基于線粒體COⅠ序列比較長江口中華絨螯蟹放流與野生群體的遺傳多樣性

彭欣悅，趙 峰，張 濤，耿 智，3，朱美貴，莊 平

（1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；3.華東師范大學生命科學學院，上海 200062）

基于線粒體COⅠ序列比較長江口中華絨螯蟹放流與野生群體的遺傳多樣性

彭欣悅1，2，趙 峰1，張 濤1，耿 智1，3，朱美貴1，2，莊 平1

（1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；3.華東師范大學生命科學學院，上海 200062）

為探討長江口中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）放流親蟹與野生群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的差異，對77個放流和野生親蟹個體進行了線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）基因序列的比較分析，結(jié)果表明：所檢測的樣本共計77個COⅠ基因序列（630 bp）中，變異位點（V）41個，簡約信息位點（P）37個，A＋T（61.7%）的含量明顯高于C＋G（38.3%），表現(xiàn)出較為明顯的堿基組成偏倚性；兩個群體共檢測出15種單倍型，其中單倍型Hap－1出現(xiàn)頻率最大，為兩個群體所共享，放流和野生群體各具有5種獨有單倍型；兩個群體的單倍型多樣性指數(shù)（H）為0.825，核苷酸多樣性指數(shù)（π）為0.004 66，平均核苷酸變異數(shù)（K）為2.910，其中野生群體的單倍型多樣性指數(shù)（0.833）和核苷酸多樣性指數(shù)（0.007 70）均高于放流群體（0.810和0.002 11）。AMOVA分子方差分析表明，長江口中華絨螯蟹放流與野生群體總的遺傳變異主要來自群體內(nèi)，其中96.53%遺傳變異來自各群體內(nèi)部，3.47%遺傳變異來自群體間。群體內(nèi)遺傳分化指數(shù)（FST）野生群體（0.034 75）高于放流群體（0.034 57），兩個群體間遺傳分化指數(shù)（FST）為0.034 66（P＞0.05），兩個群體遺傳分化不顯著。兩個群體間的基因流（Nm）為13.93（Nm＞1），表明放流群體和野生群體的基因交流較為頻繁。

中華絨螯蟹；遺傳多樣性；COⅠ基因；長江口；增殖放流

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱河蟹，隸屬節(jié)肢動物門（Arthropoda），甲殼綱（Crustacea），十足目（Decapoda），方蟹科（Grapsidae），絨螯蟹屬，自然分布十分廣泛，在我國北起遼寧、南至福建沿海各省份的通海河流中幾乎均有其蹤跡，但以長江水系中華絨螯蟹群體種質(zhì)最為優(yōu)良［1］。長江口由于生境獨特、河口淺灘廣闊、生物多樣性高，是中華絨螯蟹得天獨厚的產(chǎn)卵場［2］，加之長江源遠流長，長江中下游水體中水草茂盛，餌料豐富，對中華絨螯蟹的生長育肥十分有利，由此形成了極具特色的長江水系中華絨螯蟹品系，因其個體肥大、肉質(zhì)細嫩、味道鮮美而深受廣大消費者的喜愛［3］。近幾十年，由于過度捕撈、圍墾造田、水域環(huán)境污染以及長江中下游大型水利工程的建設等原因，中華絨螯蟹生存及洄游的生態(tài)環(huán)境受到嚴重破壞，自然資源急劇衰退［4］。自上世紀60年代末至本世紀初長江口的蟹苗產(chǎn)量極速下降，曾一度枯竭，幾乎沒有產(chǎn)量［5］。為了恢復中華絨螯蟹天然資源，近年來長江中下游各省市均采取了人工增殖放流，特別是長江口水域的親蟹增殖放流活動取得了良好的效果。

目前，對漁業(yè)增殖放流效果評估的主要方法是放流個體標記與回捕率分析，其中實物標記是傳統(tǒng)的標記方法，應用也最為廣泛［6］。近年來，分子標記技術研究迅猛發(fā)展，在蝦蟹類的增殖放流效果評估中也得到了一定的應用［7－9］。對長江口中華絨螯蟹增殖放流的研究工作大多集中在標志方法、放流數(shù)量、放流區(qū)域、放流時間及苗種大小等方面［6］，增殖放流的效果究竟如何、放流群體和野生群體間的遺傳關系如何、放流群體是否會改變自然水域野生群體的遺傳多樣性等成為目前人們關注的問題。本實驗利用線粒體DNA分子標記技術對長江口中華絨螯蟹增殖放流活動中的養(yǎng)殖親蟹和長江口自然水域的野生親蟹兩個群體的線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）基因序列進行了初步研究，比較并分析了其群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，旨在探究長江口水域中華絨螯蟹親蟹的遺傳學背景，為系統(tǒng)研究長江口中華絨螯蟹種質(zhì)資源狀況、增殖放流效果評價等提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2014年12月采集長江口中華絨螯蟹增殖放流活動的放流親蟹40 ind，記為放流群體；同時，從2015年3月至2015年6月長江口中華絨螯蟹產(chǎn)卵場定點底拖網(wǎng)調(diào)查捕獲的野生中華絨螯蟹親蟹中隨機抽取37 ind，記為野生群體。將所有樣本活體帶回實驗室后，測定每個樣本的體重、體寬、體高等表型性狀，因野外調(diào)查捕獲的中華絨螯蟹中可能混有放流親蟹，故需根據(jù)曹偵等［10］研究的形態(tài)差異分析法進行判別，分別取其螯足或步足，置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

將置于－20℃保存的樣本取出置于碎冰上，取其螯足部分肌肉，為避免肌肉樣品反復凍融，每個樣本取出的肌肉分裝1～3管并編號，以備再次提取基因組DNA?；蚪MDNA提取方法嚴格按照海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）中的說明書操作步驟進行，提取的基因組DNA采用紫外吸收法測定其含量及純度。

1.3 線粒體COⅠ基因擴增及序列測定

采用FOLMER等［11］的中華絨螯蟹線粒體COⅠ基因引物進行序列擴增和測定，引物序列為COⅠ－F：5′－GGTCAACAATCATAAGATATTGG－3′、COⅠ－R：5′－TAAACTTCAGGGTG ACCAAAAAATCA－3′，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。反應體系總體積為50μL，包括Premix溶液25μL（1.25U/25μL TaKaRa Taq、0.4 mM dNTP、0.4 mM Mixture Taq Buffer等）、模板DNA 5μL（60～100 ng·μL－1）、引物（F/R）各1μL（20μM）、滅菌蒸餾水18μL。在PCR儀（Eppendorf 5331）上進行擴增，共設30個循環(huán)。循環(huán)前94℃預變性5 min，每個循環(huán)包括94℃40 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s；循環(huán)結(jié)束后于72℃延伸10 min。

PCR擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，結(jié)合Marker判斷并選取目的條帶明亮、清晰、無拖尾、特異性較好的樣品，編號并密封包裝，送上海桑尼生物科技公司的ABIPRISMTM測序系統(tǒng)進行雙向測序，并進行人工序列核對、矯正和拼接，測序后利用GeneDoc軟件進行對位排序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 測序結(jié)果比對及遺傳多樣性參數(shù)分析

將每個樣本測序得到的結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性搜索，然后使用Clustal X、MEGA 5.1軟件中進行序列比對和重排，同時輔以人工校對；使用MEGA 5.1計算其堿基含量、變異位點數(shù)（V）、簡約信息位點數(shù)（P）；使用DNASP 5.1計算其單倍型數(shù)目（H）、單倍型多樣性指數(shù)（Hd）、核苷酸多樣性指數(shù)（π）、平均核苷酸差異數(shù)（K）等。

1.4.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分化分析

使用軟件MEGA 5.1，并運用Kimura雙參數(shù)替代模型（Kimura－2－Parameter，K－2－P）計算群體間的遺傳距離；使用Arlequin 3.5軟件進行分子變異方差分析（AMOVA），計算群體內(nèi)及群體間的遺傳分化指數(shù)（FST）及遺傳變異在群體內(nèi)及群體間的分布，并檢測群體間FST的顯著性（重復次數(shù)為1 000次）。通過設定兩種AMOVA分析來檢驗中華絨螯蟹的群體遺傳結(jié)構(gòu)，首先根據(jù)樣本來源，將所有樣本劃分為放流群體和野生群體兩個組群，以驗證群體內(nèi)是否存在顯著的群體遺傳結(jié)構(gòu)差異；其次將所有樣本劃分為一個組群，以驗證群體間是否存在顯著的群體遺傳分化，群體間的基因流Nm計算公式為：Nm＝（1/FST－1）/2。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華絨螯蟹線粒體COⅠ基因序列變異

用于研究的77個的中華絨螯蟹個體的COⅠ基因均可被穩(wěn)定擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均能顯示明亮清晰的條帶，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化回收后送至上海桑尼生物科技有限公司測序。測序得到的所有COⅠ基因序列經(jīng)比對和校正，在用于群體遺傳多樣性數(shù)據(jù)分析的77個630 bpCOⅠ基因序列中，其變異位點數(shù)（V）41個，占總位點數(shù)的6.51%；簡約信息位點數(shù)（P）37個，單變異位點數(shù)4個（圖1）；在兩個群體所有的COⅠ基因序列的堿基組成中A、T、C、G平均堿基含量分別為27.1%、34.6%、21.0%、17.3%，A＋T（61.7%）的含量明顯高于C＋G（38.3%），表現(xiàn)出較為明顯的堿基組成偏倚性（表1）。

圖1 中華絨螯蟹線粒體COⅠ基因序列變異位點Fig.1 Variable sites ofm itochondrial COⅠgene for E.sinensis

表1 中華絨螯蟹放流群體與野生群體線粒體COⅠ基因片段的序列組成Tab.1 Nucleotide composition ofm itochondrial COⅠgene in released and w ild E.sinensis populations

2.2 種群遺傳結(jié)構(gòu)特征

在2個中華絨螯蟹群體中共檢測出15種單倍型，各群體的單倍型分布見表2，其中單倍型Hap－1出現(xiàn)頻率最大并為兩個群體所共享，單倍型Hap－3、Hap－5、Hap－6、Hap－13、Hap－14為放流群體所獨有，單倍型Hap－9、Hap－10、Hap－11、Hap－12、Hap－15為野生群體所獨有。

兩個中華絨螯蟹群體遺傳多樣性參數(shù)如表3所示。由表3可知，放流群體序列變異程度遠低于野生放流群體，在放流群體所有COⅠ基因序列中發(fā)現(xiàn)變異位點8個，其中簡約信息位點數(shù)7個；野生群體所有COⅠ基因序列中發(fā)現(xiàn)變異位點41個，其中簡約信息位點數(shù)35個。放流群體單倍型數(shù)、單倍型多樣性、核苷酸多樣性及平均核苷酸差異數(shù)分別為9、0.801 1、0.002 11和1.319，均分別低于野生群體的單倍型數(shù)、單倍型多樣性、核苷酸多樣性及平均核苷酸差異數(shù)，其依次為12、0.833 3、0.007 70和4.982。

表2 中華絨螯蟹COⅠ基因單倍型在放流群體和野生群體中的分布Tab.2 Distribution of COⅠgene hap lotypes in released and w ild E.sinensis populations

表3 中華絨螯蟹放流群體與野生群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Parameters of genetic diversity in released and w ild E.sinensis populations

通過Kimura雙參數(shù)法計算放流群體和野生群體內(nèi)的遺傳距離分別為0.002和0.007，兩個群體間的遺傳距離為0.005。兩個群體間的遺傳分化指數(shù)（FST）和基因流（Nm）分別為0.034 66、13.93（表4）。兩個群體間的FST和Nm顯示放流群體和野生群體的基因交流較為頻繁（Nm＝13.93＞1）。

AMOVA分子方差分析表明，中華絨螯蟹放流群體和野生群體兩個群體總的遺傳變異主要來自群體內(nèi)，其中96.53%遺傳變異來自各群體內(nèi)部，3.47%遺傳變異來自各群體間。群體內(nèi)遺傳分化指數(shù)（FST）野生群體（0.034 75）高于放流群體（0.034 57），兩個群體間遺傳分化指數(shù)（FST）為0.034 66（P＞0.05），表明兩個群體遺傳分化不顯著（表5）。

表4 中華絨螯蟹種群間的FST（左下角）和Nm（右上角）Tab.4 FST（left bottom）and Nm（right bottom）value of E.sinensis populations

3 討論

3.1 中華絨螯蟹群體遺傳結(jié)構(gòu)特征

線粒體DNA的研究是近20年來分子生物學研究的重要內(nèi)容，線粒體DNA是核外遺傳物質(zhì)，與核基因存在平行進化關系，為母系遺傳并且具有較高的突變率，突變固定后形成的DNA多態(tài)性位點可反映出群體遺傳特征、種群分化和種屬關系［12］。細胞色素氧化酶I亞基（cytochrome oxidase subunit I，COⅠ）是線粒體氧化呼吸鏈的重要成員，是線粒體基因組中變異性較大、進化速度較快的區(qū)域，故適合于種群遺傳水平差異的檢測，該基因近年來在昆蟲、蝦類、蟹類、貝類以及魚類的群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進化方面有較多的研究［13－18］。

本研究所得的COⅠ基因序列中，A＋T的含量為61.7%，明顯高于C＋G的含量，表現(xiàn)出較為明顯的堿基組成偏倚性。A、T、C和G 4種核苷酸在線粒體基因組中呈不均一性分布，這是動物線粒體基因組的一個共性［19］。有研究者基于線粒體COⅠ基因序列的三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）東海區(qū)群體遺傳多樣性分析研究也得出三疣梭子蟹A＋T（64.2%）的含量明顯高于C＋G（35.9%）［20］，這與本研究結(jié)果十分接近。三疣梭子蟹和中華絨螯蟹同屬十足目蟹類，兩者的線粒體基因COⅠ基因核苷酸組成非常接近，均符合節(jié)肢動物A、T含量高的特點［21］。在本研究中的放流與野生群體的所有樣本的線粒體COⅠ基因中，共測定出變異位點數(shù)（V）41個，占總位點數(shù)的6.51%，其中簡約信息位點數(shù)（P）37個，遠大于單變異位點數(shù)（S）。在群體總的變異位點中，大多位點存在多種變異類型，群體變異位點的變異種類越多，其群體遺傳多樣性水平就越高。其中，在兩個種群線粒體COⅠ基因序列第34～364 bp之間集中27個變異位點，是變異頻率較高的區(qū)段，可以考慮作為中華絨螯蟹種群鑒別的線粒體DNA分子標記。在對兩個群體所有個體的線粒體COⅠ基因序列單獨進行分析時發(fā)現(xiàn)，在野生群體中檢測出變異位點數(shù)（V）41個、簡約信息位點數(shù)（P）35個、單變異位點數(shù)（S）6個，而在放流群體中檢測出變異位點數(shù)（V）8個、簡約信息位點數(shù)（P）7個、單變異位點數(shù)（S）1個。由此可以得知，對兩個群體整體和單獨分析結(jié)果均表明，野生群體的遺傳變異程度均遠大于放流群體，這意味著目前長江口中華絨螯蟹野生群體遺傳信息量豐富，利于物種種質(zhì)資源的優(yōu)化。

表5 中華絨螯蟹放流群體與野生群體的AMOVA分析Tab.5 AMOVA analysis of released and w ild E.sinensis popu lations

3.2 中華絨螯蟹放流和野生群體的群體遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，同時也是物種進化的本質(zhì)與保證。群體的遺傳變異程度決定著物種進化的趨勢，往往一個種群對環(huán)境適應能力的強弱恰恰是該種群遺傳多樣性豐富程度的直觀反映，因此對群體遺傳多樣性的研究極具理論和實踐意義。一個物種的群體遺傳多樣性的水平受到諸多因素的影響，如人工養(yǎng)殖規(guī)模大小、群體內(nèi)的近交及隨機遺傳漂變、物種自身的生活史特點等［20］。近年來有學者研究表明十足目蝦蟹類的遺傳多樣性水平較低，且變 異 基 本 全 部 來 自 于 群 體 內(nèi)［22－25］。HEDGECOCK等［26］通過總結(jié)65種蝦蟹類的平均雜合度，認為甲殼類動物遺傳變異較低的原因是其較短的生活史以及缺乏隨機遺傳漂變。單倍型多樣性與群體大小及環(huán)境有關，群體大且環(huán)境差異大則群體的單倍型多樣性就會高［27］。龐大的種群數(shù)量、環(huán)境的不均一性和適于種群快速增長的生活習性是維持自然種群內(nèi)較高單倍型多樣性的基礎［28］。核苷酸多樣性（π）是衡量群體遺傳多樣性和群體遺傳分化的重要指標之一，π值越大表示群體遺傳多樣性越高［29］。本研究結(jié)果表明，長江口放流群體和野生群體均具有較高的單倍型多樣性指數(shù)，分別為0.801 1和0.833 3，而核苷酸多樣性指數(shù)相對較低，分別為0.002 11和0.007 70，由此推測長江口中華絨螯蟹群體數(shù)量相對較大，但群體內(nèi)各單倍型之間序列差異較小。本研究結(jié)果還顯示，中華絨螯蟹放流群體的單倍型多樣性、核苷酸多樣性及平均核苷酸差異數(shù)均低于野生群體的單倍型多樣性、核苷酸多樣性及平均核苷酸差異數(shù)，這說明長江口中華絨螯蟹放流群體的遺傳多樣性低于野生群體，這可能是因為本研究中所用放流群體的親蟹采購于養(yǎng)殖場，其通過捕撈野生親本，采用人工育苗技術培育成親蟹，野生親本數(shù)量的有限性可能是導致其群體遺傳多樣性較低的原因之一；其次可能是由于養(yǎng)殖環(huán)境的單一性所致。有學者采用線粒體COⅠ序列對厚殼貽貝（Mytilus coruscus）和銀鯧（Pampus argenteus）的養(yǎng)殖與野生群體遺傳多樣性比較分析的研究結(jié)果均表明，養(yǎng)殖群體的單倍型數(shù)量和核酸多樣性指數(shù)都要比野生群體的單倍型數(shù)量和核酸多樣性指數(shù)低［30－31］，這一結(jié)果與本研究所得結(jié)果一致。FST常用來表示兩個群體之間的分化程度，在0～1的范圍內(nèi)，F(xiàn)ST值越大表示兩個群體的分化程度越高。本研究中，兩個群體總的遺傳分化指數(shù)FST為0.034 66（P＞0.05），表明兩個群體之間的遺傳差異較小，遺傳分化不顯著。AMOVA分子方差分析表明，兩個群體總的遺傳變異基本上都是存在各群體內(nèi)（表5），這與FST的分析結(jié)果是一致的。

總之，目前長江口中華絨螯蟹遺傳多樣性還較為豐富，而且放流與野生群體間存在一定的遺傳結(jié)構(gòu)差異，兩群體之間并未出現(xiàn)顯著遺傳分化，這可能與中華絨螯蟹自身的洄游特性、人工增殖放流的規(guī)模較小、時間較短有關，但仍需要繼續(xù)監(jiān)測兩者的遺傳狀況變化，以防止野生群體基因庫受到放流群體的干擾和污染，從而降低野生群體的遺傳多樣性。同時，建議增殖放流親本要選擇經(jīng)過遺傳檢測與評價的親蟹群體進行增殖放流，以避免其對野生中華絨螯蟹種質(zhì)資源造成不良影響。

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Genetic diversity of Eriocheir sinensis in released and w ild populations based on M itochondrial Cytochrome Oxidase SubunitⅠsequence from the Yangtze Estuary

PENG Xin-yue1，2，ZHAO Feng1，ZHANG Tao1，GENG Zhi1，3，ZHU Mei-gui1，2，ZHUANG Ping1
（1.East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai 200090，China；2.College of Fishery and Life Science，ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China；3.College of Fishery and Life Science，East China Normal University，Shanghai200062，China）

Chinese Mitten Crab，Eriocheir sinensis，is an important economic crab in China.The crab population has decreased greatly in recent years due to over-exploitation and large-scale water conservation construction in the Yangtze River.To restore the natural resources of Chinese mitten crab in the Yangtze River，measures have been taken by provinces and cities along the Yangtze River，such as taking artificial stockingmeasures.In this study，Mitochondrial Cytochrome Oxidase SubunitⅠ（COⅠ）fragments of released and wildEriocheir sinensisfrom the Yangtze Estuary were amplified via PCR，then PCR productswere purified and sequenced.The population genetic diversity and structure by sequencing themitochondrialCOⅠgene of 77 individuals were analyzed.Results showed that there were 41 variable sites in total 630 sites and 15 haplotypeswere found among 77 individuals of released and wildEriocheir sinensis.Among the total 15 haplotypes，Hap－1 appeared most frequently in released and wildEriocheir sinensisand was shared with two populations.Hap－3，Hap－5，Hap－6，Hap－13 and Hap－14 were unique for the released population while Hap－10，Hap－11，Hap－12，and Hap－15 were unique for thewild.The total genetic diversity indexswere high.Haplotype diversity index（H）was 0.825，nucleotide diversity index（π）was0.004 66，and the average number of nucleotide variation index was2.910.Analyzing separately the genetic diversity of two populations，we found that haplotype diversity and nucleotide diversity index of the wild population were higher than that of the released population.The haplotype diversity index of two populations was 0.833 and 0.810.The nucleotide diversity index of two populations was 0.007 70 and 0.002 11.Analysis ofmolecular variance（AMOVA）showed that the genetic differentiation index（FST）of two populations was 0.034 66（P＞0.05），indicating obvious genetic differences among the released and wild individuals，and the genetic variation mainly existed within populations.Index of genetic differentiation（FST）and gene flow（Nm）between released population and wild population were 0.034 66 and 13.93，indicating that there weremore frequent gene flows between two populations（Nm＝75.05＞1）.

Eriocheir sinensis；genetic diversity；Cytochrome Oxidase Subunit I（COⅠ）；Yangtze Estuary；stock enhancement

Q 754

A

1004－2490（2016）03－0254－08

2015－09－28

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費資助（201203065）；上海市長江口青草沙水庫鄰近水域生態(tài)修復專項

彭欣悅（1988－），女，碩士研究生。E-mail：xypeng2015＠163.com

莊 平，研究員。E-mail：Pzhuang＠hotmail.com