彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)在不同細(xì)胞DNA損傷檢測(cè)中的應(yīng)用

陳果 李曄

摘要：文章對(duì)彗星實(shí)驗(yàn)在不同真核生物細(xì)胞DNA損傷中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，并介紹了基于彗星實(shí)驗(yàn)對(duì)植物、動(dòng)物、人體細(xì)胞損傷的研究成果，同時(shí)也對(duì)彗星實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用范圍、發(fā)展趨勢(shì)和前景做出了展望。

關(guān)鍵詞：彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)；DNA損傷；真核細(xì)胞；損傷檢測(cè)；遺傳毒理問題 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：Q523 文章編號(hào)：1009-2374（2016）06-0055-03 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2016.06.028

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、城市化進(jìn)程加快，環(huán)境問題成為人們?nèi)找骊P(guān)注的熱點(diǎn)問題。工業(yè)三廢、電離輻射、化學(xué)農(nóng)藥等有毒有害物質(zhì)對(duì)生物界造成了極大的危害，它們不但影響生物的生命活動(dòng)，而且會(huì)影響下一代的遺傳性狀。因此，研究DNA損傷等遺傳毒理問題對(duì)于環(huán)境安全評(píng)價(jià)具有重要的意義。

目前，DNA損傷的檢測(cè)方法可以分為間接檢測(cè)DNA損傷和直接檢測(cè)DNA損傷。彗星實(shí)驗(yàn)是直接檢測(cè)DNA損傷的一種方法，也稱單細(xì)胞凝膠電泳，1984年由Ostling建立，經(jīng)Singh等改進(jìn)。該檢測(cè)方法具有靈敏度高、所需樣品量少、應(yīng)用范圍廣、材料消耗少、技術(shù)簡(jiǎn)單、時(shí)間短、可進(jìn)行單細(xì)胞水平的原位檢測(cè)等特點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于真核細(xì)胞的DNA損傷與修復(fù)、遺傳毒理、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等相關(guān)研究中。

目前關(guān)于彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展大多從其應(yīng)用領(lǐng)域、范圍著手，一定意義上限制了彗星實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞層面上的科學(xué)意義以及更寬泛的應(yīng)用前景。文章從細(xì)胞角度切入，歸納總結(jié)近些年真核細(xì)胞作為彗星實(shí)驗(yàn)在應(yīng)用發(fā)展過程中所存在的問題，并就其發(fā)展提出發(fā)展暢想。

1 彗星實(shí)驗(yàn)

彗星實(shí)驗(yàn)原理是細(xì)胞經(jīng)過實(shí)驗(yàn)中裂解、DNA解鏈等過程后，電泳時(shí)損傷的DNA從核中溢出，朝陽極方向泳動(dòng)，產(chǎn)生一個(gè)尾狀帶，未損傷的DNA部分保持球形，二者共同形成“彗星”。在一定范圍內(nèi)，“彗星”的長(zhǎng)度（代表DNA遷移距離）和經(jīng)熒光染色后“彗星”熒光強(qiáng)度與DNA損傷程度相關(guān)，這樣就可以定量檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中的DNA損傷。通常實(shí)驗(yàn)經(jīng)過四個(gè)步驟：裂解、解旋、電泳及染色、鏡檢和圖像分析。

1.1 裂解

裂解細(xì)胞的目的是破膜、去蛋白，以便使斷裂的DNA片段能夠在外電場(chǎng)作用下從細(xì)胞核中遷移出來。去除細(xì)胞內(nèi)蛋白主要有兩種方法高鹽鹽析和蛋白消化。

1.2 解旋

解旋是為了能夠降解對(duì)實(shí)驗(yàn)干擾的RNA，將雙鏈DNA變成單鏈。通常采用pH大于13的堿性解旋液。這是因?yàn)楦邏A能夠降解RNA，同時(shí)又會(huì)讓DNA氫鍵斷裂解螺旋，變成單鏈。

1.3 電泳及染色

通常根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)定場(chǎng)強(qiáng)0.5～14V/cm，室溫下進(jìn)行電泳。要求靈敏度時(shí)必須在可控溫條件下進(jìn)行。通常采用溴化乙錠（EB）染色。但有研究發(fā)現(xiàn)YOYO-1比EB有更高的熒光強(qiáng)度。

1.4 鏡檢和圖像分析

顯微鏡可直接觀察到彗星實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，分析通常采用商業(yè)軟件，較出名的有Komet，由Kinetic公司開發(fā)。

2 彗星實(shí)驗(yàn)對(duì)不同真核細(xì)胞DNA損傷檢測(cè)應(yīng)用

理論上，幾乎所有的真核細(xì)胞發(fā)生的DNA損傷都可以用彗星實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)，包括人工培養(yǎng)的細(xì)胞株或者從動(dòng)物組織分離出來的細(xì)胞，都可在離體或活體染毒后進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)，但實(shí)際應(yīng)用中受到很多限制。

2.1 對(duì)動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷檢測(cè)

動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷檢測(cè)的應(yīng)用多集中在對(duì)動(dòng)物血液、淋巴和骨髓細(xì)胞、肝腎等臟器細(xì)胞、生殖細(xì)胞等方面DNA損傷的檢測(cè)。

2.1.1 動(dòng)物血液和骨髓、淋巴細(xì)胞DNA損傷檢測(cè)。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液、骨髓、淋巴細(xì)胞DNA損傷檢測(cè)實(shí)驗(yàn)在近些年被廣泛應(yīng)用到新藥評(píng)價(jià)、生物醫(yī)藥學(xué)、環(huán)境遺傳物質(zhì)檢測(cè)、環(huán)境檢測(cè)、生物監(jiān)測(cè)以及海洋毒性物質(zhì)檢測(cè)等各個(gè)領(lǐng)域中來，并且也進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)條件的改造和

優(yōu)化。

Clements et al用五種除草劑在燒杯中對(duì)牛蛙的蝌蚪進(jìn)行直接暴露實(shí)驗(yàn)，收集紅細(xì)胞立即進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示所有的除草劑均能引起彗星尾巴的增多。王軍霞等人研究了甲苯和甲醛聯(lián)合吸入染毒方式對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞的遺傳毒性作用，結(jié)果顯示甲醛和甲苯這兩種物質(zhì)對(duì)骨髓細(xì)胞彗星尾部DNA含量、彗星細(xì)胞尾距形成均有

影響。

2.1.2 動(dòng)物臟器細(xì)胞DNA損傷檢測(cè)。彗星實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物DNA損傷檢測(cè)中應(yīng)用最多的集中在臟器損傷檢測(cè)?？捎糜阱缧菍?shí)驗(yàn)的生物組織多種多樣，比如無脊椎動(dòng)物的肌肉、腮、生殖腺、胚胎組織、消化腺、足、虹吸管等，脊椎動(dòng)物的肝臟、腎臟、腸、脾、肌肉、腮、生殖腺以及植物和藻類的細(xì)胞等。

Nacci et al將苯并[a]芘添加到比目魚食物中，發(fā)現(xiàn)魚體只有腸道細(xì)胞DNA損傷具有統(tǒng)計(jì)意義。張青碧等人用小鼠肝細(xì)胞彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)飲用水氯化消毒前后的誘變性，結(jié)果表明：水源水和氯化消毒飲用水都能誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷，經(jīng)氯化消毒過后的飲用水其消毒產(chǎn)生的氯化副產(chǎn)物比水源水具有更強(qiáng)的致突變性。

2.1.3 動(dòng)物生殖細(xì)胞DNA損傷檢測(cè)。對(duì)生殖細(xì)胞的DNA損傷檢測(cè)是遺傳毒性檢測(cè)的一部分，也是基因毒性檢測(cè)的一部分。越來越多的環(huán)境毒物暴露是此項(xiàng)檢測(cè)越來越普遍的一個(gè)最重要的原因，盡管這些檢測(cè)的方法基本一致，但對(duì)人類“趨利避害”還是具有重要意義的。

王曉平等人用不同劑量的甲醛對(duì)小鼠睪丸細(xì)胞進(jìn)行染毒，用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)睪丸細(xì)胞的損傷效應(yīng)，結(jié)果顯示：甲醛在10、25、50μg·L-1時(shí)具有斷裂效應(yīng)，在75μg·L-1時(shí)既有斷裂也有交聯(lián)作用。甲醛致睪丸細(xì)胞斷裂的臨界濃度在10μg·L-1左右，峰值濃度在50μg·L-1附近。郭紅剛等為了研究丙烯酰胺致小鼠睪丸細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞DNA的損傷及修復(fù)情況，結(jié)果表明，兩種組織細(xì)胞可能是丙烯酰胺的作用位點(diǎn)；機(jī)體對(duì)丙烯酰胺造成的遺傳損傷有一定的修復(fù)能力；與淋巴細(xì)胞相比，睪丸細(xì)胞對(duì)丙烯酰胺導(dǎo)致的遺傳損傷更為敏感。高紅霞等人選取三類污灌農(nóng)田土壤為研究對(duì)象，地下水灌溉的土壤為對(duì)照，提取土壤中的有機(jī)物，并用彗星試驗(yàn)檢測(cè)土壤有機(jī)提取物對(duì)原代大鼠肝細(xì)胞DNA的損傷情況。結(jié)果顯示四組有機(jī)物的三個(gè)劑量組（0.3g·mL-1、0.6g·mL-1、0.9g·mL-1）均可導(dǎo)致DNA遷移長(zhǎng)度增加，拖尾率增高；污灌的三組與對(duì)照組相同染毒劑量比較，DNA遷移長(zhǎng)度增加，拖尾率增高。

2.2 對(duì)植物細(xì)胞DNA損傷檢測(cè)

1996年Kappen首次將彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)引入到植物研究中，利用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到遺傳毒性物質(zhì)能夠引起蠶豆根尖DNA雙鏈斷裂。近些年來，彗星實(shí)驗(yàn)在植物環(huán)境檢測(cè)、污染治理和生態(tài)評(píng)估等方面的應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛和

普遍。

張旭紅等人以蠶豆為研究對(duì)象，采用堿性、半堿性和中性彗星實(shí)驗(yàn)方法研究Cd對(duì)植物DNA的損傷，結(jié)果表明Cd能夠引起蠶豆葉片DNA損傷，但是不同Cd濃度引起DNA損傷的種類不同。林愛軍等研究證實(shí)，骨炭灰能夠有效降低水溶態(tài)和交換態(tài)Pb、Cr、Cu的濃度，從而可以有效降低重金屬在植物體內(nèi)累積，減少因重金屬污染對(duì)食物鏈上游生物的危害，通過植物彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入骨炭灰后植物細(xì)胞DNA損傷明顯降低。

2.3 對(duì)人體細(xì)胞DNA損傷檢測(cè)

對(duì)人體細(xì)胞DNA損傷檢測(cè)大體分為兩大類：一類是對(duì)經(jīng)常接觸有毒有害物質(zhì)的正常人群損傷檢測(cè)；另一類是對(duì)患者或者培養(yǎng)的人類癌細(xì)胞或者病變細(xì)胞的損傷檢測(cè)。這些檢測(cè)應(yīng)用廣泛，但方法上還需略微改進(jìn)。

2.3.1 對(duì)人體正常細(xì)胞DNA損傷檢測(cè)。李林鵬等人為了評(píng)估三氯生（TCS）和三氯卡班（TCC）對(duì)人體的遺傳毒性，利用彗星實(shí)驗(yàn)研究?jī)煞N污染物對(duì)正常人肝細(xì)胞（L02）DNA的損傷效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：三氯生和三氯卡班皆能引起人體肝細(xì)胞的DNA損傷，并呈現(xiàn)顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。相比于TCS而言，L02細(xì)胞對(duì)TCC更為敏感，在低暴露劑量（2.38μmol·L-1）下就可以引起DNA斷裂損傷。孫明霞等人將人晶狀體上皮細(xì)胞（hLECs）置于sXc-1800細(xì)胞輻照系統(tǒng)內(nèi)連續(xù)輻照2h，輻照強(qiáng)度[比吸收率（specific absorption rate，SAR）]輻照A、B、C、D組分別為1.0、2.0、3.0、4.0W·kg-1，輻照后0.0、0.5、1.0h分別進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞DNA的損傷及其修復(fù)情況，結(jié)果表明：SAR≤3W·kg-1的1.8GHz手機(jī)微波短期急性作用對(duì)體外培養(yǎng)的hLECs的DNA不產(chǎn)生或產(chǎn)生可修復(fù)的損傷，對(duì)其后的細(xì)胞增殖情況亦無影響，4.0W·kg-1的輻照劑量可導(dǎo)致細(xì)胞DNA不可逆性損傷，使細(xì)胞的增殖率下降。

對(duì)人體細(xì)胞的檢測(cè)因其直接性，往往能夠直觀地說明人體受損傷情況及保護(hù)和回復(fù)情況。理論上人體細(xì)胞是可以做這種檢測(cè)的，這對(duì)于人體健康來說具有很重大的意義。但實(shí)際上并非如此，盡管人體細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)很成熟，但人體對(duì)于異型生物質(zhì)、毒物等的處理機(jī)制還是不能通過這些直接檢測(cè)手段完全驗(yàn)證。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)綜合運(yùn)用又具有一定的實(shí)行障礙，所以對(duì)人體細(xì)胞的DNA損傷檢測(cè)結(jié)果和方法上的探討是下一步彗星實(shí)驗(yàn)在人體細(xì)胞損傷檢測(cè)上的一個(gè)重要方向。

2.3.2 對(duì)人體病變細(xì)胞DNA損傷檢測(cè)的應(yīng)用。孫麗蕊等人取15例宮頸鱗癌放療患者放療前及放療累積劑量為0Gy、10Gy、20Gy、30Gy、40Gy、50Gy、60Gy時(shí)的外周靜脈血，以彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)淋巴細(xì)胞的DNA損傷，結(jié)果表明：各累積劑量組淋巴細(xì)胞DNA拖尾率比照射前顯著升高（P<0.01）。史夢(mèng)等用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的K562細(xì)胞、伊馬替尼預(yù)處理K562細(xì)胞的DNA損傷模型；用彗星實(shí)驗(yàn)對(duì)各組細(xì)胞在DNA損傷后的修復(fù)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)。結(jié)果顯示，經(jīng)伊馬替尼預(yù)處理的K562細(xì)胞修復(fù)時(shí)間為120min，與未處理組修復(fù)時(shí)間60min相比，前者DNA損傷修復(fù)時(shí)間明顯延長(zhǎng)（F=97.79，P<0.05）。

對(duì)病變或者癌癥細(xì)胞的DNA損傷檢測(cè)屬于醫(yī)學(xué)檢測(cè)的范圍，通常是被用作一種驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行。而且需要將彗星實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)定量化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才能更有用、有效。因此要與其他實(shí)驗(yàn)結(jié)合才能更好地說明某種物質(zhì)的損傷程度或者某種損傷的機(jī)制。

3 展望

彗星實(shí)驗(yàn)作為一種檢測(cè)真核細(xì)胞中DNA雙鏈單鏈斷裂的方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用到遺傳毒理、環(huán)境生態(tài)監(jiān)測(cè)、臨床、飲食、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡等研究。在中國(guó)尤其是從2002年至今，該方法已被熟練應(yīng)用到DNA損傷檢測(cè)中，但對(duì)于微生物和原生動(dòng)物的DNA彗星實(shí)驗(yàn)一直很少，這主要是由于微生物和原生動(dòng)物的自身結(jié)構(gòu)及DNA含量少等原因造成的。但由于微生物、原生動(dòng)物對(duì)于環(huán)境污染程度具有良好的指示作用，因此微生物、原生動(dòng)物的彗星實(shí)驗(yàn)成為彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)展的一個(gè)新方向。但在實(shí)際應(yīng)用過程中彗星實(shí)驗(yàn)缺乏一個(gè)針對(duì)特定細(xì)胞相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)體系，而且對(duì)DNA損傷檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)缺乏機(jī)制性的探討。

彗星實(shí)驗(yàn)的未來發(fā)展趨勢(shì)：一是針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法上的創(chuàng)新改進(jìn)；二是對(duì)于某些實(shí)驗(yàn)中最主要的步驟要標(biāo)準(zhǔn)化；三是彗星實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)結(jié)果分析要透徹；四是對(duì)于微生物和原生生物等其他真核生物的應(yīng)用。隨著彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，相信彗星實(shí)驗(yàn)可以在解決實(shí)際科學(xué)問題方面以及實(shí)際應(yīng)用方面都會(huì)取得卓越的成績(jī)。

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基金項(xiàng)目：環(huán)保公益項(xiàng)目（201109039）。

作者簡(jiǎn)介：陳果（1976-），男，沈陽環(huán)境科學(xué)研究院工程師，研究方向：危險(xiǎn)廢物處置與污染場(chǎng)地修復(fù)技術(shù)。

（責(zé)任編輯：陳 潔）