3D打印PLA-HA復(fù)合材料構(gòu)建組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究

張海峰　杜子婧　毛曦媛　趙丹陽(yáng)　杜朝　姜聞博　韓冬

200011,　　上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科(張海峰、杜子婧、毛曦媛、趙丹陽(yáng)、杜朝、韓冬)；200011,　　上海市骨科內(nèi)置物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(張海峰)；200240，　　上海交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院(姜聞博)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

3D打印PLA-HA復(fù)合材料構(gòu)建組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究

張海峰杜子婧毛曦媛趙丹陽(yáng)杜朝姜聞博韓冬

200011,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科(張海峰、杜子婧、毛曦媛、趙丹陽(yáng)、杜朝、韓冬)；200011,上海市骨科內(nèi)置物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(張海峰)；200240，上海交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院(姜聞博)

【摘要】目的探討并觀察3D打印聚乳酸(PLA)-羥基磷灰石(HA)復(fù)合支架材料在體內(nèi)成骨的可行性。方法將骨髓基質(zhì)細(xì)胞與3D打印PLA-HA復(fù)合材料進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，通過(guò)掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架材料上的生長(zhǎng)黏附情況。選擇成年新西蘭大白兔單側(cè)脛骨內(nèi)側(cè)建立體內(nèi)生物反應(yīng)器模型，分離隱動(dòng)、靜脈血管束，并剝離脛骨內(nèi)側(cè)骨膜，將游離的動(dòng)靜脈血管束完全穿越支架材料內(nèi)部并固定于脛骨骨膜囊內(nèi)，此種方法構(gòu)建的組織工程骨為實(shí)驗(yàn)組；單純將復(fù)合骨髓基質(zhì)細(xì)胞的3D打印PLA-HA復(fù)合材料回植于脛骨內(nèi)側(cè)骨膜囊內(nèi)，此種方法構(gòu)建的組織工程骨為對(duì)照組。術(shù)后6周取材，分別采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)骨分化相關(guān)基因，并進(jìn)行顯微CT三維重建及骨形態(tài)計(jì)量分析、HE染色組織學(xué)觀察。結(jié)果骨髓基質(zhì)細(xì)胞能在3D打印PLA-HA復(fù)合材料上黏附生長(zhǎng)。定量PCR檢測(cè)成骨分化基因OPN及COLⅠ的表達(dá)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組OPN及COLⅠ相對(duì)表達(dá)量分別為8.0333±0.5820和7.5452±0.5608；對(duì)照組OPN及COLⅠ相對(duì)表達(dá)量分別為5.7248±0.9975和4.0173±0.2654，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。顯微CT掃描顯示，實(shí)驗(yàn)組新生骨組織體積及骨小梁相對(duì)數(shù)目較對(duì)照組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組織學(xué)觀察可見實(shí)驗(yàn)組有新生骨組織形成，部分新生骨組織為編織骨，骨細(xì)胞體積大、數(shù)量多，呈編織狀排列，骨細(xì)胞分化成熟；對(duì)照組可見部分新生骨樣組織形成，骨細(xì)胞分化較成熟。結(jié)論以骨髓基質(zhì)細(xì)胞為種子細(xì)胞，3D打印PLA-HA復(fù)合材料為支架，復(fù)合隱動(dòng)、靜脈血管束及自體骨膜，在體內(nèi)能構(gòu)建出功能相對(duì)完善的組織工程骨；3D打印PLA-HA復(fù)合材料可作為骨組織工程中支架材料。

【關(guān)鍵詞】3D打??；體內(nèi)生物反應(yīng)器；骨組織工程；聚乳酸；羥基磷灰石

Experimental reserarch of constructing tissue engineered bone using three-dimensional printed polylactic acid-hydroxyapatite composite scaffoldsZHANGHai-feng1,2,DUZi-jing1,MAOXi-yuan1,ZHAODan-yang1,DUChao1,JIANGWen-bo3,HANDong1.

DepartmentofPlasticandReconstructiveSurgery,ShanghaiNinthPeople’sHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine1,Shanghai200011,China;ShanghaiKeyLaboratoryofOrthopaedicImplants2,Shanghai200011,China;ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMaterialsScienceandEngineering3,Shanghai200240,China

Correspondingauthor:HANDongE-mail:handong12000@163.com

【Abstract】ObjectiveTo explore the feasibility of constructing the tissue engineered bone using three-dimensional (3D) printed polylactic acid-hydroxyapatite (PLA-HA) composite scaffolds. Methods Bone marrow stromal cells (BMSCs) were seeded on 3D printed PLA-HA composite scaffolds, then they were cultured in vitro. The BMSCs of growing morphology and adhesion were observed with the scanning electron microscopy. An animal model of vivo bioreactor on adult New Zealand rabbits inside the unilateral tibial was established. Then saphenous arteriovenous blood bundles were fully free and dissected, and the tibial upper periosteum was isolated. The vascular bundle crossed through the central channel of scaffolds and was fixed with a suture under the periosteum capsule. Using the above way to construct bioreactor in vivo was marked experimental group, and only 3D printed PLA-HA scaffolds combined with autologous BMSCs transplanted to tibial periosteum without blood vessel was designated as control group. In the postoperative 6 weeks, quantitative statistics of osteogenic related genes in real-time reverse transcription polymerase chain reaction (PCR) method, 3D reconstructions as well as bone morphology measurement and analysis in micro-Computed Tomography (micro-CT), histological examination stained with hematoxylin and eosin (HE) were evaluated, respectively. Results BMSCs had fine adhesion capability in 3D printed PLA-HA composite scaffolds. Osteopontin (OPN) and collagen type Ⅰ (COLⅠ) were expressed in both groups by PCR measurement. The relative levels of expression of OPN and COLⅠ in the experimental group were 8.0333±0.5820 and 7.5452±0.5608, and they were 5.7248±0.9975 and 4.0173±0.2654 in the control group. There existed significant differences between two groups (P<0.05). The outcomes from micro-CT analysis revealed that the amount of newly formed bone volume and bone trabecula in experimental group and it in control group had significant differences (P<0.05). Histological examination in experimental group showed that there were newly formed bone, and partial newborn bone arrayed into woven bone accompanied with the mature bone cell differentiation. In the control group, newly formed bone had the less mature cell differentiation. Conclusion This experimental study shows that the combination of BMSCs, 3D printed PLA-HA scaffolds, vascular pedicle implantation and autogenous periosteum to construct the bioreactor in vivo can achieve fully functional tissue engineered bone. Meanwhile, 3D printed PLA-HA composite scaffolds could be selected as biomaterials in bone tissue engineering.

【Key words】Three-dimensional printing； In vivo bioreactor； Bone tissue engineering； Polylactic acid； Hydroxyapatite

由創(chuàng)傷、腫瘤、感染和先天性畸形等原因造成的骨缺損，尤其是大塊骨缺損的修復(fù)和功能重建一直是整復(fù)外科及骨科醫(yī)生面臨的難題。目前常用的自體骨移植、異體骨移植、異種骨移植、人工合成替代物移植等治療方式在不同程度上存在一定問(wèn)題[1-2]。近年來(lái)，體內(nèi)生物反應(yīng)器研究的不斷深入以及3D打印技術(shù)的快速發(fā)展為解決個(gè)性化骨缺損修復(fù)提供了新方法[3-5]，其中3D打印支架材料在體內(nèi)生物反應(yīng)器的成骨研究是骨組織工程中的重要部分。本研究采用體外細(xì)胞復(fù)合材料法及體內(nèi)植入法研究3D打印的聚乳酸 (PLA)-羥基磷灰石(HA)復(fù)合材料在體內(nèi)生物反應(yīng)器這一特定環(huán)境中的成骨情況，目的是探索3D打印PLA-HA復(fù)合材料在骨組織工程領(lǐng)域中的成骨性能，為修復(fù)大塊骨缺損奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為材料改良提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年新西蘭大耳白兔8只，雄性，體重(2.5±0.2)kg，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

材料：HA(上海積碩材料科技有限公司)；PLA(山東濟(jì)南岱罡生物工程有限公司)；Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM 培養(yǎng)基，美國(guó) Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó) HyClone公司)；HE染色試劑盒(南京建成生物制品有限公司)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀器(美國(guó)Applied Biosystems公司)；光學(xué)顯微鏡(日本 OLYMPUS公司)；顯微攝影數(shù)碼相機(jī)(美國(guó) KODAK公司)；掃描電鏡(美國(guó) Quanta公司)；顯微CT (瑞士SCANCO MEDICAL AG公司)。

1.2制備3D打印PLA-HA復(fù)合材料

先利用三維計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(CAD)軟件設(shè)計(jì)支架材料。材料大小為直徑5 mm、高度 6 mm的中空?qǐng)A柱體，同時(shí)將材料屬性設(shè)置為孔徑500 μm、孔隙率60%。將設(shè)計(jì)完成的材料使用CAD軟件轉(zhuǎn)換成STL格式并輸入3D打印機(jī)。調(diào)整3D打印機(jī)相關(guān)屬性參數(shù)進(jìn)行打印材料，本實(shí)驗(yàn)選用的3D打印技術(shù)是在熔融沉積造型術(shù)(FDM)基礎(chǔ)上選用生物擠壓方法進(jìn)行打印生物復(fù)合材料PLA-HA[6-7]。最后，清除及修整多余的支撐材料，完成整個(gè)生物支架的打印(圖1)。

圖1　3D打印PLA-HA材料

1.3細(xì)胞體外復(fù)合培養(yǎng)

1.3.1骨髓基質(zhì)細(xì)胞分離、培養(yǎng)與傳代

選取健康成年新西蘭大白兔，50 mL注射器針頭于一側(cè)脛骨平臺(tái)穿刺抽取骨髓液2～3 mL，加入肝素化50 mL無(wú)菌離心管內(nèi)。將骨髓與20 mL含10%胎牛血清和雙抗DMEM培養(yǎng)基(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL)混勻，接種于10 cm的培養(yǎng)皿中。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。每隔3日半量換液，9 d后完全換液，以后每日換液1次。待原代培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底面積90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，按1∶3接種在新的10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)。傳至第三代進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.2支架材料與骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外復(fù)合培養(yǎng)

對(duì)傳至第三代的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并以5×104個(gè)/mL制成細(xì)胞懸液于24孔板內(nèi)接種至3D打印PLA-HA復(fù)合材料，于不同時(shí)間進(jìn)行處理，用于觀察及檢測(cè)。

1.4建立體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

健康成年新西蘭大白兔以質(zhì)量百分比為3%的戊巴比妥鈉(20 mg/kg)行耳緣靜脈注射，用質(zhì)量百分比為5%的氯胺酮(50 mg/kg)行肌肉注射麻醉，兔脛骨周邊常規(guī)備皮，消毒鋪巾。于雙側(cè)脛骨上端作一S形切口，長(zhǎng)度約4.0 cm，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)仔細(xì)解剖相應(yīng)隱動(dòng)、靜脈血管束，顯微鏡下充分游離遠(yuǎn)近端血管束(圖2a)，同時(shí)行隱動(dòng)、靜脈血管束遠(yuǎn)端結(jié)扎備用。在脛骨外側(cè)弧形切開骨膜邊緣，剝離脛骨內(nèi)側(cè)骨膜備用(圖2b)。取復(fù)合骨髓基質(zhì)細(xì)胞的PLA-HA支架材料置入骨膜下，并將骨膜塑成圓柱形，游離隱動(dòng)、靜脈血管束并從支架材料正中穿過(guò)，5-0顯微縫線將骨膜游離緣密閉縫合，形成一密閉的腔室，構(gòu)建體內(nèi)生物反應(yīng)器，再將骨膜與周圍組織加強(qiáng)縫合固定，最后逐層關(guān)閉創(chuàng)口(圖2c)，此種方法構(gòu)建的組織工程骨為實(shí)驗(yàn)組；動(dòng)物對(duì)側(cè)脛骨內(nèi)側(cè)行弧形切開骨膜邊緣，分離大骨膜，將復(fù)合骨髓基質(zhì)細(xì)胞的PLA-HA支架材料置入骨膜囊內(nèi)，縫合骨膜及皮膚，此為對(duì)照組。術(shù)后肌肉注射青霉素80萬(wàn)單位/次，每日2次，持續(xù)3 d。術(shù)后第6周取材，進(jìn)行檢測(cè)。

1.5檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1光學(xué)顯微鏡觀察

每日使用倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及細(xì)胞與支架材料復(fù)合培養(yǎng)情況。

1.5.2掃描電鏡觀察

分別于各時(shí)間點(diǎn)將復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)的支架材料取出，2%戊二醛固定，梯度酒精脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥，表面噴金后進(jìn)行觀察。

1.5.3一般情況及大體觀察

術(shù)后觀察新西蘭大白兔飲食、飲水、活動(dòng)及切口反應(yīng)等情況。

1.5.4成骨分化相關(guān)基因檢測(cè)

圖2a分離新西蘭兔隱動(dòng)、靜脈血管束，同時(shí)將血管貫穿材料內(nèi)部

圖2b　新西蘭兔脛骨骨膜分離備用

圖2c　體內(nèi)生物反應(yīng)器構(gòu)建完成

1.5.5顯微CT掃描

術(shù)后第6周處死動(dòng)物，取脛骨內(nèi)側(cè)標(biāo)本用4%甲醛溶液固定。待其固定48 h后，將所有標(biāo)本連續(xù)顯微CT掃描2 h，進(jìn)行三維重建掃描并采用圖像分析系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行形態(tài)計(jì)量學(xué)分析。

1.5.6組織學(xué)觀察

將脛骨內(nèi)側(cè)標(biāo)本用4%甲醛溶液固定后，脫鈣、石蠟包埋、切片，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.6統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所測(cè)數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1體外復(fù)合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

2.1.1光學(xué)顯微鏡觀察

原代培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞24 h后細(xì)胞開始貼壁，48 h后大量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈短小梭形或多角形，排列不規(guī)則；培養(yǎng)1周左右，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速并互相融成集落，呈旋渦狀排列(圖3)。普通光學(xué)顯微鏡下可見細(xì)胞在材料孔隙內(nèi)生長(zhǎng)狀態(tài)良好，部分細(xì)胞直接貼附于材料周邊生長(zhǎng)，未見細(xì)胞衰老及異常分裂現(xiàn)象。

圖3　光學(xué)顯微鏡下觀察骨髓基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況 (×40)

2.1.2掃描電鏡觀察

骨髓基質(zhì)細(xì)胞于3D打印PLA-HA材料上復(fù)合培養(yǎng)第6天，掃描電鏡下可見骨髓基質(zhì)細(xì)胞緊密黏附于PLA-HA支架材料表面，細(xì)胞向支架材料孔隙四周伸出偽足，分泌的細(xì)胞外基質(zhì)包繞于細(xì)胞周圍，部分細(xì)胞間偽足相互接觸融合(圖4)。

圖4掃描電鏡下觀察骨髓基質(zhì)細(xì)胞在3D打印PLA-HA材料上的黏附情況(×600)

2.2體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)

2.2.1大體觀察

全部動(dòng)物存活，無(wú)異常死亡。切口均干燥、無(wú)分泌物，未見明顯感染。

2.2.2定量PCR檢測(cè)結(jié)果

定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在各時(shí)間段均有陽(yáng)性表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組成骨分化基因OPN及COLⅠ表達(dá)量較對(duì)照組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

)

*與實(shí)驗(yàn)組比較，P<0.05

2.2.3顯微CT三維重建結(jié)果

顯微CT三維重建結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組骨密度、組織微結(jié)構(gòu)存有一定差異(圖5a、b)。骨組織微結(jié)構(gòu)參數(shù)顯示，實(shí)驗(yàn)組新生骨組織體積(BV)、骨組織體積比(BV/TV)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)均大于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

圖5a　顯微CT三維重建觀察實(shí)驗(yàn)組新生骨情況

圖5b　顯微CT三維重建觀察對(duì)照組新生骨情況

2.2.4組織學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)組經(jīng)HE染色可見有新生骨組織形成，骨陷窩細(xì)胞存在，骨小梁相互連接成網(wǎng)；部分新生骨組織為編織骨，骨細(xì)胞體積大，數(shù)量多，呈編織狀排列；骨細(xì)胞分化成熟；新生骨組織內(nèi)部及周邊可見微小血管生成(圖6a)。對(duì)照組經(jīng)HE染色可見部分新生骨樣組織形成，骨小梁較細(xì)，分離度增大，骨細(xì)胞分化較成熟(圖6b)。

圖6a　術(shù)后實(shí)驗(yàn)組組織學(xué)觀察(×40)

圖6b　術(shù)后對(duì)照組組織學(xué)觀察(×40)

組別BV/mm3BV/TV/%Tb.N/mm-1Tb.Sp/mm實(shí)驗(yàn)組4.7152±0.04460.2548±0.00012.0063±0.01210.5056±0.0565對(duì)照組3.7841±0.0606*0.2045±0.0020*1.8308±0.0550*0.4475±0.0779*

* 與實(shí)驗(yàn)組比較，P<0.05

3 討論

3.13D打印技術(shù)概述

3D 打印也稱增材制造技術(shù)，是一種以數(shù)字模型為基礎(chǔ)，在計(jì)算機(jī)控制下，通過(guò)多層次連續(xù)疊加的方式最終堆積成完整實(shí)物的技術(shù)[8-9]。目前隨著3D打印技術(shù)的逐步發(fā)展，其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)展，其中包括個(gè)性化組織缺損修復(fù)、復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確定位和三維重建、復(fù)雜手術(shù)方案制定及醫(yī)療教學(xué)等方面[10-13]。近年來(lái)，越來(lái)越多的個(gè)性化生物打印材料應(yīng)用于人體疾病診斷與治療，并取得滿意的臨床效果[14-15]。在3D打印技術(shù)的輔助下，在制備生物支架材料過(guò)程中可實(shí)現(xiàn)材料孔徑、孔隙率、貫通性調(diào)控，同時(shí)具備精度高及可重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，這為組織工程領(lǐng)域支架材料的研究提供新的思路和方法，同時(shí)也為臨床上選擇合適材料提供技術(shù)支持[16]。

3.23D打印PLA-HA復(fù)合材料的優(yōu)勢(shì)

PLA-HA復(fù)合材料是骨組織工程中常用的生物支架材料[17]。PLA是一種具備優(yōu)良生物相容性、較高力學(xué)強(qiáng)度和生物降解性的聚合物，其強(qiáng)度和剛度同時(shí)也具有可衰減性，然而它的生物活性較弱[18-19]。HA具備良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，能為骨細(xì)胞黏附生長(zhǎng)提供良好環(huán)境，有助于新骨的形成和生長(zhǎng)，同時(shí)可提高材料韌性，滿足一定的力學(xué)強(qiáng)度要求，但由于缺乏足夠的強(qiáng)度和疲勞承受能力，不適合作為結(jié)構(gòu)材料使用[20]。以PLA為基質(zhì)、HA為生物加強(qiáng)相，通過(guò)3D打印技術(shù)制備的PLA-HA復(fù)合支架材料具有良好的生物相容性、合適的強(qiáng)度和韌性，是一種較理想的新型支架材料[21]。實(shí)驗(yàn)中所選取的3D打印PLA-HA復(fù)合材料的孔徑為500 μm，孔隙率為60%，其材料結(jié)構(gòu)可促進(jìn)組織工程中新生骨及新生血管生成[22]。

3.3體內(nèi)生物反應(yīng)器的選擇

近年來(lái)，骨組織工程的發(fā)展仍面臨著新生骨組織難以修復(fù)大塊骨缺損的問(wèn)題。體內(nèi)生物反應(yīng)器能在一定程度上促進(jìn)組織工程骨的生長(zhǎng)，提高新生骨組織質(zhì)量及數(shù)量，這為解決骨組織工程中的難題提供了良好的借鑒方法[23-24]。體內(nèi)生物反應(yīng)器是在體內(nèi)創(chuàng)造一個(gè)特定的空間如骨膜下、肌肉、腹膜腔等，利用生物體自身潛能再生所需的組織結(jié)構(gòu)來(lái)修復(fù)相應(yīng)的組織缺損。研究[25-26]表明，為進(jìn)一步促進(jìn)新生骨的再生速度以滿足大塊骨缺損修復(fù)的需要，加入知名血管束作為構(gòu)建組織工程骨血管來(lái)源是十分關(guān)鍵的步驟。許多研究[27]表明，骨膜內(nèi)富含成骨細(xì)胞和骨祖細(xì)胞，具有較強(qiáng)的成骨能力，可再生與之功能相適應(yīng)的骨組織結(jié)構(gòu)。部分由骨膜所構(gòu)成的體內(nèi)生物反應(yīng)器在促進(jìn)新生骨再生方面具備難以比擬的優(yōu)勢(shì)[28]。而在機(jī)體可利用的血管束中，隱動(dòng)、靜脈血管束解剖位置恒定、表淺，也是非主要功能性血管，因此利用隱血管束作為組織工程骨血管的來(lái)源，既不會(huì)對(duì)機(jī)體運(yùn)動(dòng)功能造成損傷，又可滿足在體內(nèi)構(gòu)建血管化組織工程骨的需要。前期研究[23-24]表明，利用隱動(dòng)、靜脈血管束構(gòu)建的體內(nèi)生物反應(yīng)器能促進(jìn)功能良好的新生骨組織生長(zhǎng)。

3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

目前很多生物材料已在體內(nèi)生物反應(yīng)器內(nèi)得到探索及應(yīng)用，然而3D打印復(fù)合材料在體內(nèi)生物反應(yīng)器內(nèi)的研究較少。研究特定環(huán)境中3D打印材料的成骨性能，能為3D打印PLA-HA復(fù)合材料在骨組織工程中的支架研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究中，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞在3D打印PLA-HA復(fù)合材料上生長(zhǎng)狀態(tài)良好，可見此種材料具備優(yōu)良的細(xì)胞相容性；體內(nèi)研究表明實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組術(shù)后在一定時(shí)間內(nèi)切口均未出現(xiàn)明顯感染，同時(shí)均有新生骨組織出現(xiàn)，這在一定程度上表明支架材料在體內(nèi)具備較好的組織相容性。為進(jìn)一步研究3D打印PLA-HA復(fù)合材料在體內(nèi)生物反應(yīng)器內(nèi)的成骨性能，實(shí)驗(yàn)中選取結(jié)果可靠的骨膜下構(gòu)建組織工程骨為對(duì)照，在實(shí)驗(yàn)組中加入知名血管束構(gòu)建體內(nèi)生物反應(yīng)器，結(jié)果提示其較對(duì)照組明顯促進(jìn)新生骨生長(zhǎng)速度，這與體內(nèi)生物反應(yīng)器所提供的特定成骨微環(huán)境及血管促進(jìn)成骨作用密不可分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3D打印PLA-HA復(fù)合材料在具備良好生物相容性的基礎(chǔ)上，能在體內(nèi)生物反應(yīng)器內(nèi)促進(jìn)新生骨生長(zhǎng)，這為3D打印PLA-HA復(fù)合材料修復(fù)大塊骨缺損奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

由上可見，3D打印PLA-HA復(fù)合材料能在體內(nèi)生物反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建性能較好的組織工程骨，其可作為骨髓基質(zhì)細(xì)胞載體進(jìn)一步應(yīng)用于骨組織工程相關(guān)研究中。然而，3D打印材料仍存在諸如3D打印材料后期成骨性能、降解速度及生物力學(xué)性能有待研究；改良其孔徑及孔隙率能否進(jìn)一步促進(jìn)骨組織新生；植入體內(nèi)的3D打印復(fù)合材料與新生血管的具體關(guān)系；隨著3D打印技術(shù)第三階段的到來(lái)，其能否實(shí)現(xiàn)與種子細(xì)胞的同步打印，促進(jìn)組織工程新領(lǐng)域的擴(kuò)展等問(wèn)題。相信不久的將來(lái)，這些問(wèn)題都會(huì)得到解決。

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(收稿：：2015-11-16; 修回：2015-12-08)

(本文編輯：盧千語(yǔ))

DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.01.013

通信作者：韓冬E-mail: handong12000@163.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(81272132)