茶樹中性/堿性轉化酶基因CsINV10的克隆與表達分析

錢文俊　岳　川　曹紅利　郝心愿　王　璐　王玉春黃玉婷　王　博　王新超　肖　斌　楊亞軍,*西北農(nóng)林科技大學園藝學院, 陜西楊凌 700;中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所 / 國家茶樹改良中心 / 農(nóng)業(yè)部茶樹生物學與資源利用重點實驗室, 浙江杭州 30008

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茶樹中性/堿性轉化酶基因CsINV10的克隆與表達分析

錢文俊1,2岳川2曹紅利2郝心愿2王璐2王玉春1,2黃玉婷2王博2王新超2肖斌1,*楊亞軍1,2,*
1西北農(nóng)林科技大學園藝學院, 陜西楊凌 712100;2中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所 / 國家茶樹改良中心 / 農(nóng)業(yè)部茶樹生物學與資源利用重點實驗室, 浙江杭州 310008

摘要:基于課題組前期對茶樹冷馴化系統(tǒng)的轉錄組測序分析結果, 從中挑選出6條與中性/堿性轉化酶基因高度相似的EST序列, 電子拼接和RT-PCR驗證后獲得一條全長為2101 bp的核酸序列。該基因包含1923 bp的ORF, 編碼640個氨基酸, 蛋白分子量為71. 8 kD, 理論等電點為5.69。根據(jù)BlastX同源性比對顯示, 該基因與荔枝LcNI相似性最高(80%), 為G100家族成員, 屬于中性/堿性轉化酶基因, 將其命名為CsINV10 (GenBank登錄號為KT359348)。對CsINV10氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹分析顯示, 其與木薯MeNINV8親緣關系最近。進一步分析顯示, CsINV10的氨基酸序列無N端信號肽, 無跨膜結構域, 屬于親水性蛋白, 并定位在葉綠體上。熒光定量PCR分析表明, CsINV10具有組織表達特異性, 在茶樹葉和花中的表達量最高, 根系中最低。分析發(fā)現(xiàn), 低溫(4℃)、干旱和鹽脅迫分別處理茶樹1 d后, 成熟葉片中CsINV10的表達呈逐漸上升趨勢; 而在ABA條件處理下, 該基因呈先升高后降低趨勢, 在處理5 d后基本不表達, 表明該基因可能參與茶樹對多種逆境脅迫的響應, 這為后續(xù)進一步研究轉化酶基因在茶樹抗寒等逆境脅迫中的作用奠定基礎。

關鍵詞:茶樹; 中性/堿性轉化酶基因; 定量分析

本研究由國家自然科學基金項目(31170650), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項(CARS-23), 浙江省自然科學基金項目(LY14C160001),浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大專項(2012C2905-3)和中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程項目(CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31170650), the Earmarked Fund for China Agriculture Research System (CARS-23), the Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LY14C160001), the Major Project for New Agricultural Varieties Breeding of Zhejiang Province (2012C2905-3) and the Chinese Academy of Agricultural Sciences through an Innovation Project for Agricultural Sciences and Technology (CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS).

第一作者聯(lián)系方式: E-mail: jajyqian9066@mail.tricaas.com

蔗糖作為非還原型雙糖, 在大多數(shù)植物中基于異養(yǎng)型組織的生理和生化需要, 被運送到不同的亞細胞區(qū)域, 水解為葡萄糖和果糖, 參與到三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑中, 以維持植物正常生長發(fā)育和對逆境脅迫的抗性。雙糖中的碳可用于生物合成原初代謝, 對植物生長發(fā)育非常重要。同樣, 蔗糖可能轉化為聚合物, 如淀粉、三酸甘油酯或多肽用于長期儲存; 或者形成次級化合物使植物能夠適應各種生物和非生物逆境脅迫[1]。蔗糖作為碳水化合物和能量的來源, 關鍵在于其能夠水解為己糖, 在植物中主要靠兩類蔗糖水解酶來催化這一反應: (i)蔗糖合成酶(Suc, EC2.4.1.13), 是一類糖基轉移酶, 能夠可逆水解蔗糖形成尿苷二磷酸葡萄糖和果糖, 主要在器官成熟過程中參與維持庫強的穩(wěn)固和合成庫產(chǎn)物方面起作用; (ii)轉化酶(INV, EC3.2.1.26), 能夠不可逆地將蔗糖水解為葡萄糖和果糖, 在蔗糖分布和調控“庫—源”關系方面具有十分重要的作用[2-4], 同時,該類酶能廣泛參與調控植物生長、信號響應、原初碳代謝和逆境脅迫響應等方面[5-8]。

根據(jù)不同的細胞定位, 轉化酶可以分為胞質轉化酶(cytoplasmic invertase, CIN)、液泡轉化酶(vacuolar invertase, VIN)和細胞壁結合轉化酶(cell wall invertase, CWIN)三類, 其中CIN又可分為α和β亞族, α亞族主要定位于細胞器, 如線粒體和葉綠體; β亞族則主要定位于核內(nèi)。而根據(jù)其生化活性和pH的不同又可分為酸性轉化酶(acid invertase, AI)和中性/堿性轉化酶(alkaline/neutral invertase, A/N-Inv)[9],前者pH在5.0左右時有較高的酶活性, 而后者pH 6.5～8.0左右時具有較高的轉化酶活性。A/N-Inv還存在2種不同的異構體, 最佳酶活pH為6.5時為中性轉化酶, pH為8.0時為堿性轉化酶[10]。

目前, 關于轉化酶在植物中作用的研究已經(jīng)非常廣泛, 特別是對酸性轉化酶的研究, 涉及到酸性轉化酶對植物生長發(fā)育、開花結果、生物和非生物逆境脅迫響應等各方面[11-18]。然而, 由于A/N-Inv并未被糖基化, 蛋白很難純化, 具有不穩(wěn)定性和較低的酶活性, 使得目前關于這類酶的研究較之酸性轉化酶少。近年來, 陸續(xù)在胡蘿卜[4]、小麥[10]、擬南芥[19]、水稻[20]、葡萄[21]、楊樹[22]、百脈根[23]、甘蔗[24]、番茄[25]、木薯[26]等中克隆出A/N-Inv基因。最近的研究表明, A/N-Inv在植物生長和發(fā)育、能量代謝、碳水化合物平衡和環(huán)境脅迫響應方面也發(fā)揮著重要作用[10, 27-30]。借助于植物中的A/N-Inv基因突變, 證明A/N-Inv基因在植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。例如, 在擬南芥中有研究表明A/N-Inv功能的喪失能夠降低根系原初生長[28,31], 另外, 敲除擬南芥葉綠體中一個At-A/N-InvE能夠降低擬南芥中A/N-Inv活性, 并且在突變體植株中既檢測不到A/N-Inv活性也檢測不到含有A/N-Inv蛋白, 同時還伴隨著淀粉含量的減少[27]。在水稻中突變一個與擬南芥同源的A/N-Inv基因OsCyt-inv1會導致水稻突變體根系變短, 推遲開花和部分不育, 然而通過外源施用葡萄糖又能修復根系的生長[32]。相似地, 在百脈根中將一個A/N-Inv基因LjINV2突變后發(fā)現(xiàn)其A/N-Inv活性和表型都不受影響, 然而, 對另一個A/N-Inv基因LjINV1突變處理發(fā)現(xiàn), 其能夠降低A/N-Inv活性, 且極大降低根系和莖干生長, 同時阻遏花粉形成和損害開花。有趣的是, 這種突變體能夠形成功能性根瘤, LjINV1對植物整體生長具有重要作用, 但對莖節(jié)的形成和功能卻并不重要[23]。然而, 目前依然未知A/N-Inv是如何調控細胞的生長, 同時, 有關A/N-Inv基因在響應植物逆境方面的作用研究也報道較少。

茶樹作為多年生常綠葉用植物, 其生長和分布受到溫度、光照、土壤、水分等多種環(huán)境因子的影響, 其中溫度是限制茶樹自然分布和產(chǎn)量的主要因素。近年來, 茶樹低溫危害成為茶葉生產(chǎn)最常見的環(huán)境逆境, 嚴重影響了茶葉的產(chǎn)量與經(jīng)濟效益。為此, 如何提高茶樹抗寒性以抵御低溫傷害已是近幾年眾多研究者們所關注的熱點問題。眾多研究表明,植物抗寒性的提高需要經(jīng)過一定時間和程度的低溫冷馴化才能表現(xiàn)出來[33]。Wang等[34]對冷馴化條件下的茶樹進行轉錄組全局分析發(fā)現(xiàn), 茶樹在冷馴化條件下總共有1770個差異表達基因, 這些差異基因主要包括低溫感應或信號轉導基因、低溫響應轉錄因

子基因、滲透響應相關基因等, 此外, 通過對這些基因的KEGG途徑搜索發(fā)現(xiàn), 碳水化合物代謝途徑和鈣離子信號途徑在茶樹響應低溫脅迫方面起主要作用。Yue等[35]進一步研究發(fā)現(xiàn), 隨著茶樹的冷馴化,茶樹成熟葉中的可溶性糖含量逐漸增加, 其中蔗糖(Suc)、葡萄糖(Glc)、果糖(Fru)和半乳糖(Gal)的含量在抗寒性階段達到最大, 隨著脫馴化又逐漸降低;且蔗糖等的含量變化與茶樹抗寒能力密切相關。A/N-Inv作為蔗糖水解的關鍵酶類, 其在茶樹冷馴化誘導抗寒性方面也可能起重要作用, 但關于該類基因在茶樹中的研究報道較少。本研究在課題組前期轉錄組測序的基礎上, 拼接克隆一個CsINV10,通過對該基因生物信息學分析和表達模式的研究,旨在為深入研究A/N-Inv在響應茶樹逆境脅迫方面的作用和探索冷馴化誘導茶樹抗寒的分子機制奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

試驗材料為2年生國家級茶樹良種龍井43扦插苗, 種植于中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所內(nèi)實驗基地。試驗試劑主要有SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real-time)試劑盒、Prime Script RT Reagent Kit、克隆載體pMD18-T、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞和rTaq酶均購自TaKaRa公司(大連); PCR SuperMix、逆轉錄酶SuperScript III和PCR Cleanup Kit購自Invitrogen公司(Carlsbad, USA); DNA Marker購自Axygen公司(California, USA); RNA提取試劑CTAB、EDTA、LiCl、β-巰基乙醇、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。引物合成和基因測序由上海華津生物有限公司完成。

1.2總RNA提取及cDNA的合成

參照岳川等[36]所述方法提取不同處理樣品的總RNA, 然后分別參照SuperScript III試劑盒和Prime Script RT Reagent試劑盒說明書反轉錄合成基因擴增用cDNA和表達分析用cDNA。

1.3CsINV10基因克隆

基于課題組前期對冷馴化茶樹的轉錄組測序結果[34], 從中篩選出6條與其他物種中A/N-Inv基因同源的EST序列, 在Seqman軟件中對這些序列進行拼接, 將拼接好的序列在NCBI中進行BlastX同源比對分析, 最后根據(jù)拼接好的序列設計相應引物進行RT-PCR驗證(引物如表1所示)。PCR反應含PCR SuperMix 45 μL、cDNA 1.0 μL、上下游引物各1.0 μL, 加ddH2O至終體積50 μL; 反應程序為94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 2.5 min, 35個循環(huán); 72℃10 min; 4℃保存。PCR反應后, 利用1%瓊脂糖凝膠電泳, 將獲得的條帶利用PCR Cleanup Kit回收純化, 取2 μL回收產(chǎn)物與pMD18-T載體后轉化到大腸桿菌DH5α中進行藍白斑篩選, 菌液PCR后挑選陽性單克隆測序。

1.4生物信息學分析

利用DNASTAR軟件包中的Seqman軟件對CsINV10全長序列進行拼接, Editseq進行ORF查詢; 在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別用BlastN和BlastX對核酸序列和氨基酸序列進行同源性分析; 在ClustalX 2.0軟件中對多序列比對后, 利用DNAMAN和MEGA 5.0輸出同源比對和進化樹構建結果[37]。用ProtParam預測蛋白分子量、等電點、氨基酸組分等[38]; SignalP 4.1 Server進行信號肽預測[39], TMHMM Server v. 2.0預測蛋白的跨膜結構, ProtScale Sever在線分析分析蛋白疏水性, GOR4在線分析CsINV10蛋白的卷曲螺旋結構, TargetP1.1預測該蛋白的亞細胞定位[40], SMART服務器分析CsINV10蛋白的結構功能, NetPhos 2.0 Server[41]和YinOYang 1.2 Server[42]預測蛋白磷酸化和糖基化位點, SWISS-MODEL預測該蛋白的三級結構, 通過Phymol軟件編輯得到蛋白三維結構模型[43]。

表1　RT-PCR和qRT-PCR引物對Table 1　RT-PCR and qRT-PCR primers

1.5CsINV10不同組織中的表達分析

以實驗室保存的龍井43茶樹不同組織(根、莖、葉、花)為材料進行qRT-PCR分析, 參照岳川等[36]所述方法取樣, 以生長于露天茶園的大小和長勢基本一致的2年生盆栽龍井43品種茶樹為材料, 在開花季(10月)分別取茶樹頂端成熟葉、莖干、根系和花在液氮中速凍后–80℃保存?zhèn)溆?。以茶樹PTB為內(nèi)參基因[44], 熒光定量反應體系為SYBR Premix Ex Taq 10 μL、上下游引物(10 μmol L–1)(表1)各1 μL、ROX Dye II 0.6 μL、cDNA 2 μL, 加水至終體積20 μL。充分混勻, 短暫離心后, 于ABI PRISM 7500實時定量PCR 儀上進行PCR擴增, 反應程序為95℃15 s; 94℃ 5 s, 60℃ 34 s進行40個循環(huán)后增加熔解曲線。每個處理進行3次生物學重復和3次技術學重復, 最后采用2–ΔΔCT法[45]分析結果, 并用SPSS18.0軟件分析差異顯著性。

1.6CsINV10不同非生物脅迫下的表達分析

對不同脅迫處理(低溫、鹽分、干旱、ABA)茶樹成熟葉片進行CsINV10的qRT-PCR分析。參照曹紅利等[46]所述, 選取6盆大小和長勢基本一致的盆栽茶樹于LED冷光源植物氣候箱中(24℃, 16 h光照/8 h黑暗, 濕度65%)培養(yǎng)兩周后進行4℃低溫處理,分別在處理后0 h、1 h、3 h、9 h、1 d、2 d、3 d和4 d取茶樹頂端第3片成熟葉進行基因表達分析。在溫室中分別隨機選取3盆大小和長勢基本一致的茶樹, 用250 mmol L–1NaCl溶液以澆灌的方式進行鹽分處理; 同樣, 另取3盆茶樹用100 mmol L–1的ABA溶液均勻噴灑在茶樹新稍上, 在處理后0 h、1 h、3 h、9 h、1 d、3 d和5 d分別取茶樹頂端第3片成熟葉進行基因表達分析。參照岳川等[36]所述方法, 將3盆大小和長勢基本一致的茶樹從盆中取出, 用自來水清洗根系并在純凈水中平衡15 min后, 將茶樹放入10% (w/v) PEG-6000溶液中進行干旱脅迫處理, 處理時間和取樣方法同ABA處理。以茶樹PTB為內(nèi)參基因, qRT-PCR程序及結果分析參照1.5方法。

2　結果與分析

2.1CsINV10的克隆

基于課題組前期對茶樹冷馴化進行的轉錄組測序結果, 從中挑選出與A/N-Inv基因高度同源的6條EST序列, 利用Seqman對這些序列進行拼接獲得一條全長為2101 bp的核酸序列, 利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的ORF Find查找該序列的ORF, 然后進行BlastX比對發(fā)現(xiàn)該序列包含完整的開放閱讀框, 全長為1923 bp, 編碼640個氨基酸。根據(jù)序列拼接和比對結果設計1對RT-PCR引物進行全長驗證, 通過1%瓊脂糖凝膠電泳獲得2.5 kb左右的單一條帶(圖1),將其回收后和pMD18-T連接轉化到大腸桿菌DH5α進行藍白斑篩選, 挑陽性單克隆搖菌送測序, 測序結果和之前的拼接結果基本一致(圖2), 提交GenBank, 登錄號為KT359348。

圖1　茶樹中性/堿性轉化酶基因CsINV10 RT-PCR電泳結果Fig. 1　Electrophoresis result of neutral/alkaline invertase gene CsINV10 in tea plant

2.2序列結構和同源性分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中對CsINV10的氨基酸序列進行Blastx比對, 顯示其與荔枝中已報道的中性/堿性轉化酶LcNI (JQ773414)氨基酸序列相似性最高, 達80%, 與橡膠樹HbNIN3 (AGU19630)、木薯MeNINV8 (AFH77954)相似性分別為78%和76%。用相鄰連接法構建進化樹顯示CsINV10與木薯中性/堿性轉化酶家族中的MeNINV8 (AFH77954)親緣關系最近, 與定位于葉綠體上的擬南芥At-A/N-InvE (At5g22510)、水稻OsNIN3 (AK121301)聚為一類(圖3)。因而, 推測CsINV10蛋白可能也定位于葉綠體, 屬于A/N-Inv α亞家族成員。

結合聚合進化樹分析結果, 從中挑選部分At-A/ N-Inv蛋白氨基酸序列進行同源性比對(圖4)。所有比對序列中間大約450 bp左右的氨基酸序列具有較高的保守性。另外, 在這些保守氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)有38個位點的氨基酸殘基能用于將At-A/N-Inv分成不

同的亞家族, 其中30個氨基酸位點能將At-A/N-Inv分成α和β亞家族(紅色框內(nèi)所示), 4個位點能將定位于線粒體的At-A/N-Inv與葉綠體、細胞質中的At-A/N-Inv區(qū)分開(橙黃色框內(nèi)所示), 3個位點能將定位于葉綠體上的At-A/N-Inv與定位于線粒體、細胞質中的At-A/N-Inv分開(黃色框內(nèi)所示), 還有1個氨基酸位點能分別將定位于葉綠體、線粒體和細胞質的At-A/N-Inv區(qū)分開(綠色框內(nèi)所示)。利用這些特異的氨基酸位點可將不同的At-A/N-Inv定位于不同的亞細胞中, 這種分類結果和利用系統(tǒng)進化樹的分類結果完全一致。

圖2　CsIINV10的編碼序列Fig. 2　Encoding sequence of CsIINV10下畫線部分代表CsINV10的開放閱讀框, 粗體字分別代表起始子和終止子, 陰影部分代表保守結構域。The underlined part represents open reading frame of CsINV10, the shadow represents conserved domains and the bolds represent start codon and terminator respectively.

2.3蛋白序列基本性質分析

2.3.1理化性質分析利用ProtParam預測CsINV10蛋白分子量為71.8 kD, 理論等電點pI為5.69, 總共包括10034個原子, 分子式為C3223H4981N857O944S29。在組成CsINV10蛋白的20種氨基酸中,亮氨酸(Leu)所占比例最高, 達到9.7%, 而組氨酸(His)所占的比例最低, 為1.7%; CsINV10蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為43.81, 脂肪指數(shù)為87.61, 總平均親水性(GRAVY)為–0.166, 根據(jù)Guruprasad法判斷該蛋白不穩(wěn)定。

2.3.2信號肽分析SignalP 4.1 Server預測該蛋白信號肽顯示S平均值(mean S-score)為0.237<0.5,因而預測為不包含信號肽, 屬于非分泌蛋白和非N端糖基化蛋白。

2.3.3疏水性分析利用ProtScale Sever 在線分析軟件中的Hyhob/Kyte & Doolittle 法對該基因的親水性和疏水性預測顯示(圖5), 最大正值為2.467,最小負值為–3.267, 表明該蛋白屬于親水性蛋白。2.3.4跨膜結構預測利用在線軟件TMHMM Server v. 2.0對CsINV10進行跨膜區(qū)分析顯示, 該蛋白不存在跨膜螺旋區(qū), 不屬于跨膜蛋白(圖6), 這和該蛋白的疏水性區(qū)域分析結果(圖5)基本一致。

2.3.5亞細胞定位TargetP1.1在線軟件預測該蛋白的亞細胞定位顯示目的蛋白最可能定位于葉綠體上, 這與系統(tǒng)進化樹預測結果(圖3)一致。

2.3.6卷曲螺旋(Coil區(qū))分析GOR4在線軟件分析CsINV10蛋白的卷曲螺旋結構顯示, CsINV10

蛋白由26.88% α-螺旋、21.56% β-折疊和51.56%無規(guī)則卷曲組成。

2.3.7蛋白磷酸化和糖基化位點預測利用NetPhos 2.0 Server對CsINV10蛋白的磷酸化位點預測顯示, 該蛋白在翻譯后可能存在28個磷酸位點,其中包含14個絲氨酸(Ser)位點、4個蘇氨酸(Thr)位點和9個絡氨酸(Tyr)位點(圖7)。利用YinOYang 1.2 Server進行蛋白糖基化位點預測, 結果顯示該蛋白氨基酸序列中包含11個潛在的O-GlcNAc位點, 包括Ser (2、3、4、24、83、183、295、466、519、634)殘基和一個Thr (182)殘基, 其中絲氨酸(519)可能是YinYang位點(圖8)。

2.4結構域及motif搜索

用SMART對CsINV10蛋白的結構功能預測顯示, CsINV10蛋白氨基酸序列156～599位之間高度保守(圖2), 屬于糖苷水解酶家族100 (G100)成員共有的典型結構域, 可能具有糖肽α-N-乙酰半乳糖胺酶活性。

2.5CsINV10三級結構預測

通過SWISS-MODEL在線軟件對CsINV10三級結構預測后, 利用PhyMol軟件編輯獲得圖9所示結果, CsINV10 (194-552)三級結構主要由14個α螺旋、17個無規(guī)則卷曲和第2和第3個α螺旋之間的2個小的β折疊構成。

圖3　CsINV10與其他物種中的A/N-Inv氨基酸序列聚合進化樹分析結果Fig. 3　Phylogenetic tree of amino acid of CsINV10 and A/N-Inv in other plants參與構建系統(tǒng)進化樹的A/N-Inv分別為: 擬南芥A/N-InvA～I (At1g56560, At4g34860, At3g06500, At1g22650, At5g22510, At1g72000, At1g35580, At3g05820, At4g09510)、水稻OsNIN1～3, 7～8 (AK103334, AK120720, AK121301, AK065562, AK102741)、木薯MeNINV1～10 (JN616390, JQ339931, JQ339932, JQ782220, KF533729, KF533730, JN801148, JQ339933, KF533731, KF533732)、小麥Ta-A/N-INV AM295169)、甜菜BvINV (AJ422050)、胡蘿卜DcINV (Y16262)、百脈根LjInv1 (AJ717412)、毒麥LtINV (AJ003114)、甘蔗SoNIN1 (JX109944)、橡膠樹HbNIN1 (GU573728)和HbNIN2 (GU573727)、茶樹CsINV10 (KT359348)。The Phylogenetic tree grouped by A/N-InvA–I (At1g56560, At4g34860, At3g06500, At1g22650, At5g22510, At1g72000, At1g35580, At3g05820, At4g09510), Arabidopsis thaliana; OsNIN1–3, 7–8 (AK103334, AK120720, AK121301, AK065562, AK102741), Oryza sativa; MeNINV1–10 (JN616390, JQ339931, JQ339932, JQ782220, KF533729, KF533730, JN801148, JQ339933, KF533731, KF533732), Manihotesculentacrantz; Ta-A/N-INV (AM295169), Triticum aestivum; BvINV (AJ422050), Beta vulgaris; DcINV (Y16262), Daucuscarota; LjInv1 (AJ717412), Lotus japonicus; LtINV (AJ003114), Lolium temulentum; SoNIN1 (JX109944), Saccharum officinarum; HbNIN1 and HbNIN2 (GU573728, GU573727), Hevea brasiliensis; CsINV10 (KT359348), Camellia sinensis.

圖4　CsINV10與其他物種中的A/N-Inv氨基酸序列同源比對結果Fig. 4　Homologous analysis of amino acid sequences among different plants參與同源比對的A/N-Inv分別為茶樹CsINV10 (KT359348)、擬南芥A/N-InvA～I (At1g56560, At4g34860, At3g06500, At1g22650, At5g22510, At1g72000, At1g35580, At3g05820, At4g09510)、水稻OsNIN1～3, 7～8 (AK103334, AK120720, AK121301, AK065562, AK102741)、木薯MeNINV1～4, 6～8, 10 (JN616390, JQ339931, JQ339932, JQ782220, KF533730, JN801148, JQ339933, KF533732)。紅色框用于區(qū)分α和β亞族, 黃色框用于區(qū)分葉綠體定位的A/N-Inv, 橙色框用于區(qū)分線粒體定位的A/N-Inv, 綠色框用于區(qū)分細胞質、葉綠體、線粒體定位的A/N-Inv; 紅色箭頭代表可能的催化位點。The homologous sequences include A/N-InvA–I (At1g56560, At4g34860, At3g06500, At1g22650, At5g22510, At1g72000, At1g35580, At3g05820, At4g09510), Arabidopsis thaliana; OsNIN1–3, 7–8 (AK103334, AK120720, AK121301, AK065562, AK102741), Oryza sativa; MeNINV1–4, 6–8, 10 (JN616390, JQ339931, JQ339932, JQ782220, KF533730, JN801148, JQ339933, KF533732), Manihot esculenta Crantz; CsINV10 (KT359348), Camellia sinensis. The red boxes are used to separate α and β subfamily, orange boxes to separate A/N-Invs located in mitochondria, yellow boxes to separate A/N-Invs located in chloroplast, and green box to identify different A/N-Invs located in cytoplasm, chloroplast and mitochondria. The red arrow represents candidate catalytic residues.

圖5　CsINV10親水性/疏水性分析Fig. 5　Hydrophobicity/hydrophilicity analysis of CsINV10

圖6　CsINV10蛋白跨膜結構域預測Fig. 6　Prediction model for transmenbrane domain of CsARF1 protein

圖7　CsINV10磷酸化位點預測Fig. 7　Phosphorylation sites prediction of CsINV10 protein

圖8　CsINV10糖基化位點預測Fig. 8　Glycosylation sites prediction of CsINV10 protein

2.6CsINV10基因的表達模式分析

2.6.1組織表達差異性圖10表明, CsINV10基因在成熟葉片和花中的表達要明顯高于根系中的表達, 莖干中的表達量較成熟葉片和花都要低, 但也比根系中高, 說明該基因在茶樹中具有組織表達特異性。

2.6.2不同非生物脅迫下的表達模式NaCl處理下, 茶樹成熟葉片中CsINV10基因表達量隨著處理時間的延長呈逐漸升高趨勢(圖11), 在處理5 d后,其表達量為未處理前的13倍, 差異達到顯著水平。PEG條件下, 葉片中該基因的表達量在處理后3 h達到最大值, 是處理前的5.3倍, 隨后又逐漸降低并在處理后1 d達到最小值, 而后隨著處理時間的延長, 表達又逐漸升高, 在處理5 d后其表達量又基本恢復到處理3 h的水平。ABA處理下, 該基因表達量在處理后3 h達到最大值, 隨后隨著處理時間的延長呈現(xiàn)逐步降低的趨勢。低溫條件下, CsINV10基因在茶樹成熟葉中的表達隨著處理時間的延長呈現(xiàn)

先下調后上調的趨勢, 在處理3 h后表達量達最小值, 隨后逐漸升高, 在處理4 d后為處理前的5.7倍。表明CsINV10基因的表達受多種逆境脅迫誘導, 同時ABA能夠瞬時誘導該基因的表達, 而低溫、PEG和鹽分處理下該基因表達量在處理1 d后較對照都要高, 說明該基因可能作為一個長效表達基因參與響應茶樹的逆境脅迫。

圖9　CsINV10蛋白三維結構預測Fig. 9　Three-dimension structure of CsINV10 protein

圖10　同一品種不同組織器官中CsINV10的表達分析Fig. 10　Expression analysis of CsINV10 in different organs of a tea plant柱上小寫字母不同表示差異達到顯著水平(P < 0.05)。The columns with different small letters are significantly different (P < 0.05).

3　討論

圖11　CsINV10在不同非生物脅迫下的表達分析Fig. 11　Expression analysis of CsINV10 in various abiotic stresses柱上小寫字母不同表示差異達到顯著水平(P < 0.05)。The columns with different small letters are significantly different (P < 0.05).

在氨基酸序列中, CWIN和VIN在接近成熟蛋白N端處都有一個β-呋喃果聚糖苷酶基序(NDPD/ NG)[1], 而在接近C端則有一段保守的(WECV/PD),該序列被認為是酸性轉化酶蛋白家族中保守結構域和催化活性所必須的序列[47], 而A/N-Inv缺乏N端信號肽, 既不是糖基化蛋白, 也不是β-呋喃果糖苷酶, 具體催化位點依然未知。酸性轉化酶能夠水解包含有β-呋喃果糖苷基的低聚糖糖如蔗糖、棉子糖和水蘇糖等, 而A/N-Inv只能特異水解蔗糖。本研究從茶樹成熟葉片中克隆的轉化酶基因, 通過與其他物種中已報道的A/N-Inv進行氨基酸比對顯示, 這類轉化酶氨基酸序列中間的450多個氨基酸具有較高的保守性, 而N端和C端的同源性非常低, 在這段保守結構域中存在多個能將不同亞細胞定位的A/N-Inv區(qū)分開的氨基酸殘基位點, 同時還包含Ji 等[19]報道的12個保守結構域和兩個潛在的催化殘基Asp88和Asp149 (圖4紅色箭頭所示)。此外, CsINV10的氨基酸序列與茶樹中已報道的酸性轉化酶氨基酸序列基本沒有同源性, 而與另外幾個預測為A/N-Inv基因的序列具有較高同源性, CsINV10氨基酸序列不包含酸性轉化酶的特征五肽(NDPNG)和(WECV/PD), N端不含跨膜結構域和信號肽, 且具有較高的親水性。CsINV10蛋白氨基酸序列性質和胡蘿卜[4]、小麥[10]、甘蔗[24]等的A/N-Inv蛋白性質

相似, 說明我們所克隆獲得的CsINV10也屬于A/N-Inv基因。根據(jù)進化樹分析顯示, CsINV10與水稻OsNIN3和擬南芥A/N-InvE聚為一大類, 而OsNIN3和A/N-InvE均已報道定位于葉綠體, 因而推測CsINV10也可能定位于葉綠體, 這與TargetP1.1預測結果一致。然而, 本研究所報道的CsINV10在酶學水平上, 具體屬于中性還是堿性轉化酶, 最佳pH值為多少; 它的底物特異性如何, 米氏常數(shù)(Km)值為多少, 催化位點在哪等眾多問題還需要我們后期更深入的研究后才能確定。

目前, 很多研究認為A/N-Inv在調控植物根系生長和生殖發(fā)育方面具有重要作用。Qi等[28]對擬南芥Atcyt-inv1突變體研究發(fā)現(xiàn), Atcyt-inv1能夠通過控制細胞內(nèi)己糖濃度來抑制側根發(fā)育, 擬南芥中另外2個A/N-Inv基因AtCIN7和AtCIN9 (cINV1/cINV2)雙突變的突變體中A/N-Inv活性較對照降低了40%,抑制了根系生長, 同時還伴隨著細胞的畸形擴增[48]。相似地, 百脈根中的LjCIN1 (LjINV1)突變后降低了根系和莖干的生長、阻遏花粉形成和損害開花[23],水稻中OsCIN8 (OsCyt-INV1)的突變造成突變體植株根系變短, 推遲開花和部分不育[32]。植物中組織器官的生長不僅需要己糖作為能量和碳的來源, 還需要一個細胞伸長的驅動力, 即相對穩(wěn)定的細胞滲透壓和一個細胞壁伸展性的增加[1]。在上述突變體中根系縮短可能是由于轉化酶活性的降低導致己糖含量匱乏使得細胞壁元件合成減少和細胞延長所需的驅動力降低, 最終降低細胞長度。碳水化合物在花藥和花粉發(fā)育中具有重要作用, 對馬鈴薯[49]和煙草[50]花藥組織中的胞外轉化酶研究發(fā)現(xiàn)蔗糖的胞外水解和花藥、花粉之間存在緊密的聯(lián)系, A/N-Inv活性的變化會影響花粉的育性。本研究通過對茶樹不同組織中CsINV10的表達進行qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)在茶樹成熟葉和花中其表達量最高, 莖干中的表達量則低于二者, 這可能與CsINV10蛋白亞細胞定位于葉綠體有關。茶樹作為常綠植物, 葉片中較高的A/N-Inv活性能夠充分水解光合產(chǎn)物——蔗糖產(chǎn)生大量葡萄糖和果糖參與到茶樹生長發(fā)育和對逆境脅迫的響應過程, 而葉片中的葉綠體作為植物參與光合作用的主要細胞器, 其內(nèi)部可能存在較高的A/N-Inv活性以參與蔗糖水解過程。莖干作為蔗糖運輸通道, 較低的A/N-Inv活性可能更利于蔗糖通過產(chǎn)生濃度梯度從源器官向庫器官中運輸。而花作為快速生長分化組織, 較高的A/N-Inv活性能夠促進蔗糖的水解合成己糖, 為開花過程提供必要的碳水化合物來源?；贑sINV10基因在茶樹成熟葉和花中較高的表達量, 推測該基因可能主要在參與響應茶樹體內(nèi)蔗糖從“源器官”到“庫器官”的分配、生長發(fā)育、開花結果等方面具有重要作用, 但關于A/N-Inv基因是如何介導響應植物生長發(fā)育過程, 比如是通過糖信號途徑還是通過不同信號途徑(如赤霉素、細胞分裂素和磷脂酰肌醇等)之間互作等眾多問題都還有待更深入的研究。另外, 本研究發(fā)現(xiàn)CsINV10基因在茶樹根系中的表達量較其他組織都低, 推測該基因在響應茶樹根系生長方面的作用可能并不明顯, 原因可能也和CsINV10的亞細胞定位有關, 該蛋白的亞細胞定位與上述報道的AtCIN7、AtCIN9、LjCIN1、OsCIN8不同, 后四者都被報道定位于細胞質中, 屬于β亞家族, 同時四者相互之間具有較高的同源性。因此, 我們推測在茶樹中可能還存在能特異調控茶樹根系生長發(fā)育的轉化酶基因, 但這還需我們后續(xù)深入研究。

最近有研究表明植物體內(nèi)的A/N-Inv基因被敲除后, 突變體植株中由于A/N-Inv活性的降低或缺失對植株造成了葉片、莖干、根系生長不良和花期推遲等不良影響, 說明A/N-Inv是植物生長和發(fā)育不可或缺的部分[29]。此外, 植物A/N-Inv在脅迫條件下還伴隨著酶活性的升高[32,48], 其可能通過調控細胞質或細胞器中蔗糖濃度, 或是通過調控能被線粒體中相關己糖激酶響應或作為己糖激酶底物的葡萄糖濃度來調節(jié)線粒體活性氧的平衡。Xiang等[29]分別敲除擬南芥中定位于細胞質的At-A/N-InvG和線粒體中的At-A/N-InvA基因后發(fā)現(xiàn), 缺失突變體的生長明顯受到抑制, 兩種突變體中的A/N-Inv活性都降低了30%以上; 另外, 他們對野生型擬南芥進行過氧化氫處理后發(fā)現(xiàn), At-A/N-Inv基因和HXK1在野生型中的表達量都明顯增加, 因而推測At-A/N-Inv可能作為抗氧化系統(tǒng)的成員參與調控胞內(nèi)活性氧的平衡。Vargas 等[10]對小麥一個堿性轉化酶在不同環(huán)境脅迫中活性變化情況的研究表明, 在低溫和甘露醇處理小麥72 h中, 小麥體內(nèi)A/N-Inv活性隨著處理時間的延長呈逐漸升高的趨勢, 在處理24 h后達到最高, 隨后緩慢降到一定程度后便維持在一個相對穩(wěn)定水平, 同時, 一個堿性轉化酶基因Ta-A-Inv在低溫和甘露醇處理72 h后表達量較對照要高, 推測小麥幼苗葉片中A/N-Inv水解蔗糖可能作為植物常規(guī)代謝機制的開端, 通過提供較高的能量和生物合成化合物來抵

御逆境脅迫。本研究發(fā)現(xiàn), 在4℃低溫條件下, 茶樹成熟葉片中CsINV10基因的表達呈先降后升趨勢, ABA和PEG處理下則呈現(xiàn)瞬時增加后急劇降低趨勢,但與ABA不同的是, PEG處理下該基因的表達量在降到一定程度后又隨著處理時間的延長逐漸升高。而在NaCl處理條件下, 該基因隨著處理時間的延長逐漸上調表達, 在處理5 d后, 表達量較處理前提高了13倍, 呈極顯著水平。總體而言, 無論是低溫、鹽分還是PEG脅迫處理茶樹1 d后, CsINV10的表達量都較對照要高, 并隨處理時間延長逐漸升高, 說明該基因能夠響應茶樹非生物逆境脅迫, 其在參與茶樹抵御環(huán)境脅迫方面可能具有重要作用。然而, 王菲[51]報道的一個枳葉片中的中性轉化酶基因PtrNINV在低溫、干旱、鹽脅迫下的表達模式卻與CsINV10基因在相同逆境脅迫下的表達相反, 這些A/N-Inv基因在不同物種中表達模式的差異可能受物種間差異限制, 同時也可能與它們的亞細胞定位或最佳酶活pH不同有關。PtrNINV被報道定位于細胞質中的線粒體上, 屬于中性轉化酶基因[51], 而我們所克隆的CsINV10根據(jù)亞細胞定位預測顯示定位于葉綠體上。由于時間和空間的差異使得不同亞細胞定位的A/N-Inv基因對逆境脅迫的響應可能有不同的時空表達模式。

本研究明確了該類酶編碼基因在茶樹響應逆境脅迫中的表達模式, 但關于它們在茶樹抗逆中的作用機制仍有待進一步深入研究。例如: (i)茶樹逆境脅迫下A/N-Inv活性變化與A/N-Inv基因表達之間的對應關系如何; (ii)脅迫條件下, A/N-Inv與激素之間是否具有對應關系, 又是通過什么信號途徑參與調控茶樹體內(nèi)活性氧的平衡; (iii)不同細胞器中A/N-Inv和AI基因之間在茶樹逆境下是如何協(xié)同表達; (iv)逆境下, A/N-Inv基因表達的高低是否由相關轉錄因子來調控。同時, A/N-Inv活性變化除被相應A/N-Inv基因調控外, 其他影響因素又是什么等問題,有待在以后的研究中逐一揭開。

4　結論

克隆獲得一個全長ORF為1923 bp, 編碼640個氨基酸的A/N-Inv基因CsINV10, 該基因編碼的蛋白氨基酸序列無N-端信號肽, 無跨膜結構域, 屬于親水性蛋白并定位于葉綠體。茶樹中CsINV10的表達具有組織表達差異性, 該基因的表達受多種逆境脅迫誘導, 表明它與茶樹抗逆響應密切相關。

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URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151218.0915.008.html

Cloning and Expression Analysis of a Neutral/alkaline Invertase Gene (CsINV10) in Tea Plant (Camellia sinensis L. O. Kuntze)

QIAN Wen-Jun1,2, YUE Chuan2, CAO Hong-Li2, HAO Xin-Yuan2, WANG Lu2, WANG Yu-Chun1,2, HUANG Yu-Ting2, WANG Bo2, WANG Xin-Chao2, XIAO Bin1,*, and YANG Ya-Jun1,2,*1College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2Tea Research Institute of Chinese Academy, Agricultural Sciences / National Center for Tea Improvement / Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

Abstract:Based on the comprehensive RNA-Seq analysis of tea plant during cold acclimation stage, we picked out six ESTs sequences with a high similarity to neutral/alkaline invertase gene to get a splicing. As a result, a full-length of 2101 bp nucleotide sequence was obtained from tea plant after validated by using RT-PCR technique. Bioinformatics analysis showed that the sequence containing 1923 bp ORF (Open Reading Fram) and encoding 640 amino acid residues with a putative molecular mass of 71.8 kD and theoretical isoelectric point of 5.69, was named as CsINV10 (GenBank accession number: KT359348). BlastX and phylogenetic analysis indicated that the protein encoded by CsINV10 shared the highest identity (80%) with LcNI in Litchi, and had a closest genetic relationship with MeNINV8 in Manihot esculenta Crantz. Also, CsINV10 as a neutral/alkaline invertase gene could be classified into G100 family. The protein had no N-terminal signal peptide and transmembrane domain, and was predi-

cated to be a hydrophilic protein localized in chloroplast. The expression analysis of CsINV10 under different abiotic stress conditions showed that cold, PEG and salt stresses could gradually promote the expression of CsINV10 when treated for one day, however, it had a transient increase when treated by ABA for three hours. Consequently, we speculated that CsINV10 might be involved in the tea plant response to abiotic stresses. Moreover, we found that CsINV10 had a tissue-specific expression pattern in leaf and flower. These results provide a theoretical basis for the functional analysis of invertase genes of tea plant in response to various stresses.

Keywords:Tea plant (Camellia sinensis); Neutral/alkaline invertase gene; Expression analysis

收稿日期Received(): 2015-08-12; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(網(wǎng)絡出版日期): 2015-12-18.

通訊作者*(Corresponding authors): 楊亞軍, E-mail: yjyang@mail.tricaas.com, Tel: 0571-86653162; 肖斌, E-mail: xiaobin2093@sohu.com

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00376