豬偽狂犬病基因缺失滅活疫苗（JS-2012-△gI/gE株）的制備及免疫效力評價

童 武，李國新，鄭 浩，劉 飛，梁 超，李 林，田 青，曹艷云，武吉強，王 濤，鄭旭晨，單同領，童光志

（1. 中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

·研究論文·

豬偽狂犬病基因缺失滅活疫苗（JS-2012-△gI/gE株）的制備及免疫效力評價

童 武1,2，李國新1,2，鄭 浩1,2，劉 飛1，梁 超1，李 林1，田 青1，曹艷云1，武吉強1，王 濤1，鄭旭晨1，單同領1,2，童光志1,2

（1. 中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

本研究將豬偽狂犬病毒雙基因缺失毒株（JS-2012-△gI/gE株）用0.15%的甲醛滅活后，與賽彼科公司 MONTANIDE ISA 201VG 佐劑進行乳化，制備成豬偽狂犬病滅活疫苗。為了評價滅活疫苗的免疫效力，15頭14日齡的健康仔豬（豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型抗原和抗體均為陰性）隨機分成3組，每組5頭。第一組豬頸部肌肉接種豬偽狂犬病滅活疫苗 （JS-2012-△gI/gE株）每頭2 mL，接種后28 d，第一組和第二組同樣方式同等劑量接種豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-△gI/gE株），第三組豬作為對照。第二次免疫后d 28，三組實驗豬均滴鼻接種PRV JS-2012第5代強毒，每頭105.0TCID50/2 mL。攻毒后0～14 d，每日測量體溫并記錄臨床癥狀。通過抗體檢測和保護效率來評價豬偽狂犬病滅活疫苗 （JS-2012-△gI/gE株）免疫效力。結果表明，兩次免疫（第一組）PRV gB 抗體水平明顯高于一次免疫（第二組），兩次免疫提供了更好的保護效力。

偽狂犬病毒；滅活疫苗；制備；效力評價

豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的高死亡率的急性傳染病，該病以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎為主要特征[1]。PRV屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科、水痘病毒屬，其基因組為線狀雙鏈DNA，長約150 kb，由長獨特區(qū)（unique long region，UL）、短獨特區(qū)（unique short region，US）及US兩側的內部重復序列與末端重復序列組成，編碼70多種蛋白[2-5]。PRV能感染多種宿主，但豬是其主要的天然宿主、貯存者和傳播者。不同年齡段的豬都可感染，主要引起妊娠母豬流產、死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬高死亡率，及種豬不育[1,6,7]。我國于20世紀40年代末在貓中首次發(fā)現PRV，60年代初在豬群中也出現了PRV流行，至今該病毒仍在我國豬群中廣泛流行，嚴重威脅著我國豬群的健康[8]，并造成了嚴重經濟損失[9]。對豬偽狂犬病的防控與凈化最有效的手段是接種基因缺失疫苗并配合血清學檢測來完成[10,11]。自20世紀90年代我國使用偽狂犬病活疫苗Bartha k61株對豬偽狂犬病進行防控，使其得到了有效的控制。2011年，由偽狂犬病毒變異株引起的豬偽狂犬病在我國大面積爆發(fā)，造成母豬繁殖障礙和初生乳豬死亡，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。童武等[7]研究表明，該變異株病毒與經典的偽狂犬病毒強毒株相比，其許多基因發(fā)生了較大的變異；且該變異株病毒對小鼠和豬的致病力較經典的偽狂犬病毒強毒株也明顯增強；同時免疫保護性試驗結果表明，Bartha k61疫苗已經不能有效的為免疫豬群提供保護[12-17]。目前豬偽狂犬病毒變異株已經在全國范圍內流行，疫病防控形勢嚴峻，國內很多研究學者都在研制針對偽狂犬病毒變異株的疫苗[18-23]。本實驗室運用同源重組的方法成功構建出了偽狂犬病疫苗候選株JS-2012-△gI/gE，以JS-2012-△gI/gE毒株為種毒研制豬偽狂犬病滅活疫苗[24]，現將豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-△gI/gE株）的制備方法及其免疫效力研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 種毒、細胞、佐劑 偽狂犬病毒雙基因缺失毒株（JS-2012-△gI/gE株）由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所豬病研究室構建[24]，制苗用偽狂犬病毒液（JS-2012-△gI/gE株，107.0TCID50/mL）和Vero細胞由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所豬病研究室（本研究室）制備并保存；佐劑MONTANIDE ISA 201VG購于賽彼克（上海）特殊化學品有限公司。

1.2 實驗豬、實驗試劑及耗材 本實驗所使用的陰性實驗豬購自南京某豬場；偽狂犬病毒gB和gE抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司；動物實驗所用的注射器、采血器、防護服、體溫計等均購自上?；羯锟萍加邢薰?；胎牛血清、胰酶和DMEN為Invitrogen公司產品；細胞培養(yǎng)耗材購自上海百賽生物科技有限公司。

1.3 病毒的滅活 將制苗用病毒液分為2組，每組分別加入終濃度為0.15%或0.2%的甲醛溶液，37℃滅活，滅活期間每隔4～6 h搖勻病毒液1次。在滅活后24 h和36 h每組各取出一部分病毒液，用于滅活檢驗。

1.4 滅活檢驗 取滅活后的病毒液，用含2%小牛血清的DMEM做50倍稀釋，然后按合適的體積比用含2%小牛血清的DMEM細胞維持液稀釋后，接種T150細胞培養(yǎng)瓶中的長成良好單層Vero細胞的T150細胞培養(yǎng)瓶（用前棄去培養(yǎng)液），置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，凍融1次，取上清液，按合適的體積比用含2%小牛血清的DMEM細胞維持液稀釋后，按上述方法再盲傳2次，觀察并記錄細胞病變。如無細胞病變，則病毒滅活完全。

1.5 滅活疫苗制備 先將疫苗佐劑（賽彼科公司201水包油包水佐劑）輸入乳化罐中低速（80 r/min）攪拌，按照質量比再緩慢加入經無菌檢驗和滅活檢驗合格的病毒液。當溫度達到31℃時，加速（330 r/ min）乳化40 min，然后把轉速慢慢降到150 r/min，再把溫度降到20℃以下，分裝。取一部分用于性狀檢驗，其余保存于2℃～8℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 免疫效力試驗 將15頭14日齡豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型抗原、抗體陰性的健康仔豬隨機分成5組，每組3頭。第一組豬接種豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-△gI/gE株）2 mL/頭，免疫后28 d第一組和第二組豬接種豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-△gI/gE株）2 mL/頭，第三組實驗豬不做處理作為對照。待第二次免疫后28 d，3組實驗豬均滴鼻接種PRV JS-2012第5代強毒2 mL，含105.0TCID50/頭，并觀察臨床表現（體溫、呼吸癥狀、食欲、生長狀態(tài)和神經癥狀等）。分別在免疫后0、7、14、21、28、35、42、49、56 d，以及攻毒后1～14 d采集血液并分離血清。攻毒后14 d剖殺剩余實驗豬，進行組織病理學觀察。

1.7 PRV抗體檢測 將攻毒前不同時間點采集的豬血清，用IDEXX公司 PRV gB和gE抗體檢測試劑盒來檢測針對PRV的特異性gB和gE抗體。

1.8 臨床及組織病理變化觀察 對攻毒試驗中發(fā)病死亡或試驗結束迫殺的仔豬，進行病理剖檢。取腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹股溝淋巴結等組織進行眼觀病變觀察并拍照。對上述所取的各組豬的組織臟器用10%中性福爾馬林固定，制作病理切片，在顯微鏡下觀察病理變化。

2 結果

2.1 制苗用病毒液的滅活效果 對收獲的病毒液（JS-2012-△gI/gE）株進行滅活，滅活效果顯示，在收獲的病毒液中加入終濃度為0.15%和0.2%的甲醛，作用24 h和36 h，都能使病毒完全滅活，病毒液在Vero細胞上盲傳3代均未出現細胞病變。

2.2 滅活疫苗的制備及檢驗 將滅活后的病毒液與佐劑MONTANIDE ISA 201VG進行乳化。性狀檢驗：外觀，乳化好的滅活疫苗為均勻的淡粉紅色乳劑，符合規(guī)定要求；劑型，取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于清潔冷水表面，呈云霧狀擴散，符合規(guī)定要求；粘度，用旋轉式黏度計檢測，為81 cP，符合規(guī)定要求；穩(wěn)定性，吸取疫苗10 mL加入離心管中，以1811×g離心15 min，無析出，符合規(guī)定要求。無菌檢驗，按現行《中國獸藥典》進行檢驗，無菌生長。

2.3 臨床癥狀 各疫苗免疫組的實驗豬在接種疫苗后均無過敏反應，接種部位無炎性反應。疫苗接種后除個別仔豬出現短暫的厭食外，其余試驗豬均無異常表現。攻毒后，第一組（免疫2次）實驗豬有短暫的發(fā)熱，無任何其他異常臨床表現，保護率為100%；第二組（免疫1次），有2頭豬d3開始發(fā)病，表現精神沉郁、厭食和身體持續(xù)性顫栗，其余3頭實驗豬有發(fā)熱，但無任何其他異常臨床表現，保護率為60%；第三組，在攻毒后48 h，5頭實驗豬體溫均迅速上升到41℃以上，并表現為明顯的精神沉郁、厭食、呼吸困難和神經癥狀，并在攻毒后的d6死亡2頭仔豬，d7死亡1頭仔豬，發(fā)病率為100%，死亡率為60%。詳見表1、圖1和圖2。

表1 豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-△gI/gE株）的免疫效果Table 1 Protective eff cacy of inactivated swine Pseudorabies vaccines (JS-2012-△gI/gE strain)

2.4 PRV的特異性抗體檢測 第一組在攻毒前gB抗體均呈強陽性，S/N值均在0.05左右且離散度?。坏诙M在攻毒前gB抗體雖均呈陽性，但S/N值均在0.12與 0.42之間且離散度大；第三組在對應的各時間點PRV gB抗體均為陰性。各組全部試驗豬PRV gE抗體在攻毒前的各個時間點均為陰性（圖3）。

圖1 攻毒后豬的體溫變化Fig.1 Body temperature changes of piglets at 0-14 days post challenged with PRV JS-2012

圖2 攻毒后各組豬不同時間的存活情況Fig.2 Survival of piglets at 0-14 days post challenged with PRV JS-2012

圖3 免疫豬PRV特異性抗體動態(tài)變化Fig. 3 PRV specif c antibody responses in piglets of different groups after immunization

2.5 臨床眼觀病理變化 對本實驗中攻毒后死亡或實驗結束迫殺的仔豬進行解剖。取腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹股溝淋巴結等組織進行眼觀病變觀察并拍照。第一組所有實驗豬的腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹股溝淋巴結等組織臟器均未見明顯眼觀病理變化。第二組，2頭發(fā)病的豬腦脊液明顯增多，腦膜腫脹增厚，血管擴張，并伴隨少量出血；肺臟輕度氣腫，并伴有出血、壞死、肉實變；腹股溝淋巴結輕微充血腫脹；脾臟邊緣輕微淤血且腫大；腎臟可見少量點狀出血；肝臟邊緣淤血壞死。第三組，病死或最終存活的仔豬大都體型消瘦且被毛粗亂，剖檢見腦脊液明顯增多，腦膜腫脹且明顯增厚、血管擴張，并伴隨嚴重出血；肺臟氣腫，并伴有出血，壞死，大面積肉實變；腹股溝淋巴結明顯充血腫脹；脾臟邊緣明顯淤血且腫大；腎臟可見大量點狀出血；肝臟邊緣嚴重淤血壞死（圖4）。

2.6 組織病理學觀察 對攻毒后死亡或實驗結束迫殺的仔豬進行解剖。每頭豬取腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹股溝淋巴結組織，用10% 中性福爾馬林固定，選取腦、肺臟、肝臟進行病理切片制作。病理切片顯示，第一組實驗豬腦、肺臟、肝臟、腎臟、腹股溝淋巴結、脾臟、心臟等組織均未見明顯病理變化。第二組發(fā)病豬腦膜表面血管擴張、炎性細胞浸潤；肺臟組織未見明顯病理變化；肝細胞空泡樣變性；腎臟多發(fā)性腎組織壞死，炎性細胞浸潤；腹股溝淋巴結、脾臟、心臟均未見明顯病理變化。第三組實驗豬腦珠網膜下血管高度擴張充血、出血，膿性滲出，大腦皮層腦水腫，充血，大量炎細胞浸潤；肺臟淤血水腫；肝臟淤血；腎臟腎小管上皮細胞空泡變性；腹股溝淋巴結淋巴細胞減少；脾臟淋巴細胞減少，脾臟萎縮；心臟未見明顯病理變化（圖5）。

圖4 免疫后攻毒豬剖解的眼觀病變F i g . 4 T h e a u t o p s y l e s i o n s o f p i g l e t s a f t e r i m m u n i z a t i o n a g a i n s t p o i s o n

圖5 攻毒組及空白對照組不同組織的病理切片觀察（H E , 2 0 0 ×）F i g . 5 P a t h o l o g i c a l s e c t i o n o b s e r v a t i o n o f d i f f e r e n t t i s s u e s i n p i g s a f t e r c h a l l e n g e（H E , 2 0 0 ×）

3 討論

2011年以來，由偽狂犬病毒變異株引起的豬偽狂犬病在我國大面積爆發(fā)，造成母豬繁殖障礙和初生乳豬死亡，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。對于新出現的偽狂犬病毒變異毒株的侵襲，傳統(tǒng)的偽狂犬病疫苗已不能提供完全的保護。

本實驗室對新出現的偽狂犬病毒變異株運用同源重組的方法成功構建出了偽狂犬病疫苗候選株JS-2012-△gI/gE，并以JS-2012-△gI/gE毒株為種毒研制了豬偽狂犬病滅活。本研究主要是探討豬偽狂犬病基因缺失滅活疫苗的制備及其免疫效力評價，結果顯示，第一組免疫后能產生高水平的gB抗體，攻毒后試驗豬除了短暫發(fā)熱外，未見其他臨床癥狀，且剖解眼觀病變與組織病理切片顯示也均良好。第二組免疫后能產生gB抗體但抗體滴度及整齊度均不佳，攻毒后有兩頭實驗豬發(fā)病，剖解眼觀病變與組織病理切片顯示發(fā)病豬的組織臟器也均有病理變化。第三組攻毒后實驗豬全部發(fā)病，死亡率60%，剖解眼觀病變與組織病理切片顯示發(fā)病豬及死亡豬的組織臟器也均有嚴重病理損傷。根據本研究結果，我們確定豬偽狂犬病滅活疫苗（PRV JS-2012-△gI/gE株）的免疫次數為2次，免疫間隔28 d。

豬偽狂犬病基因缺失滅活疫苗具備常規(guī)滅活疫苗的安全性，不會存在散毒及毒力返強的風險，且該滅活疫苗具有很好的免疫原性，同時該滅活疫苗缺失的gE基因能夠作為分子標記來區(qū)分疫苗接種動物與野毒感染動物。本研究將為偽狂犬病毒變異株的防控及凈化提供理論基礎和科學依據。

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PREPARATION AND IMMUNE EFFICACY EVALUATION OF INACTIVATED SWINE PSEUDORABIES VACCINE (JS-2012-△gI/gE STRAIN)

TONG Wu1,2, LI Guo-xin1,2, ZHENG Hao1,2, LIU Fei1, LIANG Chao1, LI Lin1, TIAN Qing1, CAO Yanyun1, WU Ji-qiang1, WANG Tao1, ZHENG Xu-chen1, SHAN Tong-ling1,2, TONG Guang-zhi1,2

(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

The Pseudorabies virus (PRV, JS-2012-△gI/gE strain) inactivated with 0.15% formalin was homogenized with MONTANIDE ISA 201 VG (SEPPIC) to prepare the inactivated swine PR vaccine. In order to evaluate the protective effcacy of the inactivated swine PR vaccine, fifteen 2-week-old piglets which were free of PRV, porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), porcine circovirus (PCV2) and classical swine fever virus (CSFV)) were selected randomly and divided equally into three groups. Group 1 were inoculated intramuscularly (i.m.) with 2 mL of inactivated swine Pseudorabies vaccines (JS-2012-△gI/gE strain). At 28 dayspost-frst inoculation, group 1 and group 2 were inoculated intramuscularly. with the inactivated vaccines at the same dosage. group 3served as uninoculated control. At 28 days post-inoculation (DPI), all piglets were challenged intranasally with 105.0TCID50of PRV (JS-2012 strain). Following the challenge, clinical signs and rectal temperatures were recorded daily for 14 days. The results showed PRV g B antibody levels of piglets vaccinated twice (Group 1) was higher than those vaccinated once (Group 2), The protective eff cacy of the inactivated swine PR vaccine against PRV after double inoculation(Group 1) was better than that after single inoculation (Group 2).

Pseudorablies virus; inactivated vaccine; preparation; immune eff cacy evaluation

S852.659.1

A

1674-6422（2016）06-0012-07

2016-04-21

上海市自然科學基金項目（14ZR1448900)；上海市科技興農重點攻關項目（滬農科攻字（2015）第1-7號）；國家生豬現代產業(yè)技術體系項目（CARS-36）；公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201203039）

童武，男，碩士，助理研究員，主要從事豬偽狂犬病毒及其疫苗的研究

童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn