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    紅平菇漆酶基因異源表達(dá)及對染料脫色的研究

    2014-03-27 02:05:55鄭苗苗邵淑麗張東向張令昂焦戰(zhàn)戰(zhàn)
    紡織學(xué)報 2014年12期
    關(guān)鍵詞:漆酶平菇脫色

    鄭苗苗, 邵淑麗, 張東向, 張令昂, 焦戰(zhàn)戰(zhàn)

    (齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院, 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

    漆酶(laccase)是一種含銅的多酚氧化酶,屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族[1]。漆酶通過催化O2將4個電子還原生成水,底物作用范圍廣泛,在很多方面有較大的應(yīng)用價值[2-3]。最早由日本吉田在漆樹的分泌物中發(fā)現(xiàn)漆酶,隨后又在一些真菌中發(fā)現(xiàn)漆酶。近些年來,漆酶一直是醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域中十分活躍的研究熱點(diǎn)[3]。迄今為止,漆酶廣泛存在于植物、真菌、細(xì)菌、昆蟲中[2]。其中真菌中白腐菌是最重要的漆酶生產(chǎn)菌,但是該菌漆酶產(chǎn)量低、熱穩(wěn)定性差、生長周期較長,而且漆酶的分泌還需要酚類化合物作為誘導(dǎo),不利于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)[4-5]。近年來,漆酶相關(guān)研究在國際上越來越受到重視,漆酶不僅具有降解木質(zhì)素特性,還能降解多種復(fù)雜化合物,所以漆酶在印染工業(yè)、紡織工業(yè)、造紙工業(yè)及其他領(lǐng)域有相當(dāng)大的研究價值及應(yīng)用潛力,因此,探索廉價、安全的漆酶生產(chǎn)方法策略吸引了國內(nèi)外學(xué)者的興趣。國內(nèi)外學(xué)者已在對漆酶異源表達(dá)的研究方面有了許多報道。多個漆酶基因已實現(xiàn)了異源表達(dá),宿主有釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[6]、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)[7]和構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)[8]等。

    染料的降解已成為污水處理的首要問題[9]。各種染料在化學(xué)結(jié)構(gòu)上差異較大,而且污染后的水對生物具有毒性。由于復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu),許多染料很難降解。以往化學(xué)和物理方法處理廢水效果較差,而且成本高。白腐真菌漆酶在處理廢水中染料具有相當(dāng)大的優(yōu)勢。目前為止,白腐真菌降解染料是最有效的途徑[10],因此,通過異源表達(dá)獲得的重組漆酶對染料脫色效率的研究,以及在污水處理中的應(yīng)用有著非常重要的研究價值。

    紅平菇是一種味道鮮,具蟹味,既可作美味佳肴,又可作盆景觀賞的食用菌,也是一種白腐真菌。到目前為止,已經(jīng)對紅平菇的栽培技術(shù)、多糖的結(jié)構(gòu)和純化、抗腫瘤方面和保健功能以及相關(guān)基因等有了較深入的研究[11]。本文中所用的紅平菇菌株購自福建三明真菌研究所,菌株生長條件適合于北方地區(qū)栽培。由于紅平菇既具有食用價值,又具有分解各種合成染料的潛在能力,因此,研究其相關(guān)基因和異源表達(dá)具有十分重要意義。本文研究了紅平菇漆酶Pd-lac1基因在酵母中完成異源表達(dá)、酵母重組菌株分泌漆酶變化曲線和對不同復(fù)雜合成染料的脫色率,報道了從紅平菇中克隆的漆酶基因在畢赤酵母中實現(xiàn)了異源表達(dá)和分泌表達(dá)的產(chǎn)酶變化曲線,及重組漆酶對染料脫色的研究,為今后漆酶在治理環(huán)境方面的應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。

    1 實驗部分

    1.1 材 料

    菌株:紅平菇菌株P(guān)leurotusdjamor,由齊齊哈爾大學(xué)生物技術(shù)學(xué)科微生物實驗室提供。PichiapastorisSMD1168H(菌株號)購自Invitrogen公司;E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞,E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞,購自大連寶生物公司。

    質(zhì)粒:表達(dá)載體pPICZB購自Invitrogen公司;克隆載體pMD18-T simple veetor購自大連寶生物公司。

    YPD/Zeocin平板培養(yǎng)基:15 g/L蛋白胨;15 g/L瓊脂粉;15 g/L酵母粉;15 g/L葡萄糖; 100 μg/mL Zeocin。

    Low Salt LB液體培養(yǎng)基:10 g/L酵母粉;5 g/L胰蛋白胨;10 g/L NaCl。

    Low Salt LB/Zeocin平板培養(yǎng)基:5 g/L酵母粉;15 g/L瓊脂粉;10 g/L胰蛋白胨;5 g/L NaCl; 25 μg/mL Zeocin。

    BMMY液體培養(yǎng)基:20 g/L蛋白胨;4×10-5%生物素;10 g/L酵母粉;50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH值為6.5); 1.34% YNB;1%甲醇。

    BMGY液體培養(yǎng)基:20 g/L蛋白胨;4×10-5%生物素;10 g/L酵母粉;50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH值為6.6); 1.34% YNB; 1%甘油。

    試劑:Zeocin、XbaI、BglⅡ、EcoRI限制性內(nèi)切酶(NEB)、T4 DNA連接酶(NEB)購自Invitrogen公司;DNAquick_真菌基因組DNA提取系統(tǒng)(TIANDZ)、E.Z.N.A真菌RNA提取試劑(TIANGEN)、兩步法RT-PCR試劑盒、TaKaRa Genome Walking Kit試劑盒、質(zhì)粒DNA小提試劑盒(TIANGEN)、高保真Taq酶、DL 15,000 DNA Marker(TaKaRa)、Tryptone、Yeast Extract(Oxoid)、生物素D-biotin(sigma);山梨醇D-sorbitol(Difco);溶壁酶Lyticase(Tiangen);YNB(Difcol)、DMP(2,6-Dimethoxyphenol)、ABTS[2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic)],購自大連寶生物公司。

    1.2 紅平菇總RNA的提取

    采用文獻(xiàn)[12]中優(yōu)化后的漆酶培養(yǎng)基培養(yǎng)紅平菇。用OMEGA試劑盒提取紅平菇總RNA,產(chǎn)物用核酸檢測儀測定純度,通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗完整性。

    1.3 紅平菇漆酶Pd-lac1完整CDS序列克隆

    1.3.1試驗酶切引物的設(shè)計

    擴(kuò)增漆酶CDS序列引物如表1所示。

    表1 擴(kuò)增漆酶CDS序列引物Tab.1 Primers for amplifying laccase CDS

    1.3.2漆酶完整CDS序列的PCR擴(kuò)增

    使用二步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,以總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈擴(kuò)增,用酶切引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得漆酶CDS序列。反應(yīng)體系為50 μL,含5×Prime STARTM Buffer(Mg2+plus)9 μL,dNTP Mixture(10 mM)5 μL,Prime STARTM HS DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.5 μL,引物Pdlac1-RT1和Pdlac1-RT2各1 μL,反轉(zhuǎn)錄cDNA 5 μL。反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃ 40 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 5 min,35個循環(huán),72 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測,檢測結(jié)果用TaKaRa Genome Walking Kit試劑盒純化,與pMD18-T simple veetor連接,轉(zhuǎn)化到E.coliJM109中,在含有IPTG、X-Gal、Amp的LB瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),形成單菌落。挑取白色單菌落放入含有Amp抗性的液體LB培養(yǎng)基中,25 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)約8 h,提質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。

    1.4 紅平菇漆酶Pd-lac1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

    首先用EcoRI、XbaI限制性內(nèi)切酶將目的基因Pd-lac1與載體pMD18-T Semple Vector進(jìn)行雙酶切,之后用T4 DNA連接酶將載體與Pd-lac1基因進(jìn)行連接,獲得重組質(zhì)粒pPICZB-Pd-lac1,連接液轉(zhuǎn)化E.coliTop10,涂布在Low Salt LB/Zeocin平板上。隨機(jī)選擇轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒,用限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析,轉(zhuǎn)化后送到生物公司進(jìn)行測序,驗證目的片斷是否Pd-lac1基因。

    1.5 轉(zhuǎn)化畢赤酵母及鑒定轉(zhuǎn)化子

    pPICZB-Pd-lac1質(zhì)粒用BglⅡ進(jìn)行酶切線性化。產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收,保存?zhèn)溆?。Pichiapastoris在YPD平板上分離單菌落,28 ℃培養(yǎng)3 d,挑取酵母單菌落到5 mL YPD培養(yǎng)基中,取100~500 μL轉(zhuǎn)入100 mL YPD液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h時OD600值為1.1~1.4。獲得細(xì)胞并重懸于70 mL冰冷無菌水中, 4 ℃、4 000 r/min離心3 min,重復(fù)3次。再將菌體重懸于5 mL冰冷的1 mol/L山梨醇中,4 ℃、4 000 r/min離心3 min。最后用200 μL 1 mol/L冰冷山梨醇懸浮細(xì)胞使其終體積為400 μL。獲得感受態(tài)細(xì)胞存放在冰塊上,當(dāng)天使用。

    將質(zhì)粒pPICZB-Pd-lac1、0.2 cm電轉(zhuǎn)杯、酵母感受態(tài)細(xì)胞放在冰塊上預(yù)冷。設(shè)置轉(zhuǎn)化參數(shù):電壓為1 600 V,電擊時間為6 ms。取5~10 μg線性化的重組質(zhì)粒與60 μL感受態(tài)細(xì)胞混合,轉(zhuǎn)至0 ℃預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中。在2 s之內(nèi)按PULSE鍵2次,進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化,之后轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi),28 ℃培養(yǎng)3 h。加入1 mL YPD培養(yǎng)基,28 ℃、180 r/min培養(yǎng)3 h。取100 μL培養(yǎng)物涂布在含Zeocin的YPDS平板上,形成陽性轉(zhuǎn)化子。

    以破壁后的酵母裂解液為模板,用特異性酶切引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件同1.3.2。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,驗證Pd-lac1基因是否插入酵母染色體中。

    1.6 含漆酶酵母重組子的誘導(dǎo)表達(dá)

    將正確陽性轉(zhuǎn)化子菌落和含有空pPICZB載體的對照菌落分別接種至25 mL BMGY液體培養(yǎng)基。28 ℃振蕩培養(yǎng)至吸光值OD600為3~4之間。離心收集菌體,轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基,28 ℃、180 r/min培養(yǎng)96 h,每24 h加入無水甲醇至終用量為0.5%。每12 h取菌液進(jìn)行漆酶活性測定。

    1.7 漆酶活性測定

    1個酶活力單位定義為每分鐘氧化1 μmol底物所需的酶量。420 nm下檢測漆酶與底物在室溫反應(yīng)3 min的吸光度值。測定反應(yīng)體系為:空白對照管中加1.95 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH值為3.4)和50 μL稀釋后的酶液;檢測管中加0.95 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH值為3.4),50 μL稀釋后的酶液,1 mL濃度為1 mmol/L的ABTS。測定結(jié)果重復(fù)3次。

    1.8 粗漆酶的制備

    將重組菌畢赤酵母pPICZB-Pd-lac1接種到BMGY培養(yǎng)基,27 ℃、240 r/min 振蕩培養(yǎng)15~25 h至吸光值OD600為2~6之間;然后將粗酶液經(jīng)4 000 r/min,離心12 min,收集沉淀重新懸浮BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,同時添加0.25 mmol/L的CuSO4溶液,振蕩培養(yǎng),間隔一定時間加入5%甲醇作為誘導(dǎo)物,培養(yǎng)到第3天,離心收集粗酶液,在-80 ℃冰箱中冷凍保存。

    1.9 漆酶的純化

    對收集的上清液進(jìn)行超濾濃縮,通過DEAE-Sepharose CL-6B離子交換柱層析,再用聚乙二醇濃縮。收集漆酶蛋白,上樣到凝膠過濾層析柱SephadexG-75上,用pH值為6.5的20 mmol/L醋酸緩沖液進(jìn)行洗脫,流速設(shè)為0.5 mL/min,自動部分收集器收集100管,每管3 mL。對純化的漆酶蛋白用SDS-PAGE進(jìn)行電泳。

    1.10 粗酶液對合成染料的脫色

    染料:SN4R,杭州方順化工有限公司;甲基橙,沈陽市新光化工廠公司;孔雀綠,上海撫生實業(yè)有限公司;中性紅,天津市大茂化學(xué)試劑廠。以上染料分別置于錐形瓶內(nèi),放置在干燥、陰涼處妥善保管。

    利用紫外-可見分光光度計在300~800 nm區(qū)間掃描,得到在此區(qū)間4種染料的最大吸收峰值:孔雀綠為558 nm,吸光度=3.511;中性紅為527 nm,吸光度=3.514;甲基橙為486 nm,吸光度=1.876;SN4R為432 nm,吸光度=0.659。脫色體系中加入50 mmol/L(pH值=4.6)檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液1 mL,分別從錐形瓶中吸取1 mL(40 mg/L)待降解4種染料,最后加入重組漆酶酶液1 mL 啟動反應(yīng),在25 ℃下靜置反應(yīng),每隔一定時間檢測4種染料吸光度值為A1;以同樣方法,反應(yīng)中加入等量含pPICZB載體的酵母酶液作對照,測其吸光度值為A0。脫色率計算公式為:

    2 結(jié)果與討論

    2.1 漆酶完整CDS序列的PCR擴(kuò)增

    用酶切引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到Pd-lac1 CDS全長序列,條帶大小為1.6 kb(見圖1)。圖中:泳道1—Marker 2000; 泳道2—對照; 泳道3—樣本。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收,回收大小與PCR結(jié)果一致,約1.6 kb,將回收的CDS與載體連接、進(jìn)行轉(zhuǎn)化,篩選出陽性轉(zhuǎn)化子,挑取陽性菌落至含抗性液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),以菌液為模板進(jìn)行PCR驗證,結(jié)果為單一目的條帶,之后進(jìn)行質(zhì)粒提取,同時將菌液送到生物公司測序,進(jìn)一步驗證是否為漆酶CDS基因。將該序列測序結(jié)果輸入到GenBank中Blastx比對后,與其他真菌漆酶基因具有較高的同源性。其中與偏腫革裥菌Lenzitesgibbosa的基因序列同源性評價最高,相似性達(dá)86%,與褶孔栓菌Trametesgibbosa、氈毛栓孔菌Trametesvelutina、云芝Trametesversicolor的漆酶基因序列相似性達(dá)到77%~79%。GenBank上的登錄號為KF700372。

    圖1 Pd-lac1的RT-PCR擴(kuò)增完整CDS序列結(jié)果Fig.1 Pd-lac1 by RT-PCR amplification of complete CDS sequence results

    2.2 pPICZB-Pd-lac1表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

    將帶有自身信號肽漆酶CDS克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZB的AOX1啟動子下游(見圖2),表達(dá)載體pPICZB-Pd-lac1用EcoRI和XbaI進(jìn)行雙酶切,得到與漆酶CDS序列大小一致的片段,表明漆酶CDS序列已經(jīng)插入到表達(dá)載體pPICZB中,同時驗證了表達(dá)載體pPICZB雙酶切產(chǎn)物(見圖3)。其中泳道1為Marker 15000,泳道2~4為樣本。從Low Salt LB平板上挑取陽性轉(zhuǎn)化子,進(jìn)行菌液培養(yǎng)后,提取重組質(zhì)粒pPICZB-Pd-lac1,進(jìn)行PCR驗證。將驗證正確的重組酵母菌株接種到含有Zeocin抗性的YPD培養(yǎng)基上,篩選轉(zhuǎn)化子。在YPD/Zeocin培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取3個重組酵母單菌落,破壁后分別用帶酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR驗證(見圖4)。圖中:泳道1為Marker 2000;泳道2為對照;泳道3~5為樣本。

    圖2 重組表達(dá)載體pPICZB-Pd-lac1結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Construction of P. djamor expression pPICZB-Pd-lac1

    注:1—pPICZB載體質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物;2—重組質(zhì)粒雙 酶切驗證結(jié)果;3—完整CDS序列擴(kuò)增結(jié)果。圖3 酶切驗證結(jié)果Fig.3 Digested validation results

    圖4 重組酵母菌落PCR鑒定結(jié)果Fig.4 Direct PCR screening of recombinant Pichia colonies

    2.3 重組漆酶的誘導(dǎo)表達(dá)

    分別挑取8株含有重組表達(dá)載體pPICZB-Pd-lac1和1株含空載體pPICZB的重組酵母進(jìn)行培養(yǎng),從誘導(dǎo)開始,每天檢測重組菌漆酶酶活。從前者發(fā)酵液中檢測到漆酶酶活,空載體對照中沒有檢測到。酶活性較高的重組菌株發(fā)酵液,在72 h時最高漆酶活性達(dá)到54 U/L,之后漆酶活性逐漸下降(見圖5)。

    圖5 重組畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的漆酶活性Fig.5 Enzyme activity of laecase of recombinant Pichia Pastoris under indueing condition

    重組菌株在甲醇誘導(dǎo)下,第3天漆酶活性達(dá)到最高(54 U/L),是原菌株漆酶活性的1.5倍,并且重組菌漆酶誘導(dǎo)時間比原菌株縮短了6 d[12]。近幾年,F(xiàn)lammulinavelutipes[13]、Pycnoporuscinnabarinus[14]、Pleurotussajor-caju[15]、Coriolusversicolor[16]和Trametessp. 420[17]等已經(jīng)實現(xiàn)異源表達(dá),前3個重組菌株漆酶活性比本研究漆酶活性低;后2個重組菌株漆酶活性比本研究漆酶活性高,可能與表達(dá)載體選用自身信號肽有關(guān),以及培養(yǎng)方法和條件因素有關(guān)。為提高紅平菇漆酶基因在畢赤酵母中表達(dá)的活性,在今后工作中可采取液體發(fā)酵罐并實施高密度發(fā)酵;或者通過培養(yǎng)基的優(yōu)化提高重組畢赤酵母pPICZB-Pd-lac1的高密度表達(dá);還可對重組菌株進(jìn)行純化。通過以上方法,紅平菇漆酶基因異源表達(dá)活性會得到進(jìn)一步提高,從而實現(xiàn)重組菌株分泌目的蛋白在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

    2.4 漆酶的分離純化

    將培養(yǎng)6 d后的重組酵母粗酶液進(jìn)行超濾,SephadexG-75凝膠層析和DEAE-Sepharose陰離子交換層析純化后經(jīng)檢測為單一條帶,大小約為62.5 kDa,與預(yù)測紅平菇漆酶分子質(zhì)量大小相似,表明大部分雜蛋白在純化過程中得到去除(見圖6)。圖中:泳道1—對照; 泳道2—樣本; 泳道3—Marker。

    圖6 漆酶純化后的SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE of recombinant laccase fron P. pastoris

    2.5 重組菌株漆酶Pd-lac1對染料的脫色

    分別在4種染料最大吸收峰下檢測其吸光度,從而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用BMMY培養(yǎng)基培養(yǎng)Pd-lac1重組畢赤酵母菌株,當(dāng)漆酶活性到達(dá)最大值時,每間隔12 h吸取1 mL粗酶液,6 000 r/min離心4 min,檢測重組漆酶對不同染料的脫色效率。反應(yīng)體系:檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH值3.4)1 mL、粗酶液1.5 mL和不同種染料2.5 mL。反應(yīng)條件為25 ℃。空白實驗不加粗酶液檢測對染料脫色效率。所有數(shù)據(jù)均重復(fù)3次取平均值。SMD1168H(pPICZB)作對照。

    經(jīng)過計算,Pd-lac1重組畢赤酵母菌株對SN4R的脫色率在24 h達(dá)到最大值,為52.8%,對中性紅、甲基橙和孔雀綠在24 h脫色效率達(dá)到最大值,分別為14.8%、14.5%和0.24%;而對照組隨著時間變化都沒有檢測到脫色效果,對4種染料脫色效率隨時間變化曲線見圖7。

    圖7 Pd-lac1重組畢赤酵母菌株對染料脫色效率結(jié)果Fig.7 Decolorization efficiency of Pd-lac1 recombinant Pichia strains on alizarin red (a), neutral red (b), methyl orange (c), and malachite green (d)

    3 結(jié) 論

    隨著人工合成染料的使用量及排放量的逐年上升,環(huán)境污染及水體污染問題日趨嚴(yán)重。SN4R、甲基橙、中性紅和孔雀綠4種染料在自然水體中很難被生物降解,而且還具有毒性,另外染料還會影響水體的透明度,使水體質(zhì)量受到嚴(yán)重的破壞。本文研究結(jié)果顯示,重組菌株漆酶在不需要小分子介體物質(zhì)的參與情況下,對4種合成染料都具有降解能力。并且對SN4R染料的降解,在24 h脫色率達(dá)到53.8%,而原菌株紅平菇粗酶液對SN4R染料在24 h時脫色率為49.4%,證明重組菌株漆酶具有較高的脫色效率;而對中性紅、甲基橙、孔雀綠3種染料的脫色效率較低,因為SN4R屬于蒽醌類染料,化學(xué)結(jié)構(gòu)比雜環(huán)類中性紅、偶氮類甲基橙和三苯基甲烷類孔雀綠相對簡單,容易分解,因此重組菌株漆酶對SN4R染料脫色具有較大的應(yīng)用潛力,進(jìn)而對含蒽醌類染料廢水處理具有更好的應(yīng)用前景。

    總之,本文研究從Pleurotusdjamor克隆了一條漆酶基因,并實現(xiàn)了在畢赤酵母中的異源表達(dá)及重組漆酶對不同染料的脫色效率,為進(jìn)一步研究異源表達(dá)優(yōu)化后染料脫色及重組漆酶純化奠定了基礎(chǔ)。

    FZXB

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