轉錄因子FOXM1剪接異構體在乳腺癌EMT過程中的初步研究

譚擁軍++陳含笑??

摘 要：探究轉錄因子FOXM1不同的剪接異構體對乳腺癌EMT過程中的影響.采用基因工程方法分別構建了表達FOXM1B-EGFP和FOXM1C-EGFP兩種 FOXM1剪接異構體真核表達質粒，并將其轉染進乳腺癌細胞，采用RT-PCR和Western印跡檢測細胞樣本中FOXM1剪接異構體的表達和EMT相關基因表達，同時采用transwell檢測高表達不同FOXM1剪接異構體細胞的侵襲和遷移能力.成功構建了FOXM1B-EGFP和FOXM1C-EGFP真核表達質粒.外源FOXM1B在乳腺癌間質型細胞的表達高于上皮型細胞，并主要存在于細胞核內，且高表達FOXM1B 能夠顯著促進乳腺癌細胞的侵襲和EMT過程.外源FOXM1C在乳腺癌上皮型細胞中的表達高于間質型細胞，并且在細胞核和細胞質中均有表達，高表達FOXM1C能夠顯著抑制細胞的侵襲和EMT過程.實驗結果表明，在乳腺癌細胞中，FOXM1B主要存在于細胞核內，FOXM1C在細胞核和細胞質中均有表達.本研究預示FOXM1B和FOXM1C對乳腺癌細胞EMT過程發(fā)揮不同的影響.

關鍵詞：細胞粘附；FOXM1B；FOXM1C；乳腺癌； EMT

中圖分類號：Q279 文獻標識碼：A

A Preliminary Study of Transcription Factor FOXM1

Isoforms in Breast Cancer EMT Process

TAN Yong-jun，CHEN Han-xiao

（College of Biology， Hunan Univ， Changsha， Hunan 410082， China）

Abstract：To explore the impact of different transcription factor FOXM1 isoforms in breast cancer EMT process， the eukaryotic expression plasmids for two FOXM1 isoforms， FOXM1B-EGFP and FOXM1C-EGFP， were constructed and transfected into breast cancer cells. The expression levels of FOXM1 isoforms and EMT related genes in the cells were detected with RT-PCR and Western blot. The migration ability of the cells overexpressing the FOXM1 isoforms was measured with the transwell test. The FOXM1B-EGFP and FOXM1C-EGFP eukaryotic expression plasmids were successfully constructed. We found that the levels of exogenous FOXM1B in mesenchymal cells were higher than those in epithelial cells， and it was mainly located in the nucleus. The high levels of FOXM1B expression significantly stimulated the invasion of breast cancer cells and EMT process. The levels of exogenous FOXM1C in epithelial cells were higher than those in mesenchymal cells， and they were expressed in both the nucleus and the cytoplasm. The high levels of FOXM1C expression inhibited the invasion of breast cancer cells and EMT process. FOXM1B was located mainly in the nucleus of cells and FOXM1C was expressed in both the nucleus and the cytoplasm of cells. The research has indicated that FOXM1B and FOXM1C play different roles in the process of EMT of breast cancer cells.

Key words：cell adhesion； FOXM1B；FOXM1C；breast cancer；EMT

FOXM1（Forkhead box protein M1）是叉頭框（Forkhead box，Fox）轉錄因子家族中的成員，又稱為Trident，HFH-11，Win，MPP-2等，定位于 12p13-3 號染色體，由十個外顯子組成[ 1].FOXM1的蛋白表達存在著A，B 和C 3種剪接異構體：FOXM1A 比FOXM1B多兩個外顯子，不具有轉錄活性，在細胞中表達很低；FOXM1C比FOXM1B多一個外顯子，和FOXM1B一樣具有轉錄活性，且在腫瘤組織中有高表達，但在某些方面具有不同的生物學功能[ 2-3]；FOXM1B主要在癌細胞中高表達，而FOXM1C在正常細胞和癌細胞中均有高表達[ 4].上皮間質轉化（Epithelial to mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞失去極性和細胞與細胞之間的連接點，經過細胞骨架重排、發(fā)生類似纖維狀細胞形態(tài)改變，以此來增加細胞遷移和侵襲能力的過程[ 5].研究普遍認為EMT 的發(fā)生一般與胚胎發(fā)育、組織再生和癌癥轉移有密切的聯系.在腫瘤發(fā)生過程中，上皮間質轉化使得分化的上皮腫瘤細胞變?yōu)橛羞w移和侵襲能力的間質腫瘤細胞，從而使良性腫瘤細胞浸潤周圍正常組織，進一步使腫瘤細胞發(fā)生全身性擴散和轉移[ 6].已有研究表明，EMT在乳腺癌的轉移過程中發(fā)揮著至關重要的作用[ 7].FOXM1參與了腫瘤細胞的增殖、EMT等過程的調控：例如，在胰腺癌細胞中，高表達FOXM1B能增強細胞的生長能力、集落生成和細胞遷移能力，并導致細胞間質表型標志物表達上調和上皮表型標志物表達下降[ 8]；本實驗室研究也表明FOXM1B能夠促進乳腺癌的EMT進程，且FOXM1B 的表達水平與細胞的上皮和間質的特性以及細胞遷移能力呈正相關性[ 6].另一方面，已有研究發(fā)現FOXM1C受Raf/ MEK/ MAPK 信號通路調節(jié)，并通過影響G2/M進程從而對細胞周期進行調節(jié)[ 9].同時，FOXM1C還通過刺激BMI-1表達來抑制氧化應激引起的衰老和細胞增殖[ 10].目前，腫瘤細胞中FOXM1B和FOXM1C這兩種FOXM1的剪接異構體在功能和定位上是否存在差異還不十分清楚.因此本研究以乳腺癌細胞的EMT過程為研究模型，探究FOXM1B和FOXM1C兩種剪接異構體在不同表型的乳腺癌細胞中的定位以及在EMT過程中是否存在著功能差別.

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231均購置于中國科學院細胞庫，按ATCC的細胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng).

1.2 細胞總RNA提取、RT-PCR檢測相關基因表達

RNA的提取按照Total RNA KitI試劑盒（Omega，USA）進行，運用M-MLV逆轉錄酶（Invitrogen，USA）將RNA反轉錄為cDNA.PCR檢測所用引物序列見表1.

1.3 質?？寺?/p>

以pcDNA3-HA-FOXM1B/C-V5質粒（香港大學生物化學系提供）為模板，PCR擴增得到FOXM1B/C全長的cDNA序列，將其克隆到pEGFP-C2載體上構建pEGFP-FOXM1B/C融合蛋白表達質粒.以pEGFP-C2為模板，PCR擴增得到EGFP全長的cDNA序列，將其克隆到pcDNA3-HA-FOXM1B＼＼C-V5質粒上構建pcDNA3-EGFP-HA-FOXM1B-V5融合蛋白表達質粒.所構建的質粒均經酶切和測序鑒定.其所用引物見表2.

1.4 細胞轉染與檢測

轉染前一天接種1×10～6細胞于10 cm 培養(yǎng)皿中，待細胞鋪滿率達 80%～90%時，按Lipofectamine2000說明進行轉染實驗，于48 h后進行收樣檢測.

1.5 Transwell 實驗

取對數生長的細胞，胰酶消化，細胞數為1×10 5/孔，上室用1% FBS的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，下室用5% FBS 的 DMEM 細胞培養(yǎng)基，37 ℃常規(guī)細胞培養(yǎng) 20～24 h 后，用0.1%的結晶紫進行細胞染色后，置于顯微鏡下拍照，隨機取 3～5 個視野，用 image J 軟件對照片進行數據分析.

1.6 統(tǒng)計分析

所有結果均采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數據以X±S表示，兩組間比較采用t-test，P<0.05具有統(tǒng)計學意義.

2 結 果

2.1 FOXM1在間質型乳腺癌細胞的表達高于上皮型細胞

顯微鏡下觀察，MCF-7細胞呈扁平不規(guī)則多角形， E-cadherin表達量高于MDA-MB-231細胞，而MDA-MB-231細胞細長如梭形，Vimentin表達量高于MCF-7細胞（圖1（a）～（c））.同時通過Transwell實驗發(fā)現 MDA-MB-231細胞的侵襲和轉移能力明顯強于MCF-7細胞（圖1（d）（e））.由此可以看出，MCF-7和MDA-MB-231雖同屬于乳腺癌細胞，

但是兩株細胞的細胞形態(tài)與基因表達存在著明顯的不同.研究結果表明MDA-MB-231屬于間質型細胞類型而MCF-7屬于上皮型細胞類型.通過對FOXM1的檢測發(fā)現，兩株細胞中FOXM1B的mRNA水平無明顯差別，而MCF-7細胞中的FOXM1C mRNA水平略高于MDA-MB-231細胞，但MDA-MB-231細胞中的FOXM1蛋白表達明顯高于MCF-7細胞（圖1（b），（c））.推測出現這種現象的原因，雖然FOXM1的不同剪接體的mRNA表達量在這兩株細胞中存在差異，但實驗中所用的FOXM1抗體無法區(qū)分兩種剪接異構體蛋白，預示兩種剪接異構體所產生蛋白的穩(wěn)定性在這兩株細胞中不同.

2.2 質粒構建

如圖 2（a）所示，分別構建pEGFP-FOXM1B＼＼C，pcDNA3-EGFP-HA-FOXM1B＼＼C-V5 4個質粒，經酶切鑒定，測序鑒定正確（圖 2（b））.

（a） 4個質粒的質粒圖譜

（b） 4個質粒的克隆鑒定瓊脂糖電泳圖

2.3 重組質粒在真核細胞內的表達

將所構建的重組質粒pEGFP-FOXM1B＼＼C，pcDNA3-EGFP-HA-FOXM1B＼＼C-V5分別轉染MDA-MB-231和MCF-7細胞，WB檢測蛋白表達，結果表明FOXM1B在MDA-MB-231細胞中的表達水平較高，而FOXM1C在MCF7細胞中的表達水平較高（圖3（a））.24 h后熒光倒置顯微鏡觀測顯示pEGFP- FOXM1B在MDA-MB-231細胞中的表達量高于pEGFP- FOXM1C（圖3（b）），而pcDNA3-EGFP-HA-FOXM1B-V5在MCF-7細胞中表達略低于pcDNA3-EGFP-HA-FOXM1C-V5（圖3（d）），結果與蛋白檢測結果一致.并且FOXM1B主要在細胞核表達，而FOXM1C在細胞核和細胞質中均有表達（圖3（b）～（e））.

2.4 FOXM1B促進上皮間質轉化的發(fā)生

在上皮型細胞MCF-7內高表達FOXM1B，收集樣本進行相關檢測，結果顯示上皮型標志物E-cadherin表達水平顯著下調，而間質型標志物Vimentin表達水平顯著上調（圖 4（a），（b））.Transwell實驗同時證明FOXM1B高表達的MCF-7細胞的遷移能力明顯高于對照組（圖4（c），（d））.這些結果表明FOXM1B的高表達能夠誘導MCF-7細胞向間質型細胞轉化，使細胞呈現間質型細胞特性，促使EMT的發(fā)生.

2.5 FOXM1C抑制上皮間質轉化的發(fā)生

在間質型細胞MDA-MB-231內高表達FOXM1C，收集樣本進行相關檢測，結果顯示間質型標志物Vimentin水平顯著下調，而上皮型標志物E-cadherin顯著上調（圖 5（a），（b））.同時Transwell實驗表明高表達FOXM1C的MDA-MB-231細胞的遷移能力比對照組低（圖5（c），（d））.以上結果表明高表達FOXM1C能夠誘導MDA-MB-231向上皮型細胞轉化，使細胞呈現上皮型細胞特性，抑制EMT的發(fā)生.

3 討 論

本文將構建好的FOXM1B和FOXM1C真核表達質粒轉入乳腺癌細胞，發(fā)現高表達FOXM1B 的MCF-7細胞上皮型標志物E-cadherin表達水平顯著下調，而間質型標志物Vimentin表達水平顯著上調.Transwell實驗同時證明FOXM1B高表達的MCF-7細胞的遷移能力明顯高于對照組，由此表明FOXM1B的高表達能夠誘導MCF-7細胞向間質型細胞轉化，使細胞呈現間質型細胞特性，說明FOXM1B能夠促進EMT的發(fā)生.Park H J等人的研究也發(fā)現FOXM1B是腫瘤發(fā)生轉移的活化劑，通過激活Akt-SNAIL1通路并刺激Stathmin，賴氨酰氧化酶，進而調節(jié)癌癥轉移相關基因的表達[ 13].由此可見，FOXM1B可受多種信號通路調節(jié)，激活癌細胞轉移的相關標志性基因，進而激活EMT過程.而高表達FOXM1C的MDA-MB-231細胞顯示其間質型標志物Vimentin水平顯著下調，而上皮型標志物E-cadherin顯著上調.同時Transwell實驗表明高表達FOXM1C的MDA-MB-231細胞的遷移能力比對照組低，由此表明高表達FOXM1C能夠誘導MDA-MB-231向上皮型細胞轉化，使細胞呈現上皮型細胞特性，說明FOXM1C能抑制EMT的發(fā)生.Wierstra I等人研究發(fā)現FOXM1C可直接結合到上皮表型重要標志物E-cadherin的啟動子序列上直接調節(jié)E-cadherin基因的表達，進而抑制EMT的發(fā)生[ 14].也有研究表明細胞可通過Raf / MEK/ MAPK信號刺激FOXM1C發(fā)生核轉位，從而激活抑癌基因的表達，實現抑制EMT的作用[ 9].

綜上所述，FOXM1B在間質細胞中高表達，同時促進EMT的發(fā)生，而FOXM1C在上皮型細胞中高表達，同時抑制EMT的發(fā)生.可以看出FOXM1B與FOXM1C作為FOXM1的剪接體具有完全相反的功能.因此，作為EMT的關鍵調控因子，FOXM1的不同剪接異構體FOXM1B和FOXM1C有望為乳腺癌的治療提供潛在的作用靶點.

參考文獻

[1] KORVERA W， ROOSEA J， HEINEN K， et al. The human TRIDENT/HFH-11/FKHL16 gene： structure， localization， and promoter characterization[J]. Genomics， 1997，46（3）：435-442.

[2] YE H， KELLY T F， SAMADANI U， et al. Hepatocyte nuclear factor 3/fork head homolog 11 is expressed in proliferating epithelial and mesenchymal cells of embryonic and adult tissues[J]. Mol Cell Biol， 1997，17（3）：1626-1641.

[3] KORVER W， ROOSE J，CLEVERS H. The winged-helix transcription factor trident is expressed in cycling cells[J]. Nucleic Acids Res， 1997，25（9）：1715-1724.

[4] LAM A K. FOXM1b， which is present at elevated levels in cancer cells， has a greater transforming potential than FOXM1c[J]. Front Oncol， 2013，23： 11.

[5] TIWARI N， GHELDOF A， TATARI M， et al. EMT as the ultimate survival mechanism of cancer cells[J]. Semin Cancer Biol， 2012，22（3）： 194-207.

[6] YANG C，CHEN H， TAN G X， et al. FOXM1 promotes the epithelial to mesenchymal transition by stimulating the transcription of slug in human breast cancer[J]. Cancer Lett， 2013，340（1）：104-112.

[7] XUE C， PLIETH D， VENKOV C， et al. The gatekeeper effect of epithelial-mesenchymal transition regulates the frequency of breast cancer metastasis[J]. Cancer Res， 2003，63（12）： 3386-3394.

[8] BAO B，WANG Z W， ALI S， et al. Over-expression of FoxM1 leads to epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell phenotype in pancreatic cancer cells[J]. J Cell Biochem， 2011，112（9）： 2296-2306.

[9] MA R Y，TONG T H，LEUNG W Y， et al. Raf/MEK/MAPK signaling stimulates the nuclear translocation and transactivating activity of FOXM1c[J]. J Cell Sci， 2005，118（4）： 795-806.

[10]LI S K M， SMITH D K， LEUNG W Y， et al. FOXM1c counteracts oxidative stress-induced senescence and stimulates Bmi-1 expression[J]. J Biol Chem， 2008，283（24）： 16545-16553.

[11]LI X R， CHU H J， LV T， et al. miR-342-3p suppresses proliferation， migration and invasion by targeting FOXM1 in human cervical cancer[J]. FEBS Lett， 2014，588（17） ： 3298-3307.

[12]XUE J F，LIN X， CHIU W T， et al. Sustained activation of SMAD3/SMAD4 by FOXM1 promotes TGF-beta-dependent cancer metastasis[J]. J Clin Invest， 2014，124（2）： 564-579.

[13]PARK H J， GUSAROVA G， WANG Z B， et al. Deregulation of FOXM1b leads to tumour metastasis[J]. Embo Mol Med， 2011，3（1）： 21-34.

[14]WIERSTRA I， HANNOVER M S， INST M B. The transcription factor FOXM1c binds to and transactivates the promoter of the tumor suppressor gene E-cadherin[J]. Cell Cycle， 2011，10（5）： 760-766.