不同人工真皮支架對Ⅲ度燒傷創(chuàng)面修復(fù)中組織TGF-β1和細胞凋亡的影響

田代雄

(湖北省恩施州中心醫(yī)院燒傷整形科，湖北 恩施　445000)

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不同人工真皮支架對Ⅲ度燒傷創(chuàng)面修復(fù)中組織TGF-β1和細胞凋亡的影響

田代雄

(湖北省恩施州中心醫(yī)院燒傷整形科，湖北 恩施445000)

摘要：目的探討不同人工真皮支架對Ⅲ度燒傷創(chuàng)面修復(fù)中組織TGF-β1和細胞凋亡的影響。方法隨機將12只實驗動物分成2組每組6只，A組為膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架組；B組為負載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架組。C組為在A、B兩組中各取3只豬，在背部制備同2組相同的燒傷創(chuàng)面，只植入硅橡膠膜。比較3組間創(chuàng)面修復(fù)情況，創(chuàng)面中表達α-SMA、TGF-β1的情況以及細胞凋亡數(shù)。結(jié)果B組負載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架與創(chuàng)面的整合和恢復(fù)均較好于A、C組。1～3周3組創(chuàng)面α-SMA表達陽性的血管逐漸增多。C組在1～4周內(nèi)α-SMA表達陽性的血管數(shù)均顯著少于A、B組(P<0.05)。B組在1～3周內(nèi)α-SMA表達陽性的血管數(shù)均顯著多于A組(P<0.05)。第2周3組創(chuàng)面TGF-β1陽性信號數(shù)比第1周顯著增多。植皮后A、B組創(chuàng)面TGF-β1陽性信號數(shù)均有降低。A、B兩組創(chuàng)面TGF-β1陽性信號數(shù)均成先上升后下降的趨勢，其中2周TGF-β1陽性信號數(shù)表達最高。C組3、4周創(chuàng)面TGF-β1陽性信號數(shù)均顯著多于A、B組(P<0.05)。1～4周，3組創(chuàng)面的細胞凋亡數(shù)逐漸增加。在不同時一間點，A組與B組的細胞凋亡數(shù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較，均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在不同時一間點，C組的細胞凋亡數(shù)均顯著少于A、B組(P<0.05)。結(jié)論負載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架在Ⅲ度燒傷創(chuàng)中可促進血管生成，有效抑制創(chuàng)面收縮同時促進細胞凋亡，減少瘢痕的增生。

關(guān)鍵詞:人工真皮支架；創(chuàng)面修復(fù)；TGF-β1；細胞凋亡

燒傷造成大面積組織暴露于外部環(huán)境，易造成肢體感染甚至功能喪失[1]。每年我國有100余萬人因燒傷需進行皮膚缺損的救治[2]。自體皮膚移植目前仍然是治療皮膚缺損的首選方法[3]。然而對于大面積燒傷患者存在供皮不足的問題。隨著材料學(xué)、再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，已有模擬人體皮膚的人工真皮支架[4]。本研究考察負載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架和膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架在Ⅲ度燒傷創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用效果?，F(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1材料實驗動物：廣西巴馬小香豬12只，雌性，體質(zhì)量(10±2)kg。主要材料：膠原—磺化羧甲基殼聚糖/硅橡膠雙層人工皮膚(三維多孔結(jié)構(gòu)，孔徑80～500 μm，厚度2 mm，直徑3.2 cm，孔隙率>90%)。VEGF DNA質(zhì)粒(購自第四軍醫(yī)大學(xué))，醫(yī)用級硅橡膠薄膜；α-SMA(α-平滑肌肌動蛋白)單克隆抗體；TGF-β1(細胞表達轉(zhuǎn)化生長因子)單克隆抗體；SP免疫組化檢測試劑盒。

1.2方法分組：隨機將12只豬分成2組每組6只，A組為膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架組；B組為負載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架組。每只豬于背部行Ⅲ度燒傷創(chuàng)面模型制作[5-8](速眠新Ⅱ肌肉注射和3%戊巴比妥腹腔注射復(fù)合麻醉。將溫度為100℃、直徑2.5 cm的銅塊在豬背部兩側(cè)距離后正中線3～ 4 cm處恒溫恒壓持續(xù)70 s，造成Ⅲ度燒傷。每次制備2～4個創(chuàng)面，每次常規(guī)清創(chuàng)后聚維酮碘包扎。每日換藥一次)。C組：在A、B兩組中各取3只豬，在背部制備同2組相同的燒傷創(chuàng)面，只植入硅橡膠膜。

取材：對3組在不同支架移植術(shù)后1、2、3周打開內(nèi)層敷料，揭下硅橡膠膜，觀察創(chuàng)面，在創(chuàng)面中間切取大小為0.5 cm×0.5 cm深至肌層的組織塊，每組每個時間點12孔。

表皮移植：剪大小為(0.5～0.6)cm ×(0.5～0.6)cm的豬刃厚皮，置于0.2%胰酶緩沖液中，37℃下消化1.2 h,將表皮從組織剝離下來。在植入支架2周后，揭下硅橡膠膜，植入分離的表皮，常規(guī)加壓固定。2周后進行創(chuàng)面組織學(xué)研究。

免疫組織化學(xué)檢驗：對不同時間點，3組每12個標本其中6個進行α-SMA陽性檢測(SP法，一抗?jié)舛葹?∶200，PBS為陰性對照。陽性信號為棕色或黃色)；另6個標本進行TGF-β1檢測(TGF-β1一抗?jié)舛葹?∶200，二甲氨偶氮苯(DAB) 顯色，陽性信號為棕黃色)。均在400×光鏡下隨機觀察10個視野，陽性主要在血管和創(chuàng)面肌成纖維細胞漿表達，對表達陽性信號進行計數(shù)。

TUNEL檢測(組織細胞凋亡檢測)：按檢測試劑盒步驟操作(反應(yīng)液中不加TdT酶為陰性對照，陽性信號為棕色或黃色，在細胞核表達)。標本觀察同免疫組織化學(xué)檢驗光鏡觀察。

2結(jié)果

2.1創(chuàng)面觀察1～3周，B組創(chuàng)面由黃白色未血管化基本轉(zhuǎn)為紅潤色；A組創(chuàng)面由黃白色未血管化轉(zhuǎn)為紅潤色，但仍有部分未血管化的黃白色真皮支架；C組燒傷面由較多分泌物轉(zhuǎn)為少量分泌，創(chuàng)面粗糙。總之，在不同時間點，B組負載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化梭甲基殼聚糖人工真皮支架與創(chuàng)面的整合和恢復(fù)均較好于A、C組。

2.23組創(chuàng)面α-SMA陽性信號表達情況3組創(chuàng)面的α-SMA陽性信號表達見圖1。在不同人工支架植入2周后，A組可見血管和肌成纖維細胞的生成；B組血管表達量多于A組，肌成纖維細胞表達少于A組；C組血管表達量較A、B組少，肌成纖維細胞表達多于A和B組。

圖1　3組創(chuàng)面2周后α-SMA陽性信號

由表1、圖2可知，1～3周3組創(chuàng)面α-SMA表達陽性的血管逐漸增多。C組在1～4周內(nèi)α-SMA表達陽性的血管數(shù)均顯著少于A、B組(P<0.05)。第4周B組α-SMA表達陽性的血管數(shù)與A組無顯著差異(P>0.05)。B組在1～3周內(nèi)α-SMA表達陽性的血管數(shù)均顯著多于A組(P<0.05)。

2.33組創(chuàng)面TGF-β1陽性信號表達情況比較由表2、圖3可知，第2周3組創(chuàng)面TGF-β1陽性信號表達數(shù)比第1周顯著增多。植皮后A、B組創(chuàng)面TGF-β1陽性信號表達數(shù)均有降低。A、B兩組創(chuàng)面TGF-β1陽性信號表達數(shù)均成先上升后下降的趨勢，其中2周TGF-β1陽性信號表達數(shù)最高。兩組各周時間點下，創(chuàng)面TGF-β1陽性信號表達數(shù)無顯著差異(P>0.05)。C組3、4周創(chuàng)面TGF-β1陽性信號表達數(shù)均顯著多于A、B組(P<0.05)。

2.43組創(chuàng)面細胞凋亡比較由表3、圖4可知，1～4周，3組創(chuàng)面的細胞凋亡數(shù)逐漸增加。在不同時間點，A組與B組的細胞凋亡數(shù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較，均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在不同時間點，C組的細胞凋亡數(shù)均顯著少于A、B組(P<0.05)。

組別1周2周3周4周A組14.6±2.7#22.4±2.8#37.5±3.1#26.4±2.6#B組24.3±3.1*35.2±4.1*40.2±4.6*26.3±2.4C組4.7±2.111.6±3.318.6±2.815.8±3.5

注：*與A、C組相比，P<0.05；#與C組相比，P<0.05。

組別1周2周3周4周A組166.4±17.3203.5±24.8#129.2±30.167.4±15.3B組185.1±9.5228.5±23.4#110.6±28.255.8±11.4C組98.5±18.5*149.6±18.3*#202.4±13.6*170.3±21.2*

注：*與A、B組相比，P<0.05；#與1周相比，P<0.05。

組別1周2周3周4周A組3.5±2.717.8±4.6a52.3±6.6b79.2±16.2cB組4.2±2.219.3±5.1a55.5±7.4b79.4±17.1cC組3.2±2.2*5.3±2.7*10.8±4.5*18.5±3.6*

注：*與A、B組相比，P<0.05；a與1周相比，P<0.05；b與1周相比，P<0.05；c與1周相比，P<0.05。

3討論

每年有很多人因為燒傷造成皮膚缺損。皮膚缺損對患者的生活甚至生命健康帶來很大的影響[8]。目前，自體皮膚移植仍然是治療皮膚缺損的首選方法。臨床治療過程中往往存在供體不足的情況。近年來材料學(xué)、再生醫(yī)學(xué)的進步，已有模擬人體皮膚的人工真皮支架[9]。然而，人工真皮支架能否與創(chuàng)傷面的完美整合一直是研究的熱點。VEGF可促進血管內(nèi)皮細胞增殖和新血管的生成。據(jù)報道[10-11]，負載VEGF的人工真皮支架能催進血管的形成，有利于與創(chuàng)面的整合。本研究考察負載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架和膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架在Ⅲ度燒傷創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用效果。

通過檢測α-SMA陽性表達可判斷新生血管的成熟水平。因為α-SMA是新生血管的標志物，主要在血管和創(chuàng)面肌成纖維細胞漿中表達。研究發(fā)現(xiàn)，1～3周3組創(chuàng)面α-SMA表達陽性的血管逐漸增多。C組在1～4周內(nèi)α-SMA表達陽性的血管數(shù)均顯著少于A、B組(P<0.05)。第4周B組α-SMA表達陽性的血管數(shù)與A組無顯著差異(P>0.05)。B組在1～3周內(nèi)α-SMA表達陽性的血管數(shù)均顯著多于A組(P<0.05)。結(jié)合創(chuàng)面狀態(tài)觀察，B組創(chuàng)面由黃白色未血管化基本轉(zhuǎn)為紅潤色；A組創(chuàng)面由黃白色未血管化轉(zhuǎn)為紅潤色，但仍有部分未血管化的黃白色真皮支架；C組燒傷面由較多分泌物轉(zhuǎn)為少量分泌，創(chuàng)面粗糙。說明負載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架誘導(dǎo)血管的生成，催進了膠原的產(chǎn)生，與創(chuàng)面整合度較高，可維持3周。

實驗中植入2周3組創(chuàng)面TGF-β1陽性信號數(shù)比第1周顯著增多。植皮后A、B組創(chuàng)面TGF-β1陽性信號數(shù)均有降低。A、B兩組創(chuàng)面TGF-β1陽性信號數(shù)均成先上升后下降的趨勢，其中2周TGF-β1陽性信號數(shù)表達最高。兩組各周時間點下，創(chuàng)面TGF-β1陽性信號數(shù)無顯著差異(P>0.05)。C組3、4周創(chuàng)面TGF-β1陽性信號數(shù)均顯著多于A、B組(P<0.05)。VEGF誘導(dǎo)血管化促進了TGF-β1的表達。然而，TGF-β1與創(chuàng)面修復(fù)和瘢痕的增生密切相關(guān)的細胞因子。既可促進成纖維細胞合成膠原，有利于創(chuàng)面的修復(fù)，同時也可以通過調(diào)控膠原、蛋白多糖等細胞外基質(zhì)沉積，促使瘢痕生成[12-13]。1～2周表達較高，催進了纖維細胞的合成，創(chuàng)面的恢復(fù)。3～4周表達降低，降低了膠原的沉積，減少了瘢痕的增生。

通過TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)，1～4周3組創(chuàng)面的細胞凋亡數(shù)逐漸增加。在不同時間點，A組與B組的細胞凋亡數(shù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較，均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在不同時間點，C組的細胞凋亡數(shù)均顯著少于A、B組(P<0.05)。有報道稱[14-15]，細胞的凋亡同樣是抑制瘢痕增生和收縮的主要原因。說明支架組早期伴隨著細胞的增殖，同時出現(xiàn)了大批血管內(nèi)皮細胞的凋亡，從而減少了瘢痕的增生。

綜上所述，負載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架在Ⅲ度燒傷創(chuàng)中可促進血管生成，有效抑制創(chuàng)面收縮同時促進細胞凋亡，減少瘢痕的增生。

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Effect of different artificial dermal stents on the TGF- beta 1

and apoptosis in the tissue of third degree burn wounds

TIAN Dai-xiong

(DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,EnshiCentralHospital,Enshi，Hubei445000,China)

Abstract:Objective To investigate the effect of different artificial dermal stents on the TGF- beta 1 and apoptosis in the tissue of third degree burn wounds.Methods Twelve pigs were randamized into 2 groups with 6 in each group, group A for collagen sulfonated carboxymethyl chitosan artificial dermal stent group and group B for artificial dermal stent of collagen sulfonated carboxymethyl chitosan encoded with VEGF DNA plasmid group. Three pigs from group A and group B respectively were assigned in group C with the same burn wounds on the back as in group A and B, implanted with only silicone rubber membranes. We compared the wound healing among the 3 groups, including the expression of α-SMA, TGF-β1 and apoptosis. Results The artificial dermal stent and wound healing in group B were better than those in group A and group C.During week 1 and 3, α-SMA positive vessels gradually increased in all three groups. The number of blood vessels in group C was significantly fewer than that in group A and B in 1～4 weeks, and the number of blood vessels in group B was significantly more than that in group A in 1～3 weeks (P<0.05).The number of TGF- beta 1 positive signal in the 3rd week was significantly increased more than that in the first week. TGF- beta 1 positive signals were reduced in both group A and B after skin grafting. The number of TGF- beta 1 positive signal in both group A and B tended to decrease after its increase, which reached the highest in the second week.The number of positive signals of TGF- beta 1 in group C at 3 and 4 weeks was significantly more than that in group A and B (P<0.05). During 1～4 week, the number of apoptotic cells in the 3 groups increased gradually. There was no significant difference in apoptosis at different time between group A and group B (P>0.05), while the number of apoptotic cells in group C was significantly lower than that in group A or group B(P<0.05). Conclusions Artificial dermal stent of collagen sulfonated carboxymethyl chitosan encoded with VEGF DNA plasmid for III degree burn wound can promote angiogenesis, inhibit wound contraction, promote cell apoptosis and reduce scar hyperplasia.

Key words:artificial dermal stent;wound repair;TGF- beta 1;apoptosis

收稿日期：(2015-08-17，修回日期：2015-10-23)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.024