痰熱清聯(lián)用萬(wàn)古霉素降低對(duì)MRSA的防耐藥突變濃度的體外研究

陳洋 張文平 佑航標(biāo) 荊珊珊 馬利軍

痰熱清聯(lián)用萬(wàn)古霉素降低對(duì)MRSA的防耐藥突變濃度的體外研究

陳洋 張文平 佑航標(biāo) 荊珊珊 馬利軍

目的探討痰熱清聯(lián)用萬(wàn)古霉素對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的防耐藥突變濃度的影響。方法采用瓊脂二倍稀釋法測(cè)定萬(wàn)古霉素單用以及聯(lián)合痰熱清MRSA的最低抑菌濃度(MIC)、防止耐藥突變濃度、選擇指數(shù)(SI)。結(jié)果萬(wàn)古霉素、痰熱清對(duì)MRSA的防突變濃度(MPC)分別為1 μg/ml、500 μl/ml；聯(lián)合痰熱清時(shí)萬(wàn)古霉素對(duì)MRSA的MPC為0.5 μg/ml。結(jié)論痰熱清聯(lián)合應(yīng)用可降低單藥對(duì)MRSA的MPC,縮小SI,有效的防止耐藥菌的富集。

痰熱清；萬(wàn)古霉素；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；防耐藥突變濃度

在抗感染治療領(lǐng)域正面臨著前所未有的挑戰(zhàn),細(xì)菌耐藥狀況日益嚴(yán)峻,耐藥菌感染嚴(yán)重威脅著公眾健康。由于萬(wàn)古霉素耐藥菌株的出現(xiàn)及腎毒性等副作用,給臨床治療帶來(lái)很大的困難。中草藥在治療細(xì)菌感染方面逐漸受到重視,具有抗菌作用的中藥制劑正不斷得到研究與證實(shí),因此探究中藥對(duì)MRSA的抗菌效果是非常必要的。MPC和SI概念的提出對(duì)臨床應(yīng)用抗菌藥物提出了新的要求,也為研究耐藥機(jī)制開(kāi)辟了新的領(lǐng)域。研究體外測(cè)定痰熱清聯(lián)用不同濃度的萬(wàn)古霉素對(duì)MRSA有不同程度的抑制作用,這為臨床上從中藥途徑解決MRSA耐藥性問(wèn)題提供思路。通過(guò)協(xié)同治療,既提高療效,又縮短萬(wàn)古霉素使用時(shí)間和劑量,從而將萬(wàn)古霉素的不良反應(yīng)控制到最低。

1 材料與方法

1.1 菌株 MRSA菌株ATCC43300由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.2 MH培養(yǎng)基、藥物 MH瓊脂(OXOID)、MH肉湯(北京索萊寶生物科技有限公司)、萬(wàn)古霉素(中國(guó)食品藥品檢定研究院)、痰熱清注射液 10ml(上海凱寶藥業(yè)股份有限公司)。

1.3 測(cè)定MIC方法 用倍比稀釋法配制瓊脂平板,將MRSA ATCC43300在MH瓊脂上復(fù)蘇,然后用接種環(huán)挑取2～3個(gè)菌落接種于MH肉湯中,37℃培養(yǎng)6 h,制備濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管的菌懸液(約1.5×106cfu/ml),用多點(diǎn)接種儀接種于含2倍稀釋的萬(wàn)古霉素單藥及兩藥MH瓊脂平板上每點(diǎn)含菌104 cfu,37℃培養(yǎng)18 h后觀察記錄MIC結(jié)果。

1.4 MIC結(jié)果判斷 結(jié)果根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化機(jī)構(gòu)(CLSI)2015年標(biāo)準(zhǔn),以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC。

1.5 測(cè)定MPC方法 將MRSA菌株在MH培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng),挑取過(guò)夜培養(yǎng)的菌落接種于200ml MH肉湯中,37℃震蕩(200次/min)培養(yǎng)6 h后,離心后棄上清液,再次重復(fù)以上操作,然后挑取菌落置于MH肉湯中,將菌液濃度調(diào)整為3.0×106cfu/ml。用移液槍取100 μl菌液,用L型玻璃棒將菌液均勻涂抹在倍比稀釋抗菌藥物的平板上,37℃溫箱培養(yǎng)72 h后,沒(méi)有菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度為初測(cè)MPC(MPCPr)。用上述方法測(cè)定MPCPr后,依次遞減(20%)抗菌藥物濃度,配制含藥濃度范圍為MPC到1/2范圍的瓊脂平板,重復(fù)MPCPr測(cè)定時(shí)的方法,測(cè)定72 h無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度定為MPC。

1.6 配制含藥瓊脂平板 ①用二倍稀釋法分別配置含有痰熱清及萬(wàn)古霉素的瓊脂平板：將已倍比稀釋的不同濃度的抗菌藥物分別加入已加熱溶解,并在45～50℃水浴中平衡的MH瓊脂中,充分混勻傾倒滅菌平皿,瓊脂厚度3～4mm。所配含萬(wàn)古霉素瓊脂平板濃度為0～64.0 μg/ml、痰熱清濃度為0～1000.0 μl/ml,制備每個(gè)濃度各4個(gè)平板。②含聯(lián)合用藥瓊脂平板的配制：以萬(wàn)古霉素和痰熱清單藥的MIC值、MPC值為基準(zhǔn),將定量的萬(wàn)古霉素加入100mm平皿中,然后再將倍比稀釋的痰熱清溶液加入,余步驟按照配制單藥瓊脂平板的方法操作,制備每個(gè)濃度各4個(gè)平板。

1.7 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室所測(cè)得的萬(wàn)古霉素、痰熱清及聯(lián)合用藥對(duì)MRSA的MIC、MPC計(jì)算SI。比較單用及聯(lián)合用藥的關(guān)系并分析。

2 結(jié)果

2.1 萬(wàn)古霉素對(duì)MRSA ATCC43300的MIC、MPC和SI分別為0.5 μg/ml 、1 μg/ml、2。

2.2 痰熱清對(duì)MRSA ATCC43300的MIC、MPC和SI分別為125 μl/m 、500 μl/ml、4。

2.3 與痰熱清聯(lián)用可使萬(wàn)古霉素對(duì)MRSA ATCC43300的MPC和SI較前減小,聯(lián)合應(yīng)用痰熱清濃度達(dá)到125.0 μl/ml,萬(wàn)古霉素的MPC可減少到0.5 μg/ml,SI完全關(guān)閉。見(jiàn)表1。

表1 聯(lián)用不同濃度的痰熱清后萬(wàn)古霉素對(duì)MRSA的MPC和SI

2.4 與萬(wàn)古霉素聯(lián)用可使痰熱清對(duì)MRSA ATCC43300的MPC、SI明顯減小,當(dāng)聯(lián)用濃度達(dá)到0.5 μg/ml,痰熱清的MPC即可減少到125 μl/ml,SI完全關(guān)閉。見(jiàn)表2。

表2 聯(lián)用不同濃度的萬(wàn)古霉素后痰熱清對(duì)MRSA的MPC和SI

3 討論

MRSA在目前醫(yī)院感染中占有比例約為30%。國(guó)外報(bào)道出現(xiàn)萬(wàn)古霉素中介及耐藥菌株,國(guó)內(nèi)尚無(wú)萬(wàn)古霉素耐藥菌株報(bào)道。MRSA感染治療代價(jià)高。有學(xué)者認(rèn)為導(dǎo)致萬(wàn)古霉素失敗的原因很可能是MIC的漂移［1］現(xiàn)象。從 SI 理論分析: MRSA耐藥率之所以上升,可能是由于體內(nèi)藥物濃度處于細(xì)菌的SI之間(MIC和MPC間的藥物濃度范圍),耐藥突變株容易被選擇性富集擴(kuò)增而產(chǎn)生耐藥。SI(MPC/MIC)為臨床提供了一個(gè)新的療效衡量標(biāo)準(zhǔn),用于比較藥物選擇耐藥菌株的能力；當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用兩種抗菌藥物時(shí),并同時(shí)處于各自的 MIC值以上時(shí),細(xì)菌需要同時(shí)發(fā)生兩種耐藥突變后才能被選擇性富集,從而關(guān)閉或縮小 SI。通過(guò)聯(lián)合用藥雖然可以縮窄或者關(guān)閉SI,但是另一抗菌藥物的使用很有可能引起其他的耐藥突變,就限制了為縮小藥物的SI采取兩種抗菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用。在這種情況下人們將注意力轉(zhuǎn)向天然藥物。近年來(lái)關(guān)于中藥抗細(xì)菌耐藥性的研究備受關(guān)注,通過(guò)查閱資料發(fā)現(xiàn)痰熱清在臨床上具有明顯的抗感染效果,藥理研究結(jié)果表明,該藥不僅有清熱、解毒、消炎、殺菌的作用,而且可以增強(qiáng)白細(xì)胞的吞噬,提高機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用［2］。張世有等［3］研究結(jié)果表明痰熱清注射液結(jié)合西醫(yī)基礎(chǔ)治療社區(qū)獲得性肺炎較單純西醫(yī)治療療效好。宋志香等［4］研究結(jié)果表明：痰熱清注射液與萬(wàn)古霉素注射液具有協(xié)同抗菌作用,對(duì)治療MRSA感染肺炎具有良好療效。

通過(guò)初步探討了痰熱清與萬(wàn)古霉素聯(lián)合對(duì)MRSA的MPC的影響,證實(shí)此種聯(lián)合用藥能降低萬(wàn)古霉素的MPC,縮小SI,有效的防止耐藥菌的富集。這為臨床應(yīng)用萬(wàn)古霉素治療MRSA感染,減少耐藥菌株的出現(xiàn)提供了理論依據(jù)。但是考慮到體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜,與體外研究存在一定的差異,因此尚需進(jìn)行動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證聯(lián)合用藥時(shí)藥物代謝動(dòng)力學(xué)與耐藥突變體選擇的關(guān)系。

［1］Juan-Ignacio A,Ana GC,Paloma GH,et al.Vancomycin MICs did not creep in Staphylococcus aureus isolates from 2002 to 2006 in a setting with low vancomycin usage.Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2008,62(4):773-775.

［2］王琴,潘靜.痰熱清注射液的藥理作用和臨床應(yīng)用.華北國(guó)防醫(yī)藥,2010,22(1):41-43.

［3］張世有,李冬生.痰熱清治療社區(qū)獲得性肺炎60例臨床觀察.黑龍江中醫(yī)藥,2011,40(3):19-20.

［4］宋志香,李劉坤,李興廣.中藥痰熱清注射液治療MRSA感染性肺炎的臨床觀察研究.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2010,20(11): 1596-1598.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.09.115

2016-02-02］

450000 河南中醫(yī)藥大學(xué)(陳洋 荊珊珊)；河南省人民醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學(xué)科(陳洋 張文平 佑航標(biāo) 荊珊珊馬利軍)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院(佑航標(biāo))