模擬加速度對腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠氧化應(yīng)激的影響

陳凱凱,郭和清,穆大為,李建業(yè),嚴(yán)景民,尹杏林,張立銘

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·論著·

模擬加速度對腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠氧化應(yīng)激的影響

陳凱凱,郭和清,穆大為,李建業(yè),嚴(yán)景民,尹杏林,張立銘

[摘要]目的探討加速度暴露對腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠氧化應(yīng)激的影響。方法采用乙二醇飲水和氯化銨灌胃法誘導(dǎo)建立大鼠草酸鈣結(jié)石模型，將40只8周齡Wistar健康雄性大鼠隨機(jī)分為4組(每組10只)：空白對照組(A組)、單純誘石組(B組)、加速度并誘石組(C組)和單純加速度組(D組)。其中A組采用自來水飲水+生理鹽水2 mL/d灌胃，B組采用1%乙二醇+2%氯化銨溶液2 mL/d灌胃，C組在B組的基礎(chǔ)上給予加速度(+6G)暴露，D組單純給予+6G暴露。各組大鼠在相同條件下飼養(yǎng)28 d后收集血液及雙腎標(biāo)本，左腎組織做石蠟切片HE染色，光鏡下觀察草酸鈣結(jié)晶情況；右腎組織制成組織勻漿，測定血液和右腎組織勻漿中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、還原性谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量，以了解氧化應(yīng)激情況。結(jié)果單純誘石組和加速度并誘石組腎組織草酸鈣結(jié)晶評分較空白對照組和單純加速度組均顯著增高(P<0.01)，加速度并誘石組結(jié)晶評分亦較單純誘石組增高(P<0.01)。單純誘石組和加速度并誘石組與空白對照組比較，大鼠血、腎組織MDA濃度顯著升高(P<0.01)，血、腎組織SOD、CAT、GSH-Px濃度顯著降低(P<0.01)。結(jié)論加速度暴露可能是泌尿系結(jié)石形成的危險(xiǎn)因素之一，其機(jī)制可能與加速度暴露引起大鼠腎臟組織氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]腎結(jié)石；草酸鈣；加速度；氧化應(yīng)激；大鼠

作者單位：100142北京，北京空軍總醫(yī)院泌尿外科

引用格式：陳凱凱,郭和清,穆大為,等.模擬加速度對腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠氧化應(yīng)激的影響[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(1):10-12，31.

泌尿系結(jié)石是飛行人員常見疾病，病因復(fù)雜，絕大多數(shù)患者無明顯解剖及生理異常，主要表現(xiàn)為上尿路結(jié)石，患病率達(dá)2.6%~7.8%[1]。在因泌尿系統(tǒng)疾病住院的飛行員中，泌尿系結(jié)石所占比例高達(dá)70%左右[2]。主要原因考慮與患者飲食結(jié)構(gòu)和自身職業(yè)特點(diǎn)有關(guān)，如長期攝入高蛋白、高嘌呤、高蔗糖及高鈣膳食，長時(shí)間飛行時(shí)出汗，尿中結(jié)晶鹽經(jīng)常處于過飽和狀態(tài)，均可促進(jìn)泌尿系結(jié)石的形成[3-4]。有研究證實(shí)加速度暴露可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激從而引起腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷[5]，而腎小管上皮細(xì)胞損傷是腎結(jié)石發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[6]，但是關(guān)于加速度暴露是否是腎結(jié)石形成的危險(xiǎn)因素，國內(nèi)研究較少，本實(shí)驗(yàn)擬通過研究加速度對大鼠氧化應(yīng)激及腎草酸鈣結(jié)石形成的影響，為臨床防治飛行員泌尿系結(jié)石提供理論探討。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料SPF級(jí)健康成年雄性Wister大鼠40只，體重180～220 g，由解放軍304醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[批準(zhǔn)文號(hào)：SYXK(軍)2012-0014；合格證號(hào)：No.11401500002634]；小動(dòng)物專用離心機(jī)(長春奧普光電公司，中國)由航空醫(yī)學(xué)研究所提供；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、還原性谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；1%乙二醇、2%氯化銨(生產(chǎn)批號(hào)：130105)購自西隴化學(xué)股份有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)經(jīng)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，大鼠的使用符合動(dòng)物保護(hù)相關(guān)倫理?xiàng)l例。所有大鼠自由攝取食物、水，在25 ℃空調(diào)恒溫、12 h白晝循環(huán)環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)分組法分為4組，每組10只，從第2周開始施加不同干預(yù)因素繼續(xù)飼養(yǎng)4周。參考文獻(xiàn)[7]復(fù)制腎草酸鈣結(jié)石模型：空白對照組(A組)，自來水飲水+生理鹽水2 mL/d灌胃；單純誘石組(B組)，1%乙二醇+2%氯化銨2 mL/d灌胃；加速度并誘石組(C組)，在B組的基礎(chǔ)上給予加速度干預(yù)，使用小動(dòng)物離心機(jī)在加速度(+6G)下暴露1 min，5次/d，每次中間休息5 min，每周3次，共4周；單純加速度組(D組)，自來水飲水+生理鹽水2 mL/d灌胃，加速度干預(yù)同C組。

1.3觀測指標(biāo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第4周末，斷頸處死大鼠，下腔靜脈穿刺取血，迅速取出雙腎。右腎使用組織勻漿器制成10%組織勻漿待測氧化應(yīng)激指標(biāo)；左腎用4%甲醛固定，石蠟切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察腎組織草酸鈣結(jié)晶及病理改變情況。光鏡觀察左腎常規(guī)切片成石情況根據(jù)結(jié)晶的分布區(qū)域及結(jié)晶形成程度的雙重因素進(jìn)行評分[8]。結(jié)晶情況以積分值來評價(jià)，積分值[8]由結(jié)晶分布區(qū)域的分值與結(jié)晶形成程度的分值相乘得到，即：結(jié)晶分布區(qū)域以腎皮質(zhì)內(nèi)結(jié)晶為1分，腎皮質(zhì)及腎髓質(zhì)內(nèi)結(jié)晶為2分，腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)、腎乳頭內(nèi)均有結(jié)晶為3分，腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)、腎乳頭及腎盂內(nèi)均有結(jié)晶為4分；結(jié)晶形成程度以無為0分，極少為1分，較多為2分，廣泛形成為3分。

按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書，測定腎組織勻漿中MDA、SOD、GSH、GSH-Px及CAT含量。

2結(jié)果

2.1各組大鼠腎組織切片草酸鈣結(jié)晶情況A組:腎組織無結(jié)晶形成，腎乳頭、腎盂、腎盞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊、規(guī)則，腎小管腔內(nèi)無壞死脫落樣物質(zhì)；B組:腎組織部分可見皮質(zhì)或及髓質(zhì)或及腎乳頭少量或較多結(jié)晶，形狀不規(guī)則、折光性較強(qiáng)，少量炎細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞有時(shí)可見腫脹，間質(zhì)有少量水腫；C組大鼠: 腎組織皮質(zhì)、髓質(zhì)、腎乳頭皆可見大量無色透明草酸鈣結(jié)晶形成，大部分腎組織切片內(nèi)可見結(jié)石結(jié)晶，切片各部分均可見大量炎細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞腫脹；D組大鼠：腎組織無結(jié)晶形成，腎乳頭、腎盂、腎盞結(jié)構(gòu)清晰，腎小球形狀較規(guī)則，少量炎細(xì)胞浸潤，腎小管有時(shí)可見擴(kuò)張，上皮細(xì)胞有時(shí)可見腫脹，間質(zhì)有少量水腫(圖1)。B組、C組腎組織草酸鈣結(jié)晶評分(分別為7.1±2.9、10.3±3.6)比A組、D組(均為0±0)顯著增高(P<0.01)，C組結(jié)晶評分亦較B組顯著升高(P<0.01)。

2.2各組大鼠血、腎組織勻漿MDA等的比較與A組比較，B、C、D組大鼠血、腎組織MDA濃度顯著增加(表1，P<0.01)，加速度干預(yù)(C、D組)可增加血、腎組織MDA。與A組比較，B、C、D組大鼠血、腎組織SOD、GSH-Px、CAT濃度顯著降低(P<0.01)，且C組0.05)。

3討論

圖1　光鏡下各組大鼠腎組織草酸鈣結(jié)晶(箭頭所示)情況 (HE ×400)

表1　各組大鼠血、腎勻漿組織MDA和SOD等的比較±s)

項(xiàng)目A組(n=10)B組(n=10)C組(n=10)D組(n=10)血MDA(nmol/mL)20.35±2.3536.92±3.23#43.22±3.52#27.95±1.87#腎勻漿MDA(nmol/mgpr)8.67±0.8412.43±0.96#15.33±0.71#10.63±0.79#血SOD(U/mL)115.45±18.3775.99±15.55#53.67±12.35#93.98±17.35#腎勻漿SOD(U/mgpr)324.36±26.67198.71±32.32#116.85±18.25#246.11±26.58#血CAT(U/mL)6.64±0.694.32±0.46#3.32±0.41#5.38±0.62#腎勻漿CAT(U/mgpr)138.47±8.74129.87±9.55#118.95±6.35#133.49±7.45#血GSH-Px(U/mL)26.84±2.8621.06±3.61#15.33±4.56#24.73±3.54#腎勻漿GSH-Px(U/mLpr)46.28±3.4733.63±4.63#37.62±2.97#38.94±3.99#血GSH(nmol/mL)38.98±4.5526.87±3.92#23.72±3.24#25.33±2.53#腎勻漿GSH(nmol/mLpr)122.33±12.5489.72±9.93#83.95±8.54#88.81±9.33# 注:與A組比較,﹟P<0.01

為研究加速度暴露因素對大鼠腎草酸鈣結(jié)石的影響及其發(fā)生機(jī)制，我們采用乙二醇飲水和氯化銨灌胃法誘導(dǎo)建立了大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型[7]。乙二醇是草酸代謝的間接前體，在體內(nèi)經(jīng)過羥乙酸途徑代謝產(chǎn)生草酸，是目前復(fù)制腎草酸鈣模型最常用的基礎(chǔ)誘石劑，常與腎毒性藥物氯化銨聯(lián)用加快腎結(jié)石的形成，提高造模成功率。本實(shí)驗(yàn)中大鼠飲用1%乙二醇溶液和2%氯化銨溶液灌胃后腎小管內(nèi)出現(xiàn)了結(jié)石結(jié)晶，說明造模成功，與國內(nèi)外有關(guān)作者[7-8]報(bào)道一致。其中C組草酸鈣結(jié)晶評分高于B組，說明大鼠暴露于加速度下促進(jìn)了腎小管內(nèi)草酸鈣結(jié)晶量的增加。

加速度暴露促進(jìn)腎結(jié)石的形成可能與腎臟氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。正常情況下，機(jī)體存在著氧自由基的產(chǎn)生與清除酶系統(tǒng)之間的動(dòng)態(tài)平衡，一旦這種平衡遭到破壞即可造成細(xì)胞的損傷而致病。氧自由基不僅能直接損傷腎小管上皮細(xì)胞，還能引起脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的增多，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，繼而在各種大分子的作用下觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)腎結(jié)石的最終形成[9]。Khan等[10]研究認(rèn)為腎小管管腔壁可能是草酸鈣結(jié)石最初成核部位，草酸鈣結(jié)晶體附著并生長依賴于腎小管上皮細(xì)胞的損傷。草酸鈣會(huì)刺激腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇ROS引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致上皮細(xì)胞自身損傷進(jìn)而產(chǎn)生帶負(fù)電荷的物質(zhì)如磷脂酰絲氨酸等并成為附著點(diǎn)，草酸鈣即以此為中心進(jìn)行黏附并生長[11]。腎小管上皮細(xì)胞損傷后還可以導(dǎo)致其能夠抑制晶體結(jié)晶過程的物質(zhì)生成減少，從而有利于腎結(jié)石的形成。

持續(xù)性加速度作用是航空航天飛行活動(dòng)中的常見現(xiàn)象，隨著新型戰(zhàn)斗機(jī)的大量服役，這一問題將更加突出。在加速度作用下，隨著流體靜壓梯度的增加，器官的動(dòng)脈血壓降低，血流量下降到臨界值以下時(shí)，組織發(fā)生急性缺血缺氧[12]，血液轉(zhuǎn)移及血液動(dòng)力學(xué)改變所引起的機(jī)體變化類似“缺血再灌注”的影響。組織缺血再灌注以及強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)等均可引起機(jī)體氧自由基代謝異常[13]，從而引起腎結(jié)石的發(fā)生發(fā)展。MDA水平可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，而SOD是在機(jī)體活性氧清除反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用的抗氧化酶[14]。本實(shí)驗(yàn)大鼠暴露于加速度后，血和腎組織MDA較對照組顯著升高(P<0.01),血、腎組織SOD、GSH-Px、CAT濃度顯著降低(P<0.01)，驗(yàn)證了加速度暴露不僅能直接導(dǎo)致氧自由基的產(chǎn)生，還能降低腎臟的SOD和CAT的活性，從而升高腎組織中氧自由基的水平，顯著增加的氧自由基具有直接的細(xì)胞毒性而致腎損傷，并促進(jìn)腎結(jié)石的發(fā)生及發(fā)展

綜上所述，加速度暴露會(huì)促進(jìn)腎小管內(nèi)草酸結(jié)晶量的增加，其機(jī)制可能與加速度作用引起腎臟氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，建議臨床上對暴露于持續(xù)性加速度的飛行人員采取相關(guān)防護(hù)措施。以上結(jié)論是在大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上的推測，飛行人員經(jīng)受加速度暴露環(huán)境后，相關(guān)指標(biāo)變化趨勢是否與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，還應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步研究證實(shí)。

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(本文編輯：張仲書；英文編輯：王建東)

Effect of acceleration on oxidative stress of renal calcium oxalate rat models

CHENKai-kai,GUOHe-qing,MUDa-wei

,LIJian-ye,YANJing-min,YINXing-lin,ZHANGLi-ming.DepartmentofUrology,AirForcePLAGeneralHospital,Beijing100142,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of accelerationon on oxidative stress of renal calcium oxalate (CaOx) rat models. MethodsThe models of renal CaOx were established with Ethylene Glycol(EG) in drinking water and Ammonium Chloride(AC) by gavage. A total of 40 adult healthy male Wistar rats were randomly and averagely divided into 4 groups(10 of each): blank control group(A), stone forming group(B), stone forming with +6G exposure group(C) and +6G exposure naive group(D). Group A was established with drinking water and physiological saline by gavage (2 mL per day). Group B was established with 1% ethylene glycol in drinking water and 2% ammonium chloride by garage(2 mL per day). Group C, with the foundation of group B, was exposed in+6G. Group D was exposed in +6G as same as group C. After feeding for 28 days, blood and renal samples were collected. The presence of CaOx crystals was scored in left renals under hematoxylin and eosin staining, and the level of malonddialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione (GSH) and glutathione Peroxidase (GSH) in the blood and right renal homogenate were measured as indicators of oxidative stress. ResultsFor the formation of CaOx crystals, the score of group B and group C were significantly higher than group A and group D(P<0.01), and the score of group C were significantly higher than group B(P<0.01). For the parameter of oxidative stress, compared with group A, the concentration of MDA in blood and kidney tissues of group B significantly increased (P<0.01),which significantly increased (P<0.01) after the intervention of +6G (group C). Compared with group A, the content of SOD, CAT and GSH-Px in blood and kidney tissues of group B significantly decreased (P<0.01), which significantly increased (P<0.01) after the intervention of +6G (group C). ConclusionAcceleration would be one of the risk factor contributed to kidney stone formation. The mechanism is connected with the oxidative damage of renal tissue．

[Key words]kidney calculi; calciumoxalate; acceleration; oxidative stress; rats

(收稿日期：2015-10-18；修回日期：2015-11-22)

通訊作者：郭和清，E-mail：guoheqing@sina.com

基金項(xiàng)目：全軍后勤科研“十二五”重大項(xiàng)目(AKJ11J004)

[中圖分類號(hào)]R852

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.01.003