不孕婦女乙肝病毒感染者的卵巢儲備功能研究

柳榴，劉倩，文妍琪，楊菁

(武漢大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，武漢　430060)

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不孕婦女乙肝病毒感染者的卵巢儲備功能研究

柳榴，劉倩，文妍琪，楊菁*

(武漢大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，武漢430060)

【摘要】目的評價乙型肝炎病毒(HBV)感染及HBV-DNA高拷貝數(shù)的不孕婦女的卵巢儲備功能。方法回顧性分析來院進行體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)治療的505例不孕患者，根據(jù)血清HBsAg是否陽性及HBV-DNA滴度將實驗對象分為3組：血清HBsAg(-)為A組；血清HBsAg(+)，HBV-DNA<500 IU/ml 為B組；HBsAg(+)，HBV-DNA≥500 IU/ml 為C組。評估3組患者的基本情況，并以血清基礎FSH、LH、E2水平和AFC等為指標，分析比較HBV感染狀態(tài)與卵巢儲備功能的關系。結果(1)HBV-DNA陽性率(滴度≥500 IU/ml)在HBV感染的不孕婦女中為48.60%，平均 HBV-DNA拷貝數(shù)為5.86×104 IU/ml(5×102～1.28×109 IU/ml)；(2)與A組相比，C組患者中AFC<6的發(fā)生率更高(9.62% vs. 2.06%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且C組患者在卵巢儲備功能低下(AFC<6)的不孕婦女群體中所占的比例顯著高于在卵巢儲備功能正常(AFC≥6)的不孕婦女群體中所占的比例(45.4% vs. 19.5%，P<0.05)，而A組患者在卵巢儲備功能低下的不孕婦女群體中所占的比例明顯低于在卵巢儲備功能正常的不孕婦女群體中所占的比例(27.3% vs. 59.0%，P<0.05)，B組則在兩個群體所占的比例無顯著差異(27.3% vs. 21.5%，P>0.05)；(3)多元邏輯回歸分析顯示，與A組相比，C組卵巢儲備功能低下的風險更高[OR 3.689，95% CI (1.043，13.048)](P<0.05)。結論在HBV感染的婦女中，HBV-DNA高拷貝數(shù)可能是卵巢儲備功能低下的高危因素，其可能會影響不孕女性的卵巢儲備功能。

【關鍵詞】HBV；HBV-DNA；不孕；卵巢儲備功能

(JReprodMed2016，25(1)：27-31)

卵巢儲備功能是指卵巢皮質區(qū)卵泡生長發(fā)育形成可受精卵母細胞的能力，通常包括兩方面：卵巢內(nèi)存留卵泡數(shù)和卵母細胞的質量，它能夠綜合的反映女性的生育能力[1]。評估女性卵巢儲備功能通常所用的指標有：年齡、基礎血清卵泡刺激素(FSH)水平、基礎血清雌激素(E2)水平、基礎 FSH/黃體生成激素(LH)比值(FSH/LH)、卵巢體積、基礎竇卵泡數(shù)(AFC)及卵巢基質收縮期血流、抗苗勒管激素(AMH)等[2]。一般認為，當FSH>10 U/L、E2>294 pmol/L、FSH/LH>3、AFC<6時均意味著卵巢儲備功能低下[3-4]。且目前認為，基礎竇卵泡與基礎性激素、各種刺激試驗相比更能有效評估卵巢儲備功能[2]。

HBV作為一種噬肝性病毒，除了存在于肝細胞，還存在于生殖性腺，如卵巢間質細胞、卵母細胞、睪丸等肝外組織，并可通過生殖細胞垂直傳播[5]。近年來，在接受輔助生殖技術(ART)治療的夫妻中發(fā)現(xiàn)HBV感染的患者越來越多。已有研究報道HBV能夠感染精子，進而影響精子的質量和功能[6-7]。然而對于HBV是否能夠影響卵巢的儲備功能，目前的研究尚無明確結論。針對這一問題，本研究對進行不孕治療的女性HBV陽性患者與陰性患者比較，旨在探討女性HBV感染狀態(tài)與卵巢儲備功能的關系。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2012年4月至2014年12月在武漢大學人民醫(yī)院生殖中心進行IVF/ICSI-ET治療的不孕婦女。

納入/排除標準：年齡≤38歲，無子宮內(nèi)膜異位癥史和卵巢手術史，且排除HCV、HIV和梅毒陽性者。

二、病毒檢測及卵巢儲備功能參數(shù)檢測回顧

患者在進行IVF/ICSI-ET治療前，均常規(guī)篩查術前病毒全套。對于血清HBsAg陽性的患者再常規(guī)進行HBV-DNA檢測，HBV-DNA滴度≥500 IU/ml為陽性；有效期為12個月。進入治療周期后，常規(guī)于月經(jīng)第2天或第3天采血做性激素全套檢測，并測量AFC。

檢測方法：采用電化學發(fā)光法檢測乙肝表面免疫標志物，儀器為ROCHE全自動化學發(fā)光免疫分析儀(型號Cobas e601)，試劑為ROCHE儀器配套試劑盒；采用熒光定量PCR (fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR) 法檢測血清HBV-DNA，儀器為ROCHE實時熒光定量PCR儀(型號LC480)，PCR試劑盒購自上海復興生物技術有限公司，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

三、分組及資料收集

根據(jù)血清HBV檢查結果分組：(1)HBV(-)組：血清HBsAg陰性(A組，n=291)；(2)HBV(+)HBV-DNA(-)組：血清HBsAg陽性，HBV-DNA<500 IU/ml(B組，n=110)；(3)HBV(+)HBV-DNA(+)組：血清HBsAg陽性，HBV-DNA≥500 IU/ml(C組，n=104)。

收集的基本資料包括：年齡、體重指數(shù)(BMI)、不孕時間、不孕類型(原發(fā)/繼發(fā))、病毒篩查結果、基礎血清FSH、LH和E2水平及B超下AFC值。

四、統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，計數(shù)資料用率(%)表示；對資料進行方差分析、t檢驗、卡方檢驗；在調整了年齡、BMI、不孕時間、不孕類型等因素后，使用多元邏輯回歸分析對HBV感染狀態(tài)與卵巢儲備功能低下的關系進行了評估。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、一般資料

本研究共納入了來我院進行不孕治療的女性患者505例，其中血清HBV陽性患者214例，血清HBV陰性患者291例。

在214例HBV感染者中血清HBV-DNA 滴度陽性者104例，陽性率為48.60%，DNA 拷貝數(shù)為5×102～1.28×109IU/ml，平均為5.86×104IU/ml。

二、各組間臨床基礎數(shù)據(jù)的比較

我們對3組患者的年齡、BMI、不孕時間、不孕類型等進行了比較，同時也比較了3組之間月經(jīng)第2或第3天血清基礎FSH、LH、E2水平及基礎AFC等指標。結果顯示3組間的臨床基礎數(shù)據(jù)均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

三、HBV感染與卵巢儲備功能下降之間的關系

1.不同HBV感染狀況下卵巢儲備功能低下的發(fā)生率：卵巢儲備功能低下的判斷標準為AFC<6和/或FSH>10 U/L、FSH/LH>3、E2>294 pmol/L。研究發(fā)現(xiàn)，C組中AFC<6的發(fā)生率顯著高于A組(P<0.05)，且有高于B組的趨勢但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；而3組間基礎血FSH>10 U/L、FSH/LH>3、E2>294 pmol/L的發(fā)生率均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表2)。

2.卵巢儲備功能與各觀察指標及HBV感染狀況的關系：我們基于AFC水平(<6或≥6)分析了各項指標與卵巢儲備功能低下之間的關系，發(fā)現(xiàn)AFC<6的患者年齡顯著增高(P<0.05)，而其他各項指標無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表3)。

表1三組間臨床基礎數(shù)據(jù)比較[x-±s，n(%)]

組 別例數(shù)年齡(歲)BMI(kg/m2)不孕狀況不孕時間(年)原發(fā)繼發(fā)A29130.37±3.7221.82±2.974.62±4.49126(43.30)165(56.70)B11030.53±4.0321.68±2.804.96±3.0258(52.73)52(47.27)C10431.40±4.5821.65±3.404.27±3.4844(42.31)60(57.69)組 別例數(shù)FSH(U/L)LH(U/L)E2(pmol/L)FSH/LHAFC(個)A2916.63±2.045.12±3.99167.35±66.431.81±1.0513.22±4.20B1106.89±1.854.59±2.25181.63±65.291.77±0.8013.83±4.64C1046.58±1.744.70±2.86178.58±66.101.78±0.9912.80±5.49

表2三組不同HBV感染狀況患者卵巢儲備功能低下指標的發(fā)生率[n(%)]

組 別例數(shù)FSH>10U/LE2>294pmol/LFSH/LH>3AFC<6A29115(5.15)12(4.12)36(12.37)6(2.06)B1106(5.45)6(5.45)10(9.09)6(5.45)C1046(5.77)8(7.69)12(11.54)10(9.62)*

注：與A組比較，*P<0.05

表3卵巢儲備功能與各觀察指標的關系[x-±s，n(%)]

組 別例數(shù)年齡(歲)BMI(kg/m2)不孕時間(年)原發(fā)不孕FSH(U/L)FSH/LHE2(pmol/L)AFC≥648330.37±3.9821.64±2.904.59±3.84214(44.30)6.68±1.891.78±0.97154.80±72.52AFC<62235.20±2.70*24.57±4.505.25±4.2810(43.45)7.16±2.221.98±0.63174.44±66.73

注：與AFC≥6組比較，*P<0.05

同時，我們也分析了HBV感染狀態(tài)與卵巢儲備功能低下之間的關系，發(fā)現(xiàn)C組的患者在卵巢儲備功能低下(AFC<6)的患者中所占的比例大于在卵巢儲備功能正常(AFC≥6)的患者中的比例(P<0.05)；相反，A組的患者在卵巢功能下降(AFC<6)的患者中的比例小于在卵巢功能正常(AFC≥6)患者中的比例(P<0.05)；而B組患者與卵巢儲備功能低下無關(P=0.52)(表4)。

四、邏輯回歸分析

以卵巢儲備低下作為應變量，年齡、BMI、不孕時間、不孕類型、HBV感染狀態(tài)作為因變量，我們對卵巢儲備功能低下與HBV感染狀態(tài)之間的關系進行了多元邏輯回歸分析。在調整了年齡、BMI、不孕時間、不孕類型后，與A組相比，C組的卵巢儲備功能低下的發(fā)生風險顯著增大[OR3.689，95%CI(1.043，13.048)](P<0.05)，但是B組卵巢儲備功能低下的發(fā)生風險與A組相比無統(tǒng)計學差異[OR3.598，95%CI(0.912，14.196);P>0.05](表5)。

表4卵巢儲備功能與HBV感染狀況的關系[n(%)]

組 別例數(shù)HBV感染狀況ABCAFC≥6483285(59.0)104(21.5)94(19.5)AFC<6226(27.3)*6(27.3)10(45.4)*

注：與AFC≥6組比較，*P<0.05

表5臨床變量、HBV感染狀態(tài)與卵巢儲備功能下降之間的多元邏輯回歸分析

參數(shù)OR(95%CI)P年齡1.397(1.018-1.653)<0.05BMI1.182(1.022-1.367)0.24不孕時間0.997(0.878-1.132)0.96不孕類型1.606(0.478-5.396)0.88HBV感染狀態(tài)A組*--B組3.598(0.912-14.196)0.68C組3.689(1.043-13.048)<0.05

注：*參照組

討論

我國是HBV感染的高發(fā)流行區(qū)，人群中HBsAg陽性率為7.2%，其中處在婚育年齡人群的HBV攜帶率近10%[8]。而近年來，在來醫(yī)院進行IVF/ICSI-ET治療的不孕女性患者中，血清乙肝表面抗原(HBsAg)陽性或HBV-DNA拷貝陽性的患者比較常見。在HBV感染的患者中，血清中HBV-DNA含量是反映病毒活躍程度最直接、最可靠的指標[9]。本研究主要是分析HBV感染狀態(tài)與卵巢儲備功能的關系。

本研究搜集到感染HBV的不孕患者214例，HBV-DNA 陽性率為48.60%。研究發(fā)現(xiàn)，在HBV感染的不孕婦女中，HBV(+)HBV-DNA(+)是卵巢儲備功能低下(AFC<6)的高危因素，使卵巢儲備功能低下的發(fā)生風險增大。竇卵泡是指陰道超聲下卵巢內(nèi)可見的直徑2～9 mm的卵泡，是成熟卵泡的前體，AFC能夠很好地反應卵泡池中剩余的原始卵泡數(shù)，是卵巢儲備功能的直接體現(xiàn)[10]。目前認為，基礎竇卵泡與基礎性激素、各種刺激試驗相比更能有效評估卵巢儲備功能[2]。Hu等[11]對HBsAg陽性而其配偶陰性的女性進行HBV-DNA和RNA的分析，發(fā)現(xiàn)HBsAg存在于卵母細胞的細胞核、細胞質和胚胎。而在卵母細胞或胚胎中的HBV-DNA 能夠復制，并且在mRNA和蛋白質水平上表達[12-14]。有研究表明在通過血睪屏障進入睪丸的HBV-DNA在復制的同時還會有一定數(shù)量整合到精子染色體，影響精子遺傳物質的穩(wěn)定性進而影響精子的質量，同時，HBV-DNA 表達的部分成分能夠導致精子線粒體膜電位的缺失，最終降低精子的活力[15]；另外，HBV感染另一潛在的病理致病機制為：在感染的局部組織通過抗原-抗體復合物的沉積引起局部的免疫反應或炎性反應，導致相關功能的破壞[16-17]。而這些致病機理可能同樣適用于整合入卵巢組織和卵母細胞的HBV-DNA。2013年李苗[18]發(fā)現(xiàn)HBV感染可以促進卵巢顆粒細胞的凋亡。因此HBV-DNA的感染可能會損傷卵巢組織和細胞，引起卵母細胞儲備功能如AFC的改變，而有研究表明AFC<6與卵巢低反應和低妊娠率相關[2]。因此，當血中HBV-DNA大量存在時，能夠對卵巢儲備功能造成一定的影響。

同時，本研究顯示除AFC<6的發(fā)生率在HBV(+)HBV-DNA(+)組比HBV(-)組更高外，其余FSH>10 U/L、FSH/LH>3、E2>294 pmol/L的發(fā)生率在三組間的差異均不具有統(tǒng)計學意義。推測可能的原因：垂體分泌的FSH、LH是受下丘腦促性腺激素釋放激素GnRH及卵巢雌激素的共同協(xié)調作用來調控的，卵巢儲備功能若受到影響，卵泡數(shù)目減少，從而其分泌的雌孕激素會減少，造成對垂體FSH、LH的抑制作用減弱，從而導致血清FSH、LH升高[19]，但是它們的變化比AFC的變化發(fā)生的較晚。同時卵巢或卵母細胞中雖然存在HBV-DNA，其含量遠遠低于血清[20]，卵巢組織或卵母細胞可能會通過某種機制逃避一些HBV-DNA造成的部分免疫傷害。其次，即使存在HBV-DNA整合到染色體，造成遺傳物質穩(wěn)定性的改變，或者在HBV感染局部存在免疫、炎癥反應，但是卵巢或卵母細胞同時也存在一定程度的自我修復功能，能修復部分所造成的損傷。因此HBV感染患者中高HBV-DNA滴度對卵巢儲備功能或AFC的影響可能還不足以引起FSH、LH、E2等一些指標的明顯的改變。

本文的不足之處在于臨床樣本量有限，因此該結論仍然需要更大樣本量的研究來證實。同時，由于臨床樣本量等原因，本文并沒有加入AMH指標，而相比于其他指標，AMH能更早地、準確地評估卵巢儲備功能，其靈敏度和特異性與AFC相當[1]。因此，期待著后期能有相關研究針對AMH這一指標來進行進一步的論證。

總之，本研究的初步結果顯示，在HBV感染的不孕婦女中，HBV-DNA的高滴度存在是卵巢儲備功能低下的高危因素，能促進卵巢儲備功能低下的發(fā)生。同時由于本研究樣本量有限，仍然需要大樣本的研究來證實，且其具體的潛在機制有待于進一步的研究。

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[編輯：羅宏志]

Ovarian reserve function in infertile women with HBV infection

LIULiu，LIUQian，WENYan-qi，YANGJing*

ReproductiveMedicalCenter，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060

【Abstract】

Objectives： To evaluate the ovarian reserve function in the infertile women with HBV infection & HBV-DNA high copy number.

Methods： A retrospective analysis based on the medical records of 505 patients undergone IVF/ICSI-ET treatment in the hospital was performed. The patients were divided into three groups according to whether HBsAg existed and the serum titer of HBV-DNA： group A with HBsAg (-)；group B with serum HBsAg (+) & HBV-DNA<500 IU/ml；group C with HBsAg (+) & HBV-DNA≥500 IU/ml. The basic condition and ovarian reserve indicators such as serum FSH，LH，E2levels，and antral follicle count (AFC) in the three groups were analyzed and compared.

Results： The positive rate of HBV-DNA (≥500 IU/ml) was 48.60% in the infertile women with HBV (+). The titer of HBV-DNA varied from 5×102IU/ml to 1.28×109IU/ml with an average of 5.86×104IU/ml. There was a significant higher percentage of AFC<6 in group C compared with group A (9.62% vs. 2.06%，P<0.05). The proportion of patients with DOR (diminished ovarian reserve，AFC<6) was significantly higher than that with normal ovarian reserve (AFC≥6) in group C (45.4% vs. 19.53%，P<0.05). Conversely，the proportion of patients with DOR was significantly lower than that with normal ovarian reserve in group A (27.3% vs. 59.0%，P<0.05). The two proportions were not significantly different in Group B (27.3% vs. 21.5%，P>0.05). Multivariate logistic regression analysis showed that the risk of DOR was significantly higher in group C [odds ratios (OR)： 3.689，95% confidence interval (CI)： 1.043-13.048] compared with group A (P<0.05).

Conclusions： HBV-DNA high copy number may be a high risk factor for diminished ovarian reserve in HBV-infected women. It may affect the ovarian reserve function of infertile women.

Key words：HBV；HBV-DNA；Infertility；Ovarian reserve

【作者簡介】柳榴，女，湖北武漢人，碩士，生殖醫(yī)學專業(yè).(*通訊作者)

【基金項目】國家自然科學基金面上項目(No. 81370767)

【收稿日期】2015-06-09；【修回日期】2015-07-19

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.1.006