肝細(xì)胞癌組織中IL-18BPc和VEGF的表達(dá)及與腫瘤血管形成的關(guān)系

查翔遠(yuǎn)，翟群超，吳建成，宋有良，吳同生，葉珍珠，汪澤華

(銅陵市人民醫(yī)院1.感染科；2.內(nèi)分泌科，安徽 銅陵　244000；

3.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，江蘇 蘇州　215006)

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肝細(xì)胞癌組織中IL-18BPc和VEGF的表達(dá)及與腫瘤血管形成的關(guān)系

查翔遠(yuǎn)1，翟群超2，吳建成3，宋有良1，吳同生1，葉珍珠1，汪澤華1

(銅陵市人民醫(yī)院1.感染科；2.內(nèi)分泌科，安徽 銅陵244000；

3.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，江蘇 蘇州215006)

摘要：目的探討IL-18BPc和VEGF在原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其與腫瘤血管形成之間的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測IL-18BPc和VEGF在34例肝細(xì)胞癌組織、34例癌旁肝組織及12例正常肝組織的表達(dá)，通過CD34免疫組織化學(xué)染色評價腫瘤組織MVD值，分析IL-18BPc表達(dá)與VEGF表達(dá)及MVD的關(guān)系。結(jié)果IL-18BPc在肝癌組織中的表達(dá)陽性率高于癌旁肝組織(P<0.01)及正常肝組織(P<0.01)，且肝癌出現(xiàn)侵襲轉(zhuǎn)移者較未出現(xiàn)侵襲轉(zhuǎn)移者其IL-18BPc表達(dá)陽性率高(P<0.01)；VEGF在肝癌組織中的表達(dá)高于癌旁肝組織(P<0.01)及正常肝組織(P<0.01)；IL-18BPc和VEGF在肝細(xì)胞癌中表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.357,P=0.037)；肝癌組織MVD值與高于癌旁肝組織(P<0.01)及正常肝組織(P<0.01)；肝癌組織中， IL-18BPc陽性表達(dá)者M(jìn)VD值高于陰性表達(dá)者(P=0.004)。結(jié)論IL-18BPc可能通過上調(diào)VEGF的表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌血管形成。

關(guān)鍵詞:肝細(xì)胞癌；血管生成；白介素-18；結(jié)合蛋白；血管內(nèi)皮生長因子；微血管密度；免疫組織化學(xué)

Expression of IL-18BPc and VEGF in hepatocellular carcinoma

and its relationship with tumor angiogenesis

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常見的惡性腫瘤之一，約占國內(nèi)全部癌癥發(fā)病率的10%。惡性腫瘤最顯著的特點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞的失控性生長及異常血管增生。HCC易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，血管形成是其生長、浸潤及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。近年研究提示白介素-18(interleukin-18，IL-18)具有抑制腫瘤作用[1-3]，而其內(nèi)源性抑制物白介素-18結(jié)合蛋白(interleukin-18 binding protein, IL-18BP)通過活化VEGF/Akt信號途徑和促進(jìn)骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞(BM-EPCS)的動員和分化刺激新生血管生成[4]。IL-18BP基因至少編碼4種不同的同型體[5]，IL-18BPc是有生物學(xué)活性的IL-18BP之一。本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測HCC組織中IL-18BPc、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表達(dá)情況，根據(jù)CD34染色的血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)腫瘤微血管密度(microvessel density, MVD)，分析IL-18BPc表達(dá)與VEGF表達(dá)及MVD的關(guān)系，旨在探討IL-18BPc在HCC血管形成中的作用。

1材料與方法

1.1研究對象收集2004年9月至2007年9月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的HCC患者34例，所有患者術(shù)前均未行放療或化療。其中男25例，女9例，年齡23～61歲，平均年齡為42.8歲。留取34例患者HCC組織及配對癌旁肝組織(距離腫塊邊緣≥2 cm處肝組織)標(biāo)本，正常肝組織12例取材于同期膽囊結(jié)石手術(shù)患者。

1.2試劑來源兔抗人IL-18BPC-C多克隆抗體由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科實(shí)驗(yàn)室通過IL-18BPC-C端多肽免疫新西蘭兔制備，兔抗人VEGF多克隆抗體購于武漢博士德生物公司，鼠抗人CD34單克隆抗體購于北京中山生物技術(shù)公司，即用型SP試劑盒(抗鼠/兔)、DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3方法采用免疫組織化學(xué)法(SP法)，DAB顯色，蘇木精對比染色。一抗IL-18BPc、VEGF、CD34工作液濃度分別為1∶500、1∶100、1∶100；陽性對照采用試劑公司提供的陽性石蠟切或預(yù)試驗(yàn)陽性標(biāo)本，陰性對照以PBS代替一抗。染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4IL-18BPc及VEGF陽性結(jié)果判定免疫反應(yīng)陽性染色主要位于胞質(zhì)中，呈棕黃色或棕褐色顆粒。采用半定量積分法判斷陽性結(jié)果[6]：于200倍鏡下隨機(jī)選擇3個視野，根據(jù)每張切片的陽性細(xì)胞百分率及著色強(qiáng)度計(jì)分:著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率<33.3%計(jì)1分，33.3%～66.7%計(jì)2分，>66.7%計(jì)3分；著色強(qiáng)度：基本不著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。計(jì)算每張切片著色細(xì)胞百分率得分和著色強(qiáng)度乘積(取3個視野的平均值)，按其最后得分判斷：≤1分為陰性(-)，>2分為陽性(+)。

1.5MVD計(jì)數(shù)單個或成簇血管內(nèi)皮細(xì)胞染成棕色或棕黃色即為CD34陽性染色。參考文獻(xiàn)[7]的方法，先低倍鏡下掃查整個切片，尋找血管高密度區(qū)。再在×200倍視野下，取5個高倍視野內(nèi)的微血管數(shù)的平均值為MVD值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。率等計(jì)數(shù)資料的組間比較的比較，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料比較為one way ANOVA檢驗(yàn)，兩兩組間比較為LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1IL-18BPc、VEGF在肝癌組織、癌旁肝組織及正常肝組織中的表達(dá)情況IL-18BPc陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒，位于胞質(zhì)(圖1)。IL-18BPc在肝癌組織、癌旁肝組織及正常肝組織中表達(dá)陽性率分別為85.3%(29/34)、38.2%(13/34)及0(0/12)。IL-18BPc在肝癌組織中表達(dá)高于癌旁及正常肝組織(P<0.01)。IL-18BPc在癌組織中、癌旁肝組織及正常肝臟組織中表達(dá)的半定量評分值分別為(4.0±1.6)、(1.6±1.3)及(0.5±0.5)，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且三組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

VEGF陽性呈棕黃色顆粒，位于胞質(zhì)(圖2)。VEGF在肝癌、癌旁肝組織及正常肝組織中表達(dá)陽性率分別為76.5%(26/34)、32.4%(11/34)和16.7%(2/12)。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，VEGF在肝癌組織中表達(dá)高于癌旁肝組織及正常肝組織(P均<0.01)。

2.2肝癌組織、癌旁肝組織及正常肝組織中MVD情況34例肝癌組織及癌旁組織MVD值分別為(50.3±11.1)/200倍視野(圖3)和 (13.8±6.0)/200倍視野，正常肝組織中無CD34陽性表達(dá)。肝癌組織中MVD值明顯高于癌旁肝組織及正常肝組織(P均<0.01)。

2.3HCC癌組織中IL-18BPc與MVD之間關(guān)系HCC癌組織中，IL-18BPc陽性表達(dá)者及IL-18BPc陰性表達(dá)者M(jìn)VD值分別為(52.4±10.4)/200倍視野和(37.9±6.7)/200倍視野，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。

2.4HCC癌組織中IL-18BPc與VEGF表達(dá)之間關(guān)系HCC癌組織中IL-18BPc表達(dá)與VEGF表達(dá)行Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，顯示IL-18BPc與VEGF之間呈正相關(guān)(r=0.357,P=0.037)。

2.5IL-18BPc表達(dá)與HCC臨床參數(shù)間的關(guān)系HCC組織中IL-18BPc表達(dá)與腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)(P=0.006)，而與患者年齡、性別、腫瘤大小、AFP值的高低、伴肝硬化或乙肝表面抗原陽性與否及腫瘤分化情況無關(guān)，見表1。

表1　IL-18BPc表達(dá)與HCC臨床病理特征之間的關(guān)系

注:*Fisher’s 確切概率法。

圖1　IL-18BPc在HCC癌組織中表達(dá)(免疫組化×200)

圖2　VEGF在HCC癌組織中表達(dá)(免疫組化×200)

圖3　CD34在HCC癌組織中表達(dá)(免疫組化×100)

3討論

目前認(rèn)為，IL-18不但在誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ方面發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[8]，在腫瘤免疫及抗血管生成中也有重要影響[9]。動物實(shí)驗(yàn)顯示IL-18可抑制HepG2肝癌裸鼠皮下移植瘤形成及轉(zhuǎn)移[10]，應(yīng)用表達(dá)IL-18的鼠傷寒桿菌減毒株在鼠腫瘤模型中顯示出明顯的抗腫瘤活性[11]，外源性給予IL-18處理的腫瘤表現(xiàn)出血管生成低下，微血管密度減少，提示IL-18有抗血管生成的作用[12]。

作為IL-18的內(nèi)源性抑制物，研究顯示用IFN-γ處理的前列腺癌細(xì)胞可分泌IL-18BP以中和IL-18的抗腫瘤效應(yīng)[13]，有學(xué)者認(rèn)為腫瘤細(xì)胞分泌IL-18BP增加在于試圖逃避免疫監(jiān)視[14]；原發(fā)性肝癌患者血清IL-18BP濃度明顯高于肝硬化患者，隨著肝癌進(jìn)展，其濃度增高，血清IL-18BP水平明顯增高可能與肝癌患者免疫功能低下及更晚的腫瘤分期有關(guān)[15]；楊漢正等[16]報道肝癌癌周組織及癌組織大量表達(dá)IL-18BP，提示IL-18BP有促進(jìn)腫瘤生長的作用。本研究通過免疫組化法檢測HCC組織中IL-18BPc表達(dá)情況，結(jié)果顯示IL-18BPc在HCC癌組織中表達(dá)陽性率明顯高于癌旁肝組織及正常肝組織，且發(fā)生腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的HCC癌組織IL-18BPc表達(dá)陽性率明顯高于未發(fā)生腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的HCC癌組織，提示IL-18BPc表達(dá)可能與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)HCC組織中IL-18BPc表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、AFP值的高低、伴肝硬化或乙肝表面抗原陽性與否及腫瘤分化情況無關(guān)。

VEGF是一種具有生物功能的血管源性肽，包括調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)的重塑和炎性細(xì)胞因子的再生，被認(rèn)為是刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖最重要的細(xì)胞因子之一[17]，也是肝細(xì)胞癌重要的腫瘤標(biāo)記物[18]。VEGF相關(guān)信號傳導(dǎo)通路由VEGF超家族、VEGF受體及其他信號蛋白和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子組成，VEGF通過與其受體結(jié)合，使受體磷酸化激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)血管生成作用，對細(xì)胞惡變、腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移起調(diào)控作用[19]。本研究顯示，VEGF在HCC癌組織中表達(dá)陽性率也明顯高于癌旁肝組織及正常肝組織，且HCC癌組織中IL-18BPc和VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，提示IL-18BPc可能通過上調(diào)VEGF的表達(dá)促進(jìn)HCC血管形成，從而參與調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。

CD34作為腫瘤新生血管標(biāo)志物，在包括肝細(xì)胞癌[7]、骨惡性腫瘤[20]在內(nèi)多種腫瘤組織中小血管都有表達(dá)。本研究顯示，CD34在肝癌組織及癌旁組織中呈均有表達(dá)，而在正常肝組織中呈陰性。肝癌組織中MVD計(jì)數(shù)明顯高于癌旁肝組織及正常肝組織，且肝癌組織中IL-18BPc陽性表達(dá)者M(jìn)VD計(jì)數(shù)明顯高于IL-18BPc陰性表達(dá)者，進(jìn)一步提示IL-18BPc的表達(dá)可能促進(jìn)肝癌新生血管形成。

綜合以上情況，我們認(rèn)為IL-18BPc可能通過上調(diào)VEGF的表達(dá)促進(jìn)肝癌血管形成，影響腫瘤的生長和侵襲轉(zhuǎn)移；另一方面與IL-18結(jié)合，抑制其發(fā)揮抗腫瘤及抗血管生成活性，且下調(diào)IFN-γ表達(dá)，促進(jìn)腫瘤生長。當(dāng)然，原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移并不是單一因素所致，而IL-18BPc可能是影響HCC血管形成的因素之一，但其確切的作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

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ZHA Xiang-yuan1, ZHAI Qun-chao2, WU Jian-cheng3, et al

(1.DepartmentofInfectiousDiseases;2.DepantmentofEndocrinology,TonglingPeople'sHospital,

Tongling244000,China;3.DepartmentofInfectiousDiseases，

TheFirstHospitalAffiliatedtoSuzhouUniversity，Suzhou245006，China)

Abstract:Objective To detect IL-18BPc and VEGF expression in hepatocellular carcinoma (HCC) and to investigate the relationship of this expression with tumor angiogenesis.Methods IL-18BPc and vascular endothelial growth factor (VEGF) expressions in 34 specimens of HCC, 34 specimens of adjacent non-tumorous liver tissue, and 12 specimens of normal liver tissue were detected by immunohistochemistry. Microvessel density (MVD) was determined by labeling the vascular endothelial cells with cluster of differentiation 34(CD34). Correlation between the expression of IL-18BPc and VEGF in HCC tissue was analysed. Results The expression of IL-18BPc protein in HCC tissue was significantly higher than that in adjacent non-tumorous liver tissue(P<0.01) and normal liver tissue(P<0.01), moreover, this expression was related to tumor metastasis in HCC. The expressions of VEGF protein and CD34 in PHC tissue were significantly higher than those in adjacent non-tumorous liver tissue(P<0.01) and normal liver tissue(P<0.01). IL-18BPc expression in HCC tissue was positively correlated with VEGF expression(r=0.357,P=0.037). MVD of specimens with IL-18BPc positive expression was significantly higher than those with IL-18BPc negative expression in HCC tissue(P=0.004). Conclusions IL-18BPc possibly promotes tumor angiogenesis through upregulation of VEGF expression in HCC.

Key words:hepatocellular carcinoma;angiogenesis;interleukin-18 binding protein;VEGF;MVD;immunohistochemistry

收稿日期：(2015-10-12，修回日期：2015-12-07)

通信作者:吳建成，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向:病毒性肝炎的基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail: xywjc370@126.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.023