體外膜肺氧合對撞擊傷致急性肺損傷細(xì)胞因子表達(dá)影響

佟昌慈，　柳云恩，　張玉彪，　施　琳，　劉　穎，　劉學(xué)磊，　叢培芳，

金紅旭1,2，　高　燕1,2，　侯明曉1,2

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院　1.急診科；2.全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室及

遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護(hù)重點實驗室，遼寧 沈陽　110016

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體外膜肺氧合對撞擊傷致急性肺損傷細(xì)胞因子表達(dá)影響

佟昌慈1,2，柳云恩1,2，張玉彪1,2，施琳1,2，劉穎1,2，劉學(xué)磊1,2，叢培芳1,2，

金紅旭1,2，高燕1,2，侯明曉1,2

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院1.急診科；2.全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室及

遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護(hù)重點實驗室，遼寧 沈陽110016

摘要：目的篩選體外膜肺氧合(ECMO)救治嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷的特異細(xì)胞因子。方法將20只Beagle犬隨機分為正常實驗犬組(對照組)；橡皮彈撞擊至犬肺損傷模型組(模型組)；橡皮彈撞擊至犬肺損傷，機械通氣治療組(機械通氣組)；以及橡皮彈撞擊至犬肺損傷，ECMO治療組(ECMO組)。解剖取肺組織提取總蛋白質(zhì)并應(yīng)用蛋白芯片檢測篩選差異表達(dá)的細(xì)胞因子。結(jié)果在檢測的20個細(xì)胞因子中，與對照組比較，模型組細(xì)胞因子白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、干細(xì)胞因子(SCF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、肝細(xì)胞生長因子R(HGF-R)、白介素-1β(IL-1β)、主要內(nèi)在蛋白-1β(MIP-1β)和腫瘤壞死因子RIB(TNF-RIB)表達(dá)均增高；機械通氣組和ECMO組治療后上述各細(xì)胞因子表達(dá)均較治療前降低，且ECMO組差異更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；糖基化終末產(chǎn)物特異性受體(RAGE)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子-7(FGF-7)和白介素-12p40(IL-12p40)表達(dá)趨勢相反；4組集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-17A(IL-17A)表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；促紅細(xì)胞生成素(EPO)和干擾素-γ(IFN-γ)無表達(dá)。結(jié)論ECMO治療可改善重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷引起的炎癥反應(yīng)，為研究ECMO治療重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷的分子機制提供方向和靶點。

關(guān)鍵詞：急性肺損傷；體外膜肺氧合；機械通氣；蛋白芯片

車禍、礦山爆破以及墜落等撞擊導(dǎo)致的急性肺損傷是致病和死亡的主要因素，嚴(yán)重影響患者的生存率，其治療方法之一為機械通氣，若方法不當(dāng)則可加重病情[1]。體外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation,ECMO)是一種將體內(nèi)靜脈血引流到體外，通過膜肺氧合后變?yōu)閯用}血后，由驅(qū)動泵輸送回體內(nèi)的心肺輔助技術(shù)，這種技術(shù)可以減輕呼吸和(或)循環(huán)衰竭患者的心肺負(fù)擔(dān)，減緩患者心肺損傷的病情發(fā)展，延長患者生存時間[2-5]。雖然ECMO的臨床研究及應(yīng)用已有多年，但是ECMO在治療嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷分子機制研究較少。

蛋白質(zhì)組學(xué)是用于分析細(xì)胞、組織或體液中蛋白質(zhì)整體定性定量的研究方法，從蛋白整體水平上研究分析細(xì)胞或組織的蛋白質(zhì)及其相互作用關(guān)系。同時，蛋白質(zhì)組學(xué)分析也可以為未知分子機制的研究提供研究方向和靶點[6-8]。蛋白芯片技術(shù)是研究蛋白質(zhì)組學(xué)的有效技術(shù)之一。本研究利用蛋白芯片技術(shù)分析篩選ECMO治療嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷可能的分子機制。

1資料與方法

1.1實驗動物及分組20只成年健康Beagle犬，體質(zhì)量30～34 kg，隨機分為4組：對照組(n=5)；模型組(n=5)，橡皮彈撞擊至犬肺損傷模型；機械通氣組(n=5)，橡皮彈撞擊至犬肺損傷模型，采用機械通氣治療；ECMO治療組(n=5)，橡皮彈撞擊至犬肺損傷模型，采用ECMO治療。所有實驗犬均購自于沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心，在沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心飼養(yǎng)，食物及水由動物實驗中心提供。

1.2橡皮彈撞擊至犬肺損傷模型建立實驗犬標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)2周，術(shù)前12 h禁食不禁水，固定于實驗架上，常溫條件下18.4 mm橡皮彈5 m距離致胸部創(chuàng)傷。橡皮彈全彈重18.47～19.23 g、飛行彈重8.31～8.72 g、彈丸最大直徑18.16～18.83 mm、彈速106～125 m/s、動能(E)59.73 J、比動能(Es)21.69 J/cm2。

1.3機械通氣治療實驗犬30 mg/kg戊巴比妥鈉靜脈注射，麻醉后固定，仰臥在手術(shù)臺上。F6.0～F8.0氣管導(dǎo)管插入并連接呼吸機，呼吸頻率15次/min，F(xiàn)iO2為40%，氧濃度1.00%，潮氣量20 ml/kg。游離右側(cè)股動脈，采集動脈血標(biāo)本，肝素化置管后連接多道生理信號采集處理系統(tǒng)。游離左側(cè)股靜脈，置管連接三通，連接輸液裝置。氣管插管和Y型管之間連接雙向流量壓力傳感裝置，連接多道生理信號采集處理系統(tǒng)，測量氣道壓力和流量的改變。在整個實驗過程中注意麻醉深度，適時適量追加戊巴比妥鈉，0.03%的司可林維持實驗犬肌松，自主呼吸消失為準(zhǔn)。

1.4ECMO治療術(shù)前1 mg阿托品腹腔注射，30 mg/kg戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉實驗犬至睫反射消失，固定于手術(shù)臺上。F6.0～F8.0氣管插管，連接簡易呼吸器、氧氣罐和氮氣罐，維持實驗犬的呼吸，調(diào)節(jié)氮氣、氧氣的濃度比以降低吸入的氧氣濃度，將置入的熱稀釋導(dǎo)管與有創(chuàng)動脈血氧飽和度監(jiān)測儀和多功能監(jiān)護(hù)儀連結(jié)。游離雙側(cè)股動脈、股靜脈及右側(cè)頸靜脈，采用股靜脈—頸靜脈ECMO模式，實驗犬的股靜脈插管和頸內(nèi)靜脈插管與ECMO系統(tǒng)相連，按右股靜脈-儲血器-滾壓泵-氧合器-右頸內(nèi)靜脈的順序連接。激活全血凝固時間(ACT)維持在140～200 s。體外循環(huán)開始時，膜肺氣血比調(diào)至1∶1，氧合器清掃氣流為純氧，流量2～4 L/min。從心排量所能達(dá)到的最大值為體外循環(huán)血量開始，轉(zhuǎn)流建立后，給予無氧呼吸(全氮氣)。維持動脈血氧飽和度(SaO2)在90%時的體外循環(huán)血流量。

1.5肺組織標(biāo)本采集動物實驗結(jié)束后，利用股動脈放血法處死實驗犬，無菌條件下，迅速打開胸腔，右肺門結(jié)扎，取出肺組織。取肺上葉分成若干個小部分，放入常規(guī)消毒處理后的EP管中，迅速放入液氮罐中，保存于-80℃低溫冰箱。

1.6總蛋白提取將凍存在液氮中的肺組織取出后融化，每50～100 mg組織加入0.5 ml組織裂解液，制備成組織勻漿，4 ℃，12 000 r/min離心20 min后，取上層蛋白溶液于新EP管中。

1.7蛋白芯片檢測取實驗犬肺組織提取全蛋白溶液，采用QAC-CYT-1及QAC-CYT-2蛋白芯片(匯佰生物科技有限公司)，檢測細(xì)胞因子的表達(dá)。

2結(jié)果

2.1蛋白芯片篩選細(xì)胞因子白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、干細(xì)胞因子(SCF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、肝細(xì)胞生長因子R(HGF-R)、白介素-1β(IL-1β)、主要內(nèi)在蛋白-1β(MIP-1β)和腫瘤壞死因子RIB(TNF-RIB)的表達(dá)量，模型組明顯高于對照組；與模型組比較，機械通氣組和ECMO組有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ECMO組與機械通氣組比較，下降幅度更大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。糖基化終末產(chǎn)物特異性受體(RAGE)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子-7(FGF-7)和白介素-12p40(IL-12p40)的表達(dá)量，模型組低于對照組；與模型組比較，機械通氣組和ECMO治療組有一定量的上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與機械通氣組比較，ECMO治療組上升幅度更大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；4組集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-17A(IL-17A)的表達(dá)量無明顯變化；促紅細(xì)胞生成素(EPO)和干擾素-γ(IFN-γ)無表達(dá)。見表1。

2.2蛋白相互關(guān)系檢索通過String Database基因/蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系檢索工具，分析差異表達(dá)的蛋白之間的相互作用關(guān)系。見圖1。

±s,pg/ml)

注：與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與機械通氣組比較，③P<0.05

圖1　蛋白芯片顯示差異表達(dá)蛋白相互作用

3討論

急性肺損傷引起的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是致病和死亡的主要因素，嚴(yán)重影響患者的生存率。目前，治療急性肺損傷和ARDS的方法之一為機械通氣，但呼吸機的使用不當(dāng)反而導(dǎo)致肺損傷及炎癥反應(yīng)的加重[1]。ECMO技術(shù)將體內(nèi)靜脈血引流到體外，利用膜肺代替肺功能，氧合血液、排出二氧化碳，將靜脈血變?yōu)閯用}血后再輸送回體內(nèi)，在一定程度上可以代替損傷的肺行使功能，以減輕肺的負(fù)擔(dān)，有利于肺功能的恢復(fù)，緩解機體缺氧狀態(tài)，減緩患者傷勢發(fā)展[2-5]。但是ECMO治療并不適合所有患者，有研究表明，ECMO技術(shù)對于提高急性肺損傷患者的生存率并沒有明顯優(yōu)勢[9]。因此，研究ECMO治療嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷的分子機制具有重要意義。

對于分子機制的研究，經(jīng)典的分子生物學(xué)技術(shù)只能對其中的一種或幾種蛋白進(jìn)行研究，而不能從蛋白整體水平上分析細(xì)胞或組織。蛋白質(zhì)組學(xué)是用于分析細(xì)胞、組織或體液中蛋白質(zhì)整體定性定量的研究方法，使分析整體蛋白質(zhì)及其相互作用關(guān)系成為可能。另外，對于未知分子機制的研究，蛋白質(zhì)組學(xué)分析也可以提供研究方向和靶點[6-8]。蛋白芯片技術(shù)是研究蛋白質(zhì)組學(xué)的有效技術(shù)之一，在本研究中，我們利用蛋白芯片技術(shù)分析篩選ECMO治療嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷可能的分子機制。蛋白芯片檢測細(xì)胞因子的表達(dá)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，在20個細(xì)胞因子中，有15個表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。多項炎癥因子的差異表達(dá)表明，ECMO治療重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷的可能分子機制是抑制炎癥反應(yīng)，同時為其深入研究提供多個指標(biāo)。通過String Data base基因/蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系檢索工具分析15個差異表達(dá)的蛋白之間的相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)多個蛋白之間形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，這表明重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致的急性肺損傷引起的炎癥反應(yīng)是一個復(fù)雜的過程。

通過蛋白芯片技術(shù)初步篩選ECMO治療重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷過程中表達(dá)改變的蛋白因子，為研究其機制提供可能的研究方向，同時篩選可能的臨床檢測指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1]周成斌,張鏡芳,章曉華,等.體外膜肺氧合對急性肺損傷犬血漿粘附分子的影響[J].中國體外循環(huán)雜志,2007,5(1):35-38.

[2]Abrams D,Combes A,Brodie D.Extracorporeal membrane oxygenation in cardiopulmonary disease in adults[J].J Am Coll Cardiol,2014,63(25 Pt A):2769-2778.

[3]Le Guen M,Parquin F.The place of extra-corporeal oxygenation in pulmonary diseases[J].Rev Mal Respir,2015,32(4):358-369.

[4]Michaels AJ,Hill JG,Sperley BP,et al.Use of HFPV for adults with ARDS:the protocolized use of high-frequency percussive ventilation for adults with acute respiratory failure treated with extracorporeal membrane oxygenation[J].ASAIO J,2015,61(3):345-349.

[5]Katsuhara K,Nakada TA,Yamada M,et al.Veno-venous extracorporeal membrane oxygenation(ECMO)for acute respiratory failure caused by liver abscess[J].J Artif Organs,2015,18(2):173-176.

[6]Stunnenberg HG,Hubner NC.Genomics meets proteomics:identifying the culprits in disease[J].Hum Genet,2014,133(6):689-700.

[8]Abel L,Kutschki S,Turewicz M,et al.Autoimmune profiling with protein microarrays in clinical applications[J].Biochim Biophys Acta,2014,1844(5):977-987.

[9]Mols G,Loop T,Geiger K,et al.Extracorporeal membrane oxygenation:a ten-year experience[J].Am J Surg,2000,180(2):144-154.

·體外膜肺氧合·

第一作者：佟昌慈(1988-)，女，遼寧撫順人，技師，碩士

Effect of extracorporeal membrane oxygenation on the expression of cytokines in acute lung injury induced by impact injury

TONG Chang-ci，LIU Yun-en，ZHANG Yu-biao，SHI Lin，LIU Ying，LIU Xue-lie，CONG Pei-fang，JIN Hong-xu，GAO Yan，HOU Ming-xiao(Department of Emergency Medicine,and Laboratory of PLA Wound and Trauma Center,The General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the specific cytokines in the acute lung injury caused by severe trauma with the treatment of extracorporeal membrane oxygenation(ECMO).MethodsTwenty beagle dogs were randomly divided into 4 groups:normal control group,model group,mechanical ventilation treatment group,and ECMO treatment group.Rubber bullets hit to the canine model of lung injury.To extract total protein of the lung tissue,proteinchip assayed and screened differentially expressed cytokines.ResultsIn the detection of the 20 cytokines,compared with the control group,IL-2,IL-6,IL-8,IL-10,MCP-1,SCF,HGF and HGF R,IL-1B,MIP-1βand TNF RI B of model group,expressed increasingly,which decreased after mechanical ventilation and ECMO treatment,and the difference of ECMO treatment was more obvious.The expression tendency of VEGF,FGF-7 and IL-12p40 were opposite.The expression of GM-CSF,TNF alpha and IL-17A had no significant difference.EPO and IFNγhad no expression.ConclusionECMO treatment can improve the inflammatory response caused by severe trauma induced acute lung injury,and provide direction and target for the subsequent study of molecular mechanism of the acute lung injury caused by severe trauma with the treatment of ECMO.

Key words:Acute lung injury;Extracorporeal membrane oxygenation;Mechanical ventilation;Protein chip

收稿日期：2015-08-30

DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2016.01.02

文章編號：2095-5561(2016)01-0006-04

中圖分類號：R563.9；R654.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

通信作者：侯明曉，E-mail:houmingxiao188@163.com

基金項目：2012年遼寧省科技攻關(guān)(201122007)；2012年全軍“十二五”面上項目(CSY12J002)；2013年全軍“十二五”面上延續(xù)項目(CSY13J003)