合歡花HPLC指紋圖譜模式識別及含量測定研究

1.貴州醫(yī)科大學民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2. 貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州 貴陽 550004；3. 貴州醫(yī)科大學貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004

合歡花又名夜合歡、合歡米，為豆科植物合歡AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥花絮或花蕾，其性平，味甘，歸心、肝經(jīng)，具有解郁安神、鎮(zhèn)靜催眠的功效，臨床多用于治療虛煩不眠、抑郁不舒等癥[1-3]，在華東、華南、遼寧及陜西等地均有分布[4]。合歡花化學成分主要有以異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素為代表的黃酮類化合物和揮發(fā)油等，其中槲皮苷含量最高，且對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制活性，具有鎮(zhèn)靜催眠作用[5-8]。

中藥材化學成分復雜，表現(xiàn)出多成分、多靶點的作用特點，通過單一指標的量難以全面反映藥材質(zhì)量的優(yōu)劣[9-10]。指紋圖譜具有整體性高、特征性強等基本屬性，在質(zhì)量綜合評價中起到十分重要的作用，化學模式識別能對指紋圖譜的多維信息進行分析處理，使指紋圖譜信息得以充分表達，已廣泛應用于多種中藥的質(zhì)量控制研究[11-15]。本研究建立合歡花HPLC指紋圖譜，并對其進行模式識別分析，結(jié)果表明槲皮苷是導致藥材質(zhì)量差別貢獻最大的化學成分，為質(zhì)量標志性成分，因此，對槲皮苷進行含量測定研究，以期為其質(zhì)量評價提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司，包括系統(tǒng)控制器、輸液泵、脫氣組件、低壓梯度組件、自動進樣器、柱溫箱、溫控樣品室、UV-DAD檢測器及Chromeleon 色譜數(shù)據(jù)工作站)；Mettler AE-240型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Multifuge X3R型高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；WP-UP-IV-10型超純水機(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試藥 槲皮苷對照品(成都植標化純生物技術(shù)有限公司，批號：181216，純度：≥98%)；異槲皮苷對照品(批號：wkq18022308，純度：≥98%)、槲皮素對照品(批號：wkq18030806，純度：≥98%)均購于四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 藥材 合歡花藥材購于山東，經(jīng)貴州醫(yī)科大學劉春花副教授鑒定為豆科雙子葉植物合歡AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥花序或花蕾。藥材來源見表1。

表1 藥材來源及信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters CORTECS C18(150 mm×4.6 mm，2.7 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脫(0～5 min，5%A～15%A，5～30 min，15%A～20%A，30～40 min，20%A～95%A)；流速：1 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取槲皮苷、槲皮素、異槲皮苷對照品，用甲醇溶解制成1.430、0.4350、0.5250 mg/mL的對照品貯備溶液。分別精密量取上述單一對照品貯備液0.2 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度分別為0.0572、0.01740、0.02100 mg/mL混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過三號篩)約1 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷，稱定質(zhì)量，補重，搖勻，離心10 min(12 000 r/min)，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液及空白溶液各10 μL，進樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果表明，空白對照對測定無干擾，所測指標槲皮苷分離度R>1.5，理論塔板數(shù)按槲皮苷計不低于30000，色譜圖如圖1所示。

A.空白溶液

B.混合對照品溶液

C.供試品(S7)溶液圖1 高效液相色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取槲皮苷對照品貯備液0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 mL，置2 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得系列濃度對照品溶液，進樣測定，以槲皮苷濃度(x)對峰面積(y)進行線性回歸，計算出線性回歸方程為y= 376.7x+ 7.738(r=0.999 6)，表明槲皮苷在0.07150～1.073 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.3 檢測限與定量限考察 精密量取“2.2.1”項下槲皮苷對照品溶液適量，倍比稀釋，進樣測定，記錄峰面積。以信噪比為3∶1、10∶1相對應的濃度為檢測限、定量限。結(jié)果表明，槲皮苷的檢測限、定量限分別為0.07150 μg/mL、0.2383 μg/mL。

2.3.4 精密度試驗 取合歡花藥材(S7)約1 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣測定6次，以10號峰槲皮苷為參照，記錄12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.21%(n=6)，相對峰面積的RSD均小于0.98%(n=6)，槲皮苷峰面積的RSD為0.088%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取合歡花藥材(S7)約1 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以10號峰槲皮苷為參照，記錄12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.33%(n=6)，相對峰面積的RSD均小于2.9%(n=6)，槲皮苷峰面積的RSD為0.30%(n=6)，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復性試驗 取合歡花藥材(S7)約1 g，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以10號峰槲皮苷為參照，記錄12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算樣品含量。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%(n=6)，槲皮苷的平均含量為13.72 mg/g，RSD為0.30%(n=6)，表明本方法重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 取已知槲皮苷含量的合歡花藥材(S7)6份，每份0.5 g，精密稱定，精密加入槲皮苷對照品溶液適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算回收率。結(jié)果表明，槲皮苷的平均回收率為97.75%，RSD為0.25%(n=6)。詳見表2。

表2 加樣回收率試驗(n=6)

2.4 HPLC指紋圖譜的建立及相似度評價、共有峰的指認

2.4.1 HPLC指紋圖譜的建立 取16批合歡花藥材，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。將得到的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012版)進行分析，得16批藥材樣品的HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜，如圖2、圖3所示。

圖2 16批藥材樣品疊加指紋圖譜

圖3 藥材樣品HPLC對照指紋圖譜

2.4.2 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012版)，進行整體相似度評價，結(jié)果顯示，16批合歡花藥材的相似度均大于0.90，表明藥材樣品間化學成分具有良好的一致性。詳見表3。

表3 16批樣品指紋圖譜相似度評價結(jié)果

2.4.3 共有峰的指認 16批藥材樣品共有12個共有峰，通過與混合對照品溶液HPLC圖(圖1)比對，指認了3個共有峰，即8號峰為異槲皮苷，10號峰為槲皮苷，12號峰為槲皮素，其中10號峰槲皮苷出峰時間、峰面積均較為穩(wěn)定，故選擇其為參照峰，計算其他共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間RSD均小于0.28%，表明各批次間共有峰出峰時間較為穩(wěn)定，相對峰面積RSD為0%～24.20%，說明不同批次間化學成分含量差異較大。

2.5 樣品含量測定 取16批合歡花藥材各適量，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。詳見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果 (n=2，%)

2.6 化學模式識別研究

2.6.1 聚類分析 (CA)采用SPSS 22.0軟件，以各共有峰的峰面積為變量，結(jié)合歐氏距離為度量標準，對16批藥材樣品進行聚類分析，如圖4所示。由圖4可知，取歐氏距離為10時，16批藥材樣品可聚為2類，S1～S5、S8～S12、S15～S16聚為一類，S6～S7、S13～S14聚為一類。

圖4 16批藥材樣品聚類分析樹狀圖

2.6.2 主成分分析(PCA) 采用SIMCA 14.1軟件，以標準化后的各共有峰的峰面積為變量，進行主成分分析，得到主成分的特征值和方差貢獻率，詳見表5，結(jié)果表明，前兩個主成分因子的累積方差貢獻率為99.275%>85%，能夠反映合歡花指紋圖譜中共有峰的大部分信息。圖5為16批藥材樣品的PCA散點得分圖，結(jié)果表明，16批藥材樣品可分為2類，I類樣品為S6～S7、S13～S14，II類樣品為S1～S5、S8～S12、S15～S16，該現(xiàn)象與聚類分析結(jié)果基本一致。載荷圖表明2、3、10號色譜峰對藥材的整體質(zhì)量起主要影響作用，如圖6所示。

表5 兩個主成分因子的特征值和方差貢獻率

圖5 16批藥材樣品的PCA散點得分圖

圖6 16批藥材樣品的主成分載荷圖

2.6.3 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)

為了更好的分析不同樣品間差異，本研究進一步采用有監(jiān)督的OPLS-DA模型進行建模分析，結(jié)果表明，該方法將合歡花分成2類，如圖7所示。OPLS-DA模型中的擬合參數(shù)R2X=0.987，R2Y=0.829，模型預測參數(shù)Q2=0.713，均大于0.5，表明建立的數(shù)學模型穩(wěn)定可靠。以VIP>1為標準，篩選導致質(zhì)量差異的主要標記成分，即10號峰(槲皮苷)，如圖8所示。該結(jié)果與PCA分析中載荷圖尋找的重要性權(quán)重變量大體一致，提示在合歡花藥材的利用中需重點關(guān)注此成分的質(zhì)量變化。

圖7 16批藥材樣品的OPLS-DA散點得分圖

圖8 16批藥材樣品各活性成分的VIP圖

3 討論

本實驗在樣品處理過程中，通過對不同提取方式(超聲、回流)、提取時間(30 min、60 min、90 min)、溶劑種類(甲醇、乙醇)進行考察，確定了合歡花樣品制備的方法，即以75%甲醇超聲提取30 min制備供試品溶液。

色譜條件考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水溶液等流動相體系和Waters CORTECS C18、ACE Excel-5 C18等2種色譜柱對峰形、分離度的影響，發(fā)現(xiàn)選擇Waters CORTECS C18色譜柱、乙腈-0.1% 磷酸水作為流動相時色譜峰峰形良好，分離度效果最佳。進行全波長掃描以比較不同波長下的圖譜信息，發(fā)現(xiàn)在270 nm處色譜峰數(shù)較多，因此將其作為最佳檢測波長。

本實驗建立了合歡花HPLC指紋圖譜，確定了12個共有峰，通過對照品對其中3個化學成分進行指認，16批藥材相似度均大于0.90，相對保留時間RSD均小于0.28%，表明藥材整體質(zhì)量一致性較好，相對峰面積RSD范圍為0%～24.20%，化學成分含量差異較大，可能與產(chǎn)地的土壤、氣候、土質(zhì)等有關(guān)[16]。

中藥化學成分復雜，容易受諸多因素影響而導致質(zhì)量的優(yōu)劣差異，模式識別則為建立更加完整和科學的中藥質(zhì)量評價體系提供一個新的思路[17]。因此，為更好的辨別藥物之間的質(zhì)量差異，本實驗結(jié)合CA、PCA、及OPLS-DA三種模式識別方法對合歡花指紋圖譜進一步分析，根據(jù)聚類分析與主成分分析結(jié)果，16批合歡花藥材被分成2類，S1～S5、S8～S12、S15～S16為一類，S6～S7、S13～S14為一類。表明指紋圖譜可能與生長環(huán)境和采收季節(jié)存在一定的相關(guān)性，而導致藥材不同批次之間分類上的差異。經(jīng)OPLS-DA分析，篩選到了1種差異性質(zhì)量標志成分，即10號峰。槲皮苷含量測定的結(jié)果顯示，S16樣品質(zhì)量分數(shù)僅為0.33%，其余15批次樣品質(zhì)量分數(shù)為0.77%～1.31%，可見合歡花藥材雖為同一產(chǎn)地，但不排除因為采收時間、貯藏條件的不同造成含量差異的可能。因此，合歡花藥材的質(zhì)量控制應從產(chǎn)地采收、加工等源頭著手，需重點關(guān)注槲皮苷含量的變化，嚴格把控藥物質(zhì)量。

本研究通過指紋圖譜與化學模式識別結(jié)合的方式，找出影響合歡花整體質(zhì)量的差異性成分，并對其進行含量測定，揭示了合歡花的內(nèi)在質(zhì)量，該方法簡便易行，同時具有靈敏度高、特征性強等優(yōu)點，從多角度較為全面、系統(tǒng)的對藥材質(zhì)量進行控制，同時也為藥材的合理利用提供依據(jù)。