白藜蘆醇通過介導eNOS表達促進局灶腦缺血／再灌注大鼠腦內(nèi)血管再生

李杏芮，陳清，盛華均

（重慶醫(yī)科大學解剖學教研室，重慶 400016）

白藜蘆醇通過介導eNOS表達促進局灶腦缺血／再灌注大鼠腦內(nèi)血管再生

李杏芮，陳清，盛華均*

（重慶醫(yī)科大學解剖學教研室，重慶 400016）

目的探討eNOS在白藜蘆醇促進局灶腦缺血／再灌注大鼠大腦缺血皮質(zhì)區(qū)血管再生中的作用。方法80只SD雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（I／R組）、模型+白藜蘆醇組（I／RB組）、模型+白藜蘆醇+eNOS特異性拮抗劑L-NAME組（I／RBL組）。采用線栓法制備大鼠局灶腦缺血／再灌注模型，再灌注后2h后腹腔注射白藜蘆醇，連續(xù)7d，以再灌注后24h、48h、7d為觀察時相點。對I／R、I／RB和I／RBL組大鼠行改良神經(jīng)功能缺損程度評分，HE染色觀察大腦缺血皮質(zhì)區(qū)病理結(jié)構(gòu)變化，Western Blot檢測eNOS蛋白表達，免疫組織化學檢測VEGF、CD34表達情況，熒光定量PCR檢測eNOSmRNA表達。結(jié)果I／RB組再灌注后各時間點大鼠大腦缺血皮質(zhì)區(qū)eNOS蛋白及mRNA、VEGF蛋白表達較I／R組明顯升高，側(cè)腦室注射L-NAME阻斷eNOS作用后，I／RBL組eNOS、VEGF表達較I／RB組降低。同時，白藜蘆醇可有效促進缺血后神經(jīng)功能恢復、改善缺血損傷后腦組織病理變化，增加CD34+微血管密度。結(jié)論白藜蘆醇可能通過上調(diào)局灶腦缺血／再灌注大鼠大腦缺血皮質(zhì)區(qū)eNOS和VEGF表達，促進腦微血管再生，發(fā)揮缺血損傷后腦保護作用。

局灶腦缺血／再灌注；白藜蘆醇；L-NAME；eNOS；VEGF；腦保護

缺血性腦卒中是臨床常見的高死亡率、高致殘率疾病。缺血性腦卒中早期主要通過腦血流量減少引起腦損傷，缺血后再灌注可通過激活炎癥反應、破壞血腦屏障、促進細胞凋亡介導缺血組織二次損傷［1］。白藜蘆醇是一種生物活性很強的非黃酮類多酚物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、雌激素樣活性、舒張血管、抗炎及氧化等多種生物學功能［2-5］。近年來大量研究表明，白藜蘆醇對缺血后血管再生具有顯著的效應［6-8］，但其作用機制尚不明確。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是缺血后促進血管再生的重要細胞因子［9-10］。本研究通過觀察缺血再灌注大鼠大腦缺血皮質(zhì)區(qū)eNOS、VEGF表達，行改良神經(jīng)功能缺損評分，HE染色觀察大腦缺血皮質(zhì)區(qū)病理變化，免疫組織化學檢測大腦皮質(zhì)CD34標記的微血管密度再生情況，以期探討白藜蘆醇促進腦缺血后腦內(nèi)血管再生的可能機制。

材料與方法

1 主要試劑和儀器

eNOS多克隆抗體（Abcam公司，英國），VEGF多克隆抗體（Abcam公司，英國），CD34多克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology公司，美國），L-NAME（上海碧云天生物有限公司，中國），免疫組織化學試劑盒及DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國），免疫熒光定量PCR相關(guān)試劑（Takara公司，日本），白藜蘆醇（陜西慈緣生物技術(shù)有限公司），eNOS（上海生物生工有限公司合成），Ⅱ型腦立體定位儀（上海江灣儀器廠），凝膠成像儀（Bio-Rad公司，美國）。

2 實驗動物分組與模型建立

清潔級雄性成年SD大鼠80只，體重250～300g（由重慶醫(yī)科大學動物中心［SCXK（渝）2012-0002］提供）。大鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（I／R組）、模型+白藜蘆醇組（I／RB組）、模型+白藜蘆醇+eNOS特異性拮抗劑L-NAME組（I／RBL組），每組20只。采用改良線栓法規(guī)范化制備SD大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血／再灌注模型（middle cerebral artery occlusion／reperfusion，MCAO／R），采用改良神經(jīng)功能缺損程度評分（Modified Neurological Severity Score，mNSS）［11］評價白藜蘆醇干預前后MCAO／R大鼠神經(jīng)功能恢復情況。

3 白藜蘆醇及L-NAME給藥方法

腹腔注射白藜蘆醇方法：首次給藥于再灌注后2h進行，經(jīng)腹腔注射白藜蘆醇，計量為30 mg／kg，以后每日1次，連續(xù)7d。

側(cè)腦室注射L-NAEM方法：采用立體定位儀，側(cè)腦室注射L-NAME，計量為8mg／kg，每日1次，連續(xù)7d。L-NAME終濃度為8mg／mL［12］。

4 eNOS的W estern Blot檢測

取缺血區(qū)大腦皮質(zhì)約100mg加入蛋白裂解液（RIPA：PMSF＝100：1），徹底勻漿后靜置30min，4℃10000r／min離心10min，取上清液，即為全蛋白提取物。采用BCA蛋白定量法檢測所提蛋白濃度。用4 ×上樣緩沖液將剩余蛋白稀釋成相同濃度，后100℃沸水中煮5min，-80℃保存。以10ug上樣量行SDSPAGE凝膠電泳（10%分離膠，12%濃縮膠），恒壓操作60-100V電泳約2.5h，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉90min，孵育一抗（eNOS抗體稀釋比例為1：1000），4℃過夜后復溫2h，TBST洗膜后孵育二抗（稀釋比例為1：2000）2h，TBST洗膜后ECL凝膠成像儀顯影，采用Fusion軟件進行灰度值分析。

5 eNOSm RNA的qPCR檢測

按Takara說明書提取各組大鼠大腦缺血區(qū)皮質(zhì)總RNA，取1μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄為20μl cDNA。根據(jù)GenBank提供的基因序列，擴增大鼠eNOSmRNA的上游引物5′-GCAGAGGAGTCCAGCGAACA-3′，下游引物為5′-GAAATTGTTCCAGCACCTCTAGC -3′，產(chǎn)物長度115bp。擴增條件為預變性95℃30s，PCR反應95℃5s、60℃30s，40個循環(huán)。

6 VEGF及CD34的免疫組織化學染色檢測及結(jié)果判定

將石蠟切片脫蠟、水化，枸櫞酸修復18min（微波高火3min，低火15min），自然冷卻至室溫，3% H2O2室溫孵育20min，山羊血清封閉37℃封閉30min，加一抗（VEGF和CD34一抗稀釋比例分別為1：100和1：50），以滴加PBS代替一抗作陰性對照，4℃過夜；第2d 37℃復溫1h，加生物素標記二抗37℃孵育30min，SABC室溫孵育20min，DAB顯色，蘇木素復染、脫色、返藍、酒精脫水、二甲苯透明、封片。

VEGF蛋白半定量分析方法：所有切片均標號，取不連續(xù)的5張切片，每張切片讀取非連續(xù)的5個視野取值。在200倍視野下，采用Image-Pro Plus（IPP）6.0圖像測量分析軟件測定觀察區(qū)胞漿染為黃色或棕黃色的陽性細胞平均光密度值（Mean Optical Density，MOD），即為VEGF蛋白表達結(jié)果。

CD34+微血管密度計數(shù)：采用Weidner等［13］改良血管計數(shù)法，在200倍視野下觀察，CD34表達以血管內(nèi)皮細胞內(nèi)有淺棕色至深棕色顆粒沉著為標準，由第一作者和另2名經(jīng)過專業(yè)訓練的專業(yè)技術(shù)人員觀察計數(shù)CD34+微血管密度（血管直徑＜20μm或單個陽性細胞且與周圍細胞分界清楚均視為一個新生血管），微血管數(shù)（個／HP）為每個視野下的血管數(shù)。

7 統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

1 白藜蘆醇經(jīng)eNOS降低大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評分

假手術(shù)組所有動物均無神經(jīng)功能障礙（0分），其余各組大鼠麻醉清醒后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損。與I／R組比較，再灌注各時間點I／RB組的神經(jīng)功能缺損癥狀減輕，于再灌注后48h、7d評分明顯減少；側(cè)腦室注射L-NAME后，I／RBL組較I／RB組神經(jīng)功能未見明顯改善（圖1）

2 白藜蘆醇經(jīng)eNOS降低局灶腦缺血／再灌注大鼠大腦皮質(zhì)病理損害

圖1 白藜蘆醇對局灶腦缺血／再灌注大鼠改良神經(jīng)功能缺損評分的影響。a，與I／R比較，0.01＜P＜0.05；b，與I／RBL比較，0.01＜P＜0.05Fig.1 Effect of resveratrol on the score ofmodified neurologic severity in rats with focal cerebral ischemia and reperfusion.a，0.01＜P＜0.05 vs I／R；b，0.01＜P＜0.05 vs I／RBL

HE染色結(jié)果顯示，Sham組神經(jīng)細胞形態(tài)正常，核膜清晰、核仁清晰。再灌注后7d，I／R組缺血皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細胞腫脹、壞死、丟失明顯，殘存細胞多無完整細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，核固縮深染，核仁消失，壞死細胞分布不均。與I／R組比較，I／RB組神經(jīng)細胞存活數(shù)目明顯增多，細胞形態(tài)較I／R組規(guī)則。L-NAME干預后，白藜蘆醇未能有效促進缺血后神經(jīng)細胞存活，I／RBL與I／RB組相比，無明顯差異（圖2）

圖2 白藜蘆醇對局灶腦缺血／再灌注第7天大鼠大腦皮質(zhì)病理損害的影響（HE染色）。A，Sham組；B，I／R組；C，I／RB組；D，I／RBL組；黑色箭頭表示壞死神經(jīng)元；藍色箭頭為相對正常的神經(jīng)細胞；比例，100μmFig.2 Effect of resveratrol on the pathological lesion in rat cerebral cortex at7d after focal cerebral ischemia and reperfusion（HE staining）.A，Sham group；B，I／R group；C，I／RB group；D，I／RBL group；black arrows indicate necrotic neurons；blue arrows indicate normal neurons；scale bar，100μm

3 白藜蘆醇經(jīng)eNOS上調(diào)局灶腦缺血／再灌注大鼠大腦皮質(zhì)eNOS表達

Western blot檢測顯示，Sham組有少量eNOS蛋白表達；I／R、I／RB、I／RBL組eNOS均高于Sham組，與I／R組比較，I／RB組eNOS表達明顯增多；腹腔注射L-NAME后，I／RBL組eNOS表達明顯低于I／RB組（圖3A，圖3B）。

qPCR檢測顯示，eNOSmRNA表達規(guī)律與蛋白表達規(guī)律一致，Sham組表達很弱，I／RB組較I／R明顯減少，L-NAME處理后，白藜蘆醇治療未能有效上調(diào)eNOS表達（圖3C）。

圖3 白藜蘆醇對局灶腦缺血／再灌注大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)eNOS表達的影響。A，eNOS的Western blot檢測；B，Western blot檢測eNOS表達的統(tǒng)計學分析；C，qPCR檢測eNOSmRNA表達的統(tǒng)計學分析；a，與Sham組比較，0.01＜P＜0.05；b，與I／R組比較0.01＜P＜0.05；c，與I／RBL組比較，0.01＜P＜0.05Fig.3 Effect of resveratrol on the expression of eNOS in ischemic rat cerebral cortex after focal cerebral ischemia and reperfusion.A，Western blot detection of eNOS expression；B，statistical analysis of the expression of eNOS detected by Western Blot；C，statistical analysis of the expression of eNOS mRNA detected by qPCR；a，0.01＜P＜0.05 vs Sham；b，0.01＜P＜0.05 vs I／R；c，0.01＜P＜0.05 vs I／RBL.

4 白藜蘆醇經(jīng)eNOS上調(diào)局灶腦缺血／再灌注大鼠大腦皮質(zhì)VEGF水平

免疫組織化學檢測顯示，Sham組大鼠右側(cè)大腦皮質(zhì)VEGF表達水平極低；I／R和I／RB組再灌注后各時間點VEGF水平均顯著高于Sham組，I／RB組各時間點VEGF水平較I／R組增高；在L-NAME阻斷eNOS作用后，I／RBL組VEGF水平低于I／RB組（圖4）。

圖4 白藜蘆醇對局灶腦缺血／再灌注7天大鼠大腦皮質(zhì)VEGF免疫反應性的影響。A-D，Sham（A）、I／R（B）、I／RB（C）和I／RBL（D）大鼠大腦皮質(zhì)VEGF的免疫組織化學檢測；箭頭示VEGF染色陽性細胞；E，VEGF免疫反應性的統(tǒng)計學分析；a，與Sham組比較，0.01＜P＜0.05；b，與I／R組比較，0.01＜P＜0.05；c，與I／RBL組比較，0.01＜P＜0.05；標尺，100μmFig.4 Effect of resveratrol on VEGF immunoreactivity in rat cerebral cortex at 7d after focal cerebral ischemia and reperfusion.A-D，immunohistochemical detection of VEGF in the cerebral cortex of Sham（A），I／R（B），I／RB（C）and I／RBL；E，statistical analysis of VEGF immunoreactivity；a，0.01＜P＜0.05 vs Sham；b，0.01＜P＜0.05 vs I／R；c，0.01＜P＜0.05 vs I／RBL；scale bar，100μm.

5 白藜蘆醇經(jīng)eNOS增加局灶腦缺血／再灌注大鼠大腦皮質(zhì)CD34+微血管密度

免疫組織化學染色顯示，與I／R組比較，再灌注后各時間點I／RB組大腦皮質(zhì)區(qū)CD34+微血管密度顯著增多，eNOS作用被阻斷后，I／RBL組微血管數(shù)目明顯低于I／RB組（圖5）

圖5 白藜蘆醇對局灶腦缺血／再灌注7天大鼠大腦皮質(zhì)CD34+微血管密度的影響。A-D，Sham（A）、I／R（B）、I／RB（C）和I／RBL（D）大鼠大腦皮質(zhì)CD34+微血管的免疫組織化學檢測；箭頭示CD34染色陽性內(nèi)皮細胞；E，CD34+微血管密度的的統(tǒng)計學分析；a，與Sham組比較，0.01＜P＜0.05；b，與I／R組比較，0.01＜P＜0.05；c，與I／RBL組比較，0.01＜P＜0.05；標尺，100μmFig.5 Effect of resveratrol on the density of CD34+microvessels in rat cerebral cortex at7d after focal cerebral ischemia and reperfusion.A-D，immunohistochemical detection of CD34+microvessels in the cerebral cortex of Sham（A），I／R（B），I／RB（C）and I／RBL；E，statisticalanalysis of the density of CD34+microvessels；a，0.01＜P＜0.05 vs Sham；b，0.01＜P＜0.05 vs I／R；c，0.01＜P＜0.05 vs I／RBL；scale bar，100μm.

討 論

卒中是目前威脅人類健康的三大疾病之一，每年全球約550萬人死于卒中［14］。缺血性卒中占卒中的88%［15］，居中國腦血管疾病之首［16］。腦缺血后的血管再生是指通過折疊或芽生方式在原已存在的血管上生成新的血管，缺血狀態(tài)下一般發(fā)生在靠近壞死區(qū)的局部，是成人腦缺血后血管生成最主要的一種方式。白藜蘆醇作為一種植物抗毒素，在缺血后血管再生中的作用日益凸顯。Chen等［17-18］研究證實，白藜蘆醇能夠以原型的形式，經(jīng)被動和主動兩種跨細胞膜轉(zhuǎn)運方式進入內(nèi)皮細胞，主要分布在胞漿中，并長久存在于大鼠動脈壁。楊宵曼等［19］采用體外實驗證實，白藜蘆醇可呈計量依賴性促進大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和體外管腔樣結(jié)構(gòu)形成，促進體外血管再生，該作用可能與eNOS磷酸化相關(guān)。張永強等［20］研究表明，白藜蘆醇可誘導BALB／c小鼠MCAO／R模型腦內(nèi)VEGF早期表達，促進缺血區(qū)域新生血管形成。陸冬曉等［8］發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇治療可提高糖尿病模型大鼠下肢骨骼肌中毛細血管密度，該作用可能與白藜蘆醇促進下肢缺血組織HIF1a及VEGF等促血管生成因子的表達有關(guān)。白藜蘆醇究竟通過何種途徑促進腦內(nèi)血管再生是目前的研究熱點和難點。

研究表明，eNOS在局灶腦缺血后血管再生中發(fā)揮重要作用。缺血缺氧可激活體內(nèi)PI3K／AKT信號轉(zhuǎn)導通路，p-AKT可誘導eNOS活化，促進NO合成，NO上調(diào)cGMP表達，從而松弛血管平滑肌細胞，增加腦血流量，并抑制谷氨酸釋放產(chǎn)生腦保護作用［21］。eNOS還可促進血管平滑肌增殖和遷移，增大腦血管的密度和直徑，促進卒中后的腦側(cè)支循環(huán)建立［22］。VEGF主要由內(nèi)皮細胞分泌，具有促進細胞有絲分裂，血管發(fā)生，增加血管滲透性等作用［23］。研究表明，VEGF可通過Flk-1／PI3-K／AKt作用于血管內(nèi)皮細胞eNOS的Ser1177或Ser1179位點，促進精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣习彼?，同時產(chǎn)生NO［24］。NO可擴張血管，抑制血小板聚集，使之保持高度通透性，并促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移［25-27］，間質(zhì)內(nèi)的NO可致細胞外基質(zhì)成分改變，利于內(nèi)皮細胞遷移及細胞索形成［28］。Fukumura D等［25］研究發(fā)現(xiàn)，NO在VEGF促血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移中起重要作用，而且NO還參與VEGF的促血管通透性的作用。反之，NO也可通過增加VEGF基因啟動子的活性來增加內(nèi)皮細胞合成VEGF，進而促進血管生成。本研究旨在探討白藜蘆醇是否通過介導eNOS、VEGF發(fā)揮腦梗死后的保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可上調(diào)再灌注后48h大腦缺血皮質(zhì)區(qū)eNOS、VEGF表達，降低神經(jīng)功能評分，減輕損傷腦組織病理改變，促進腦內(nèi)血管密度增加。在采用側(cè)腦室注射L-NAME阻斷eNOS作用后，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇刺激未能上調(diào)eNOS、VEGF表達，白藜蘆醇對腦缺血后大鼠的腦保護作用明顯受到抑制，這與Murohara等［29］發(fā)現(xiàn)的eNOS缺如的小鼠VEGF促血管生成作用明顯減弱一致，表明白藜蘆醇可通過介導eNOS的表達，并促進大腦缺血區(qū)的血管再生，發(fā)揮缺血后腦保護作用。同時，亦可看出，eNOS與VEGF在腦缺血后腦內(nèi)的表達具有趨同性。eNOS作用被阻斷后，白藜蘆醇治療未能促進VEGF的表達，神經(jīng)功能恢復較模型組無差異，腦缺血皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的丟失無明顯減少，血管密度無顯著增加，這些均表明抑制eNOS作用后，白藜蘆醇對大鼠腦缺血的保護作用受到明顯抑制，表明eNOS與VEGF在白藜蘆醇促進血管再生中具有協(xié)同作用。

既往關(guān)于白藜蘆醇通過介導eNOS、VEGF表達發(fā)揮缺血后腦保護的研究多見于單獨研究eNOS、VEGF的作用，本研究以白藜蘆醇促進腦損傷恢復的重要條件血管再生為切入點，采用側(cè)腦室注射eNOS抑制劑，檢測eNOS、VEGF表達情況，并同時觀察腦內(nèi)微血管密度變化情況。結(jié)果表明白藜蘆醇促進腦缺血后腦內(nèi)血管再生與eNOS及VEGF的表達上調(diào)有關(guān)，為白藜蘆醇在臨床上治療腦梗死提供了進一步的理論依據(jù)。

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Resveratrol promotes angiogenesis via eNOS in the brains of ratsw ith focal cerebral ischem ia and reperfusion

Li Xingrui，Chen Qing，Sheng Huajun*
（Anatomy Teaching and Research Section of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ObjectiveTo investigate the role of eNOS in the promotion of angiogenesis by resveratrol in the ischemic cerebral cortex of rats after focal cerebral ischemia and reperfusion.M ethods80 healthymale adult Sprague Dawley（SD）rats were randomly divided into 4 groups：the sham group（Sham），modelgroup（I／R），resveratrol group（I／RB）and I／RB plus L-NAME（a specific antagonist of eNOS）group（I／RBL）.The SD ratmodels of focal cerebral ischemia and reperfusion were prepared by the thread embolism method.Resveratrolwas given by intra-peritoneal injection once a day for7 days，the firstat2h after reperfusion.Testswere performed at24h，48h and 7d after reperfusion.The score ofmodified neurological severity was assessed in I／R，I／RB and I／RBL groups，and the pathological change in the structure of the ischemic cerebral cortex was observed by HE staining.The eNOS protein and mRNA were detected by Western Blotand FQ-PCR，respectively，and the expression of VEGF and CD34 was examined by immunohistochemistry.ResultsThe expression of eNOS protein and mRNA and VEGF protein in the ischemic cerebral cortex of rats was significantly higher in I／RB than in I／R atall the three time points，and that in I／RBLwith lateral ventricle injection of L-NAME to block the effect of eNOSwas obviously lower than in I／RB.Moreover，resveratrol treatmentafter occlusion facilitated the recovery of neurological functions，improved the structure of ischemic brain tissue and increased the density of CD34+microvessels.ConclusionResveratrol can promote angiogenesis in the brains of ratswith focal cerebral ischemia and reperfusion to protect ischemic brain tissue by up-regulating the expression of eNOSand VEGF in the ischemic cerebral cortex.

Focal cerebral ischemia and reperfusion；resveratrol；L-NAME；eNOS；VEGF；brain protection

R743

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.06.007

2016-10-10

2016-12-13

李杏芮，女（1987年），漢族，碩士研究生

*通訊作者（To whom correspondence should be addressed）：289986243＠qq.com