0、5、10、20、50μg/mL設5個Tri劑量組。以上各組每孔設3個復孔，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)72h，離心培養(yǎng)板，收集其上清液，ELISA法檢測VEGF和VEGF-C的含量。

2.4 ELISA法檢測 上清液中VEGF和VEGF-C的含量測定按照VEGF、VEGF-C的ELISA試劑盒說明書操作進行。

2.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，多組間LSD分表比較，Person線性相關分析。檢驗水準α為0.05。

3 結 果

THP-1、Tca8113、THP-1+Tca8113細胞中，隨著Tri濃度的逐漸增高，VEGF、VEGF-C值均逐漸降低，且均與Tri濃度成負相關（RVEGFTHP-1=-0.534，RVEGF-CTHP-1= -0.554，RVEGFTca8113=-0.501，RVEGF-CTca8113=-0.515，RVEGFTHP-1+Tca8113=-0.516，RVEGF-CTHP-1+Tca8113=-0.525，P均＜0.001）；THP-1+Tca8113細胞組各Tri劑量組VEGF、VEGFC水平與THP-1細胞組中各Tri劑量組VEGF、VEGF-C水平相近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但均低于Tca8113細胞組各Tri劑量組VEGF、VEGF-C，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞培養(yǎng)后VEGF、VEGF-C水平比較（μmol/L，±s）

表1 各組細胞培養(yǎng)后VEGF、VEGF-C水平比較（μmol/L，±s）

注：與Tca8113組比較，△P＜0.05；Tri：雷公藤紅素；VEGF：血管內皮生長因子；VEGF-C：血管內皮生長因子-C；Tca8113：舌鱗癌細胞；THP-1：人單核/巨噬細胞

組別 小組THP-1組3 Tri（μg/mL）0 5 1 0 20 50 Tca8113組3 0 5 1 0 20 50 THP-1+Tca8113組3 0 5 1 0 20 50 VEGF 57.41±2.13 53.12±1.23 46.43±2.11 44.24±1.14 38.15±0.93 61.45±2.73 58.14±1.63 55.33±2.15 50.22±1.66 41.11±1.45 56.72±2.13△54.22±1.23△47.42±2.14△43.52±1.16△39.12±0.83△VEGF-C 61.25±1.13 55.34±2.11 51.23±1.3 48.22±2.13 45.21±1.62 61.33±2.16 57.43±2.35 53.12±2.62 49.43±2.34 43.13±1.65 60.35±2.13△55.74±2.15△50.12±1.61△47.42±2.14△40.11±1.55△

4 討 論

在舌癌中，THP-1細胞能通過分泌促進腫瘤血管和淋巴管生成的VEGF因子和VEGF-C因子，從而促進腫瘤的生長[5]。Torisu等[6]發(fā)現(xiàn)，只要將人黑色素腫瘤細胞以及THP-1細胞共同培養(yǎng)，可明顯加強VEGF和VEGF-C的分泌能力。VEGF-C是目前研究中促進腫瘤淋巴管生成并與腫瘤淋巴結轉移關系最為密切的因子之一[7]，在酸性微環(huán)境中，VEGF因子使血管內皮細胞增殖、細胞外基質合成，促進腫瘤內的血管形成[8]。微環(huán)境中白細胞介素-1等細胞因子也均能誘導促使THP-1細胞產生VEGF，從而促進血管生成[9]。

Mantovani等[10]認為活化的巨噬細胞中包含有兩種表型：M1巨噬細胞，它能表達主要組織相容性復合體Ⅱ等高呈遞抗原，參與了T細胞I型免疫應答，可殺傷腫瘤細胞；M2巨噬細胞，它能夠限制炎性反應和Th1型免疫應答，促進腫瘤的發(fā)展。Cassetta等[11]研究認為腫瘤微環(huán)境局部缺氧、高乳酸等影響了單核巨噬細胞的分化過程，可能發(fā)生了替代性活化，參與腫瘤的生長、進展和轉移等過程。但也有研究認為，單核巨噬細胞可分泌免疫調節(jié)因子和酶從而發(fā)揮抗腫瘤免疫作用，并將腫瘤抗原呈遞給細胞毒T淋巴細胞可認為仍兼具部分M1表型的功能[12]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，Tri對Tca8113和THP-1細胞分泌VEGF和VEGF-C因子具有明顯的抑制作用，隨著Tri濃度的增加和時間的延長，Tri對 THP-1和Tca8113細胞分泌VEGF、VEGF-C因子的抑制作用逐漸增強，組間比較發(fā)現(xiàn)，在THP-1的參與下，Tri對VEGF、VEGF-C的抑制作用更加明顯，可能有助于抑制舌癌的生長和轉移，為抗腫瘤治療提供一條新的途徑。

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（收稿：2016-03-23 修回：2016-05-11）

Effect of Tripterine on Vascular Endothelial Growth Factor Secretion of Squamous Cell Carcinoma and Monocyte/macrophages

LAI Heqing1,FENG Hongchao2,SONG Yufeng3.1 VIP Department,Hangzhou Stomato-logical Hospital,Hangzhou (310006),China; 2 Guiyang Stomatological Hospital,Guiyang (550004),China;3 Guizhou Food and Drug Administration,Guiyang(550004),China

ObjectiveTo investigate the effect of tripterine on vascular endothelial growth facor（VEGF）and VEGF-C secretion of monocyte/macrophages（THP-1 cells）.MethodsOral squamous cell carcinoma cells （Tca8113 cells）and THP-1 cells were cultured with different concentrations of tripterine separately or together for 72 h in vitro,then VEGF and VEGF-C contents in supernatants were detected with ELISA method.ResultsAs the concentration of tripterine increased from 0,5,10,20 to 50 μg/mL,the contents of VEGF and VEGF-C decreased gradually in all groups,which indicated a negative relation to the dose of tripterine（all P＜0.001）.The results of VEGF contents in THP-1,Tca8113,and THP-1+Tca8113 groups were as follows：THP-1：57.41±2.13, 53.1±1.23,46.43±2.11,44.24±1.14,38.15±0.93 μmol/L;Tca8113：61.45±2.73,58.14±1.63,55.33±2.15,50.22±1.66, 41.11±1.45 μmol/L;THP-1+Tca8113：56.72±2.13,54.22±1.23,47.42±2.14,43.52±1.16,39.12±0.83 μmol/L.The results of VEGF-C contents in THP-1,Tca8113,THP-1+Tca8113 groups were as follows：THP-1：61.25±1.13,55.34±2.11,51.23±1.30,48.22±2.13,45.21±1.62 μmol/L;Tca8113：61.33±2.16,57.43±2.35,53.12±2.62,49.43± 2.34,43.13±1.65 μmol/L;THP-1+Tca8113：60.35±2.13,55.74±2.15,50.13±1.61,47.42±2.14,40.11±1.55 μmol/L）. The contents of VEGF and VEGF-C in THP-1+Tca8113 groups were not significant different from those in THP-1 groups at each tripterine concentration（P＞0.05）,but significantly lower than those in Tca8113 groups（P＜0.05）.ConclusionTripterine can more inhibit VEGF and VEGF-C secretion of THP-1 cells and Tca8113 cells as its concentration increases.THP-1 may enhance the inhibition of tripterine on VEGF and VEGF-C,which may result in suppressing the growth and metastasis of oral squamous cell carcinoma.

oral squamous cell carcinoma;tripterine;THP-1;VEGF;VEGF-C

貴州省科技計劃項目[黔教育發(fā)（2010）305號]

1杭州口腔醫(yī)院總院特需科（杭州 310006）；2貴州省貴陽市口腔醫(yī)院副院長室（貴陽 550004）；3貴州省食品藥品監(jiān)督管理局局長室（貴陽550004）

馮紅超，Tel：13984030259；E-mail：hongchaof@126.com