山豆根毛狀根培養(yǎng)體系的建立與優(yōu)化

李林軒， 韋坤華， 姚紹嫦， 唐美瓊， 韋 范， 繆劍華

山豆根毛狀根培養(yǎng)體系的建立與優(yōu)化

李林軒， 韋坤華， 姚紹嫦， 唐美瓊， 韋 范， 繆劍華*

(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園， 廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點實驗室， 廣西 南寧 530023)

為探索定向培養(yǎng)山豆根植物細(xì)胞及器官獲取有效藥用成分的新途徑，為山豆根有效藥用成分的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，采用共培養(yǎng)法研究發(fā)根農(nóng)桿菌R1601感染誘導(dǎo)山豆根無菌苗子葉產(chǎn)生毛狀根，并在此基礎(chǔ)上從不同培養(yǎng)液、不同蔗糖濃度和外源激素對毛狀根生長的影響方面篩選山豆根毛狀根生長的最佳培養(yǎng)液。結(jié)果表明：利用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601感染山豆根無菌苗子葉16 min，在MS+AS 100 μmol/L的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)可誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根，且誘導(dǎo)率最高，達(dá)66.67%；1/2 MS+IAA 0.5 mg/L+5%蔗糖的培養(yǎng)液最有利于山豆根毛狀根的生長。

山豆根； 毛狀根； 農(nóng)桿菌； 培養(yǎng)液； 藥用植物

隨著野生藥用植物資源的日益匱乏，采用生物技術(shù)定向培養(yǎng)植物細(xì)胞及器官獲取有效藥用成分顯得越來越重要。毛狀根培養(yǎng)在生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢和前景。研究發(fā)現(xiàn)，滇黃芩毛狀根的黃芩苷含量是原藥材的7.18倍[1]，人參毛狀根的總皂苷含量是原藥材的1.7倍[2]。同時，毛狀根培養(yǎng)與其他植物細(xì)胞培養(yǎng)相比，具有生長速度快、不需要添加激素等優(yōu)點；與原植物根部次生代謝產(chǎn)物含量常常受根部細(xì)胞分化的影響相比，毛狀根具有持續(xù)穩(wěn)定的生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的能力[3-5]。

山豆根(SophoratonkinensisGapnep.)又稱廣豆根，是著名的廣西道地藥材，屬豆科植物，是臨床常用中藥，藥用部位是根，為《中華人民共和國藥典》所收載[6]?，F(xiàn)代研究證明，從山豆根中分離出多種生物堿，其中，苦參堿(Matrime)和氧化苦參堿(Oxymatrime)等具有抗癌和抗霉菌的作用[7]。由于廣西石山區(qū)的天然植被大量被砍伐，山豆根失去生存條件，加上該植物分布局限性大且零星，長期無計劃的亂采亂伐已導(dǎo)致野生資源及生態(tài)環(huán)境受到嚴(yán)重破壞。目前，廣西境內(nèi)的山豆根已面臨枯竭，且其人工栽培生長周期長、成本高，短期內(nèi)難以滿足市場需求。因此，如何利用高新技術(shù)實現(xiàn)山豆根資源的可持續(xù)發(fā)展已迫在眉睫。但關(guān)于山豆根的發(fā)根研究在國內(nèi)還未見報道。為此，筆者針對山豆根開發(fā)后出現(xiàn)的資源可持續(xù)發(fā)展問題，利用現(xiàn)代生物技術(shù)通過發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)山豆根發(fā)根從而建立山豆根毛狀根培養(yǎng)體系，以期直接生產(chǎn)山豆根次生代謝產(chǎn)物，實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)山豆根藥用成分，為中藥山豆根資源的開發(fā)探索新途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)菌株R1601為廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點本實驗室保存。保存條件為超低溫冰箱，于-70℃下保存。

山豆根種子來自廣西藥用植物園繁育圃，山豆根無菌苗為廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點實驗室提供。

試劑：植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，苦參堿對照品和氧化苦參堿對照品(天津馬克生物科技有限公司)，乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)，其余試劑為國產(chǎn)分析純，高純水為實驗室自制。

培養(yǎng)基：YEB固體培養(yǎng)、YEB液體培養(yǎng)基、MS液體培養(yǎng)基、B5液體培養(yǎng)基和WPM液體培養(yǎng)基。

主要儀器設(shè)備：4K-15高速冷凍離心機(jī)(sigma)，sub-cellGT水平電泳儀(BIORAD)，ChemiDos XRS凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD)，T-Gradient梯度PCR儀(Biometra)，高效液相色譜儀(Agilent 1 260 Infinity LC)，色譜柱(Phenomenex Luna 5 u NH2 100 A，150×4.6 mm)，ZHWY-211B全溫?fù)u床(常州銳品精密儀器有限公司)

1.2 發(fā)根農(nóng)桿菌的培養(yǎng)

感染外植體前，首先需要對菌株進(jìn)行活化。在YEB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，待菌落長出后，挑取單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基，于28℃、220 r/min搖床上培養(yǎng)(圖1)，30 d后供感染體用。

圖1 發(fā)根農(nóng)桿菌的活化

1.3 R1601發(fā)根農(nóng)桿菌對山豆根毛狀根的誘導(dǎo)

將山豆根的無菌苗子葉放入R1601菌液中浸泡16 min取出，以無菌水為對照，然后用無菌濾紙吸取外植體表面多余的菌液，轉(zhuǎn)移至含有乙酰丁香酮(AS)100 μmol/L的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，處理30瓶，每瓶1個無菌子葉。當(dāng)誘導(dǎo)出的根長至約2 cm時，在無菌條件下將其剪下，于含有頭孢噻肟鈉(Cef) 300 mL/L的MS固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行除菌培養(yǎng)，每5 d轉(zhuǎn)接1次，直至無菌。

1.4 山豆根毛狀根的鑒定

為確定山豆根毛狀根的轉(zhuǎn)化成功，取編號為12、22、23、26、27、33、43、46的山豆根毛狀根材料各100 mg，按照CTAB法提取毛狀根中的DNA制成檢測樣品，同時提取Ri質(zhì)粒的DNA。根據(jù)rolB和rolC基因的序列設(shè)計引物，將各種DNA于下述PCR反應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳(140 V電壓，30 min)后，在UVP成像系統(tǒng)上觀察DNA條帶并拍照。

PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min，94℃ 50 s，56℃45 s，72℃ 1 min 34個循環(huán)，72 ℃10 min，4℃保溫20 min。電泳條件：1.2%的瓊脂糖凝膠作為電泳支持物，緩沖液，Marker DNA為pUC 19DNA/ Msp I (Hpa II )，EB染色，0.5 XTBE緩沖液作為電泳，140 V，30 min。

1.5 山豆根毛狀根生長曲線的繪制

山豆根毛狀根接種到1/2 MS+IBA 0.2 mg/L+0.05%活性炭的固體培養(yǎng)基，每瓶接種約0.3 g鮮重，每個處理3瓶，每隔5 d測1次生長量，并根據(jù)生長量繪制山豆根毛狀根生長曲線，確定最佳的生長觀察期。

1.6 山豆根毛狀根培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.6.1 不同培養(yǎng)基對山豆根毛狀根生長的影響 將山豆根毛狀根接種到MS、1/2 MS、1/4 MS、B5和WPM等5種不同的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中B5和WPM屬于低鹽濃度培養(yǎng)基，1/2 MS和1/4 MS的大量元素分別為MS培養(yǎng)基的1/2與1/4，其余與MS相同，MS屬于高鹽濃度培養(yǎng)基。30 d后測定其鮮重并觀察毛狀根的生長情況。

1.6.2 不同蔗糖濃度對山豆根毛狀根生長的影響 取毛狀根接種到分別添加有1%、3%、5%、7%和9%蔗糖的培養(yǎng)液(1/2 MS)中，30 d后測定其鮮重。

1.6.3 不同外源激素處理對山豆根毛狀根生長的影響 將大約0.3 g(鮮重)毛狀根接入添加不同濃度的IAA、NAA、6-BA(表1)的1/2 MS培養(yǎng)液中，30 d后測定其鮮重并觀察毛狀根的生長情況。

表1 山豆根毛狀根培養(yǎng)激素的水平設(shè)計

Table 1 Design of the culture hormone levels of S.tonkinensis hairy rootmg/L

1.7 山豆根毛狀根的藥效分析

采用苦參堿對照品和氧化苦參堿對照品作為試驗對照，參照《中華人民共和國藥典》(2015版)進(jìn)行測定。(儀器：Agilent 1 260 Infinity LC；色譜柱：Phenomenex Luna 5 u NH2 100 A，150×4.6 mm；柱溫：25 ℃；流動相：乙腈：異丙醇：3%磷酸(80∶5∶15)；流速：0.5 mL/min；檢測波長：210 nm)選取培養(yǎng)30 d的山豆根毛狀根，按照藥典含量山豆根測定的方法制備供試液；另取苦參堿對照品和氧化苦參堿對照品，加流動相分別配制成0.020 mg/mL的苦參堿溶液和0.150 mg/mL的氧化苦參堿溶液，分別精密吸取對照品溶液與供試液注入液相色譜儀進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 R1601發(fā)根農(nóng)桿菌處理山豆根毛狀根的誘導(dǎo)率

從圖2可見，培養(yǎng)10 d后，有的子葉傷口部位開始長出少量的愈傷組織，15 d后開始陸續(xù)在傷口部位長出白色的毛狀根，長出的毛狀根不具向地生長，少纖毛，2周后長至4～5 cm。具有高濃度抗生素的培養(yǎng)基不適合毛狀根的生長，毛狀根的根尖開始褐化且停止生長；隨著培養(yǎng)時間的延長，受體子葉開始褐化而逐漸失去發(fā)根能力。侵染30 d后從傷口處長出毛狀根，毛狀根較粗壯、生長迅速。統(tǒng)計結(jié)果，R1601發(fā)根農(nóng)桿菌對山豆根毛狀根的誘導(dǎo)率為66.67%。

圖2 R1601發(fā)根農(nóng)桿菌處理山豆根子葉誘導(dǎo)的毛狀根

Fig.2S.tonkinensishairy root cotyledons infected byA.rhizogenesR1601

2.2 山豆根毛狀根的鑒定

從圖3可見，除了26號外，其他編號的毛狀根通過PCR均成功地擴(kuò)增出rolB和rolC基因。說明，由R1601誘導(dǎo)出的毛狀根已整合Ri質(zhì)粒的T-DNA片段，成功實現(xiàn)山豆根毛狀根的轉(zhuǎn)化，而未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的無菌苗的根沒有擴(kuò)增條帶。

2.3 山豆根毛狀根的生長曲線

由圖4可見，毛狀根接種后10 d內(nèi)生長緩慢，可能是因為毛狀根剛接種到新鮮培養(yǎng)基后有個適應(yīng)期；在第10～30天時毛狀根迅速生長，處于對數(shù)生長期；30 d后毛狀根逐漸成熟，30～40 d生長速度減漫，40 d左右毛狀根開始老化變黃。據(jù)此，將山豆根毛狀根生長的觀察期定為30 d較合適。

2.4 山豆根毛狀根培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 不同培養(yǎng)基處理山豆根毛狀根的生長 一般情況下，毛狀根在低鹽培養(yǎng)基中生長良好，可能是因為NH4+、NO3-、PO43-、Ca2+等大量元素的減少有利于其生長。由表2和圖5可見，不同培養(yǎng)基中山豆根毛狀根的生長情況差異較大，5種培養(yǎng)基對毛狀根生長都具有顯著影響，表現(xiàn)為1/2 MS>WPM>B5>1/4 MS>MS。其中，1/2 MS培養(yǎng)基最有利于山豆根毛狀根的生長，其鮮重增加倍數(shù)最多，約增加8.56倍，且毛狀根生長迅速，無愈傷化現(xiàn)象；其次是WPM培養(yǎng)基，其毛狀根鮮重約增加7.17倍，略低于1/2 MS處理，且毛狀根生長較迅速，無愈傷化現(xiàn)象；MS培養(yǎng)基中的毛狀根出現(xiàn)愈傷化，生長慢，估計與培養(yǎng)基中含有較高的銨鹽有關(guān)。B5培養(yǎng)基也引起毛狀根愈傷化，根較粗；1/4 MS培養(yǎng)基雖然銨鹽濃度較低，但其他成分也較1/2 MS培養(yǎng)基少，估計養(yǎng)分不足而引起生長慢。因此，最適合毛狀根生長的液體培養(yǎng)基是1/2 MS培養(yǎng)基，其次是WPM培養(yǎng)基。說明，山豆根毛狀根適合在較低鹽濃度的培養(yǎng)基生長。

注：M-Marker，12、22、23、26、27、33、43和46均為毛狀根編號，C(+)為發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒，C(-)為組培苗的根。

Note: M-Marker，12,22,23,26,27,33,43 and 46 are the number ofS.tonkinensishairy root, C(+) isS.tonkinensishairy root cotyledons infected byA.rhizogenes, C(-)is the tissue culture seedling ofS.tonkinensishairy root

圖3 山豆根毛狀根的DNA 圖(rolB基因，上；rolC基因，下)

Fig.3 The DNA electrophoresis spectrum ofS.tonkinensishairy root (rolb gene,upper and rolC gene,lower)

圖4 山豆根毛狀根的生長曲線與生長情況

表2 不同培養(yǎng)基處理山豆根毛狀根的生長情況

圖5 不同培養(yǎng)基處理山豆根毛狀根的生長(30 d)

Fig.5 Growth ofS.tonkinensishairy root(30 d)on different culture mediums

2.4.2 不同蔗糖濃度處理山豆根毛狀根的生長量 從表3和圖6可見，蔗糖濃度在1%～5%，隨著濃度的升高山豆根毛狀根的生長量呈升高趨勢；當(dāng)蔗糖濃度提高至5%時，最有利于山豆根毛狀根生長量的積累，30 d后鮮重為3.387 g，增幅為10.105%；當(dāng)濃度高于5%時，毛狀根生長量反而呈下降趨勢，蔗糖濃度為7%時，培養(yǎng)30 d，鮮重只有2.545 g。因此，5%蔗糖濃度最適合山豆根毛狀根的培養(yǎng)。

表3 不同蔗糖濃度處理山豆根毛狀根的生長量

Table 3 Growth ofS.tonkinensishairy root treated with different concentrations of sucrose

蔗糖濃度/%Sucroseconcentration接種量/gInoculumsize培養(yǎng)30d后30daysafterculture鮮重/g增幅/%10．2871．9355．74230．2912．7248．36150．3053．38710．10570．3012．5457．45590．2942．3857．112

2.4.3 不同外源激素處理山豆根毛狀根的生長量 由表4可見，將約0.3 g(鮮重)的毛狀根接種到不同外源激素處理的培養(yǎng)液上培養(yǎng)30 d后，培養(yǎng)液組合5的山豆根毛狀根鮮重增加倍數(shù)最高，達(dá)17.3倍。從表5可見，IAA對山豆根毛狀根的生長具有極顯著影響(F=24.35，p<0.01)，IAA的鮮重增加11.7～16.13倍。其中， IAA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時，鮮重增加最多，增加16.13倍；當(dāng)質(zhì)量濃度超過0.5 mg/L時，IAA對山豆根毛狀根生長有抑制作用，鮮重增加開始降低。生長素NAA對毛狀根的生長影響不顯著(p>0.05)，但高濃度NAA會使毛狀根愈傷化，嚴(yán)重影響毛狀根質(zhì)量。而6-BA的極差0.4比空白因子的極差1.03小。說明，6-BA的效應(yīng)是不可靠的。因此，根據(jù)試驗結(jié)果可以認(rèn)為，山豆根毛狀根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)液為1/2 MS+0.5 mg/L IAA，在此培養(yǎng)液上形成毛狀根的頻率較高，質(zhì)量較好。

圖6 不同蔗糖濃度處理山豆根毛狀根的生長量

Fig.6 Growth ofS.tonkinensishairy root treated with different concentrations of sucrose

表4 不同外源激素處理對山豆根毛狀根的鮮重增加量

表5 不同外源激素處理山豆根毛狀根生長的均值與極差

Table 5 Mean and range of the growth ofS.tonkinensishairy root treated with different exogenous hormones

因素Factor均值 MeanK1K2K3極差RA(IAA)/(mg/L)11．7316．1311．704．43B(NAA)/(mg/L)13．2013．7312．631．10C(6?BA)/(mg/L)13．3312．9313．300．40空白Blank13．7012．6713．201．03

圖7 山豆根毛狀根的高效液相色譜

2.5 山豆根毛狀根的藥效

從圖7可見，各樣品都具有苦參堿與氧化苦參堿，其中，苦參堿含量為0.004 2%，氧化苦參堿含量為0.680 9%，其總量為0.685 1%，未能達(dá)到藥典規(guī)定的0.7%標(biāo)準(zhǔn)，還需進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論與討論

基本培養(yǎng)基提供植物生長所需的各種營養(yǎng)成分，包括大量元素、微量元素和維生素等[8]。試驗結(jié)果可知，基本培養(yǎng)基選擇對山豆根毛狀根生長起到關(guān)鍵作用。B5和WPM屬于低鹽濃度培養(yǎng)基，MS屬于高鹽濃度培養(yǎng)基，1/2 MS和1/4 MS的大量元素分別為MS培養(yǎng)基的1/2與1/4，其余與MS相同，毛狀根一般在低鹽培養(yǎng)基中生長良好，B5培養(yǎng)基引起毛狀根愈傷化，WPM培養(yǎng)基培養(yǎng)的效果略低于1/2 MS，1/4 MS養(yǎng)分又比1/2 MS低。因此，選用1/2 MS作為山豆根毛狀根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。

生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中不可缺少的，雖然用量極少，但對植物的生長起到重要的作用[9]。雖然毛狀根不需要外源激素就能快速生長，但該研究發(fā)現(xiàn)，山豆根毛狀根在添加0.5 mg/L IAA的1/2 MS培養(yǎng)液上的生長遠(yuǎn)高于不添加任何激素的1/2 MS培養(yǎng)液。這與周倩耘等[10-11]添加適當(dāng)生長素可以促進(jìn)毛狀根生長的研究結(jié)果相符。

該試驗使用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601侵染山豆根無菌苗子葉獲得可以穩(wěn)定繼代的山豆根毛狀根株系。通過對毛狀根生長的培養(yǎng)液、蔗糖濃度和外源激素進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，1/2 MS+IAA 0.5 mg/L+5%蔗糖的培養(yǎng)液最有利于山豆根毛狀根的生長；但通過對山豆根毛狀根有效成分的分析發(fā)現(xiàn)，其有效成分含量較低，還需進(jìn)行深入研究與開發(fā)。

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(責(zé)任編輯： 王 海)

Establishment and Optimization ofSophoratonkinensisHairy Root Culture

LI Linxuan, WEI Kunhua, YAO Shaochang, TANG Meiqiong, WEI Fan, MIAO Jianhua*

(GuangxiBotanicalGardenofMedicinalPant，GuangxiKeyLaboratoryofMedicinalResourcesProtectionandGeneticImprovement,Nanning,Guangxi530023,China)

To find a new way to explore the orientation culture ofS.tonkinensisplant cells and organs acquiring validly medicinal ingredient and lay the foundation for large-scale production of effective medicinal ingredients. Using co-culture observing the aseptic seedling infected byAgrobacteriumrhizogenesR1601 impact ofS.tonkinensishairy root induction rate and select the best culture medium, according to the different culture medium, different concentrations of sucrose and exogenous hormones on hairy root growth. Results: The highest induction rate(66.67%)was the aseptic seedling infected byA.rhizogenesR1601 for 16 min in the MS + AS 100 μmol / L of solid medium, and the most conducive to the growth of the hairy root ofS.tonkinensisis in 1/2 MS + IAA 0.5 mg/L+ 5% sucrose culture medium.

Sophoratonkinensis; hairy root;Agrobacteriumrhizogenes; culture medium; medicinal plant

2015-04-06； 2015-07-30修回

廣西自然科學(xué)基金“山豆根高產(chǎn)毛狀根系培養(yǎng)體系及次生代謝產(chǎn)物生物合成機(jī)理研究”(2011GXNSFD018037)，“廣豆根多倍體誘導(dǎo)及其生物堿類成分的含量變化規(guī)律研究”(2013GXNSFBA019086)；公益行業(yè)專項“中藥飲片質(zhì)量保障體系研究(一)”(201507002)；國家科技重大專項“中藥材種子種苗和種植(養(yǎng)殖)標(biāo)準(zhǔn)平臺”(2012ZX09304006)；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項“根瘤菌對山豆根生長及有效成分的影響研究”(GZPT13-38)，“廣豆根組培苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究”(GZBZ14-14)

李林軒(1986-)，男，助理研究員，從事中藥資源保護(hù)與開發(fā)利用研究。E-mail: starry1125@sina.com

*通訊作者：繆劍華(1962-)，男，研究員，博士，從事藥用植物資源保護(hù)與開發(fā)利用究。E-mail：mjh1962@vip.163.com

1001-3601(2016)01-0009-0027-05

S482.3+9

A