淡水湖泊微生物硝化反硝化過程與影響因素研究

楊柳燕,王楚楚,孫　旭,郭麗蕓,肖　琳,宋曉駿

(南京大學環(huán)境學院,江蘇 南京　210023)

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淡水湖泊微生物硝化反硝化過程與影響因素研究

楊柳燕,王楚楚,孫旭,郭麗蕓,肖琳,宋曉駿

(南京大學環(huán)境學院,江蘇 南京210023)

摘要：簡述了參與硝化反硝化過程的微生物類型及其影響因素,指出湖泊中底棲動物提高了沉積物中氨氧化菌的豐度,加快了沉積物和上覆水反硝化過程,同時底棲動物的腸道也是反硝化場所并釋放N2O。研究淡水湖泊中硝化反硝化微生物群落結構組成及多樣性,闡述硝化反硝化的分子生物學機制,探索底棲動物對參與氮循環(huán)微生物群落結構與功能影響。

關鍵詞：淡水湖泊;微生物;硝化;反硝化;底棲動物

1概論

湖泊是陸地圈層重要組成部分。我國湖泊眾多,面積大于1.0 km2的湖泊有2 683個,大約占國土總面積的0.9%,然而我國部分湖泊富營養(yǎng)化問題日益嚴重,湖泊中大量死亡的水生生物沉降到湖底,分解耗氧,導致魚類缺氧死亡,并產(chǎn)生氨、硫化物等物質,對水生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生不利的影響[1]。氮素是湖泊生態(tài)系統(tǒng)物質循環(huán)的重要組成部分,湖泊氮素循環(huán)在維持湖泊生態(tài)平衡中發(fā)揮重要的作用[2],因此,研究湖泊氮素微生物硝化反硝化過程及其影響因素作用具有十分重要的現(xiàn)實意義。

湖泊生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)是一個開放的循環(huán)模式,發(fā)生在氣-水界面、水體、水-泥界面、沉積物等介質中[3]。氮素通過大氣沉降、地表徑流和生物固氮等途徑輸入湖泊,據(jù)推算太湖生物固氮量只占外源總氮輸入量的 0.11%,大氣沉降總氮為同季節(jié)徑流入湖氮素負荷的18.6%,因此,通過徑流外源性氮素輸入是湖泊氮的主要來源[5]。湖泊氮素以無機氮和有機氮的形式存在,被藻類、大型水生植物、底棲動物等生物吸收同化,轉化為生物有機氮,這些生物死亡后又向水體和沉積物釋放大量的有機氮和無機氮。水體和沉積物中氮循環(huán)過程主要包括硝化作用、反硝化作用和厭氧氨氧化作用等,其中硝化反硝化過程是最重要的氮轉化過程,將氨氮氧化成硝態(tài)氮,然后進行反硝化轉化為氮氣[6],最終將結合態(tài)氮還原成N2O或N2回到大氣中。水體中無機氮不僅可以進行硝化反硝化,還可以通過沉降、擴散等物理過程儲存在沉積物中,成為湖泊內源性氮,在沉積物中發(fā)生一系列氧化還原過程。本文主要綜述微生物參與的氮素硝化反硝化過程及其影響因素。

圖1　淡水湖泊氮素循環(huán)[4]

2湖泊微生物硝化過程

2.1　氨氧化細菌(AOB)

1892年Winogradsky首次報道AOB的存在,隨后分離出第一株氨氧化細菌Nitrosospiraeuropaea,到20世紀60年代,Watson分離出16種AOB,隨著微生物培養(yǎng)技術的發(fā)展,更多的AOB被分離出來[10-11]?；?6S rRNA可將AOB分為5個屬,即Nitrosomonas、Nitrosococcus、Nitrosospira、Nitrosolobusand和Nitrosovibrio,除Nitrosococcus屬于γ變形菌外,其余都是β變形菌。而其中β-AOB在環(huán)境中占大多數(shù),Nitrosomonas和Nitrosospira是其主要類群[12]。由于AOB細胞結構和其生理特性的差異,造成其分布具有一定的空間異質性,不同種屬適應于特殊的環(huán)境,具有不同的生態(tài)位[10,13]。

對太湖沉積物中主要AOB種類進行分子生物學鑒定,獲得的所有序列分屬于5個OTUS,均為亞硝化單胞菌屬,優(yōu)勢條帶序列大多為N.oligotrophalineage。表明太湖竺山灣沉積物中AOB中亞硝化單胞菌屬特別是N.oligotropha豐度最高。同時藍藻水華暴發(fā)前后,太湖1～4 cm深度沉積物中AOB群落的優(yōu)勢條帶不變,表明該分支在淡水環(huán)境中廣泛存在。藍藻水華暴發(fā)后沉積物剖面在5 cm處的AOB群落中,條帶2所代表的物種減少,表明N.oligotrophalineage菌群受到抑制。

李靖宇等[14]通過提取沉積物和土壤總DNA,對氨氧化細菌群落進行測序,分析了富營養(yǎng)化湖泊烏梁素海4個樣點中AOB群落結構組成及環(huán)境因素的影響,發(fā)現(xiàn)在水陸過渡帶的沉積物和土壤中,AOB群落受TN和水溶鹽總量影響,AOB群落結構組成相似性逐漸降低,優(yōu)勢種群發(fā)生明顯變化,從以Nitrosomonas為主要優(yōu)勢類群向Nitrosospira為主要優(yōu)勢類群轉變。Coci等[15]比較淡水湖泊的底棲、浮游以及沉水植物表面附著的AOB群落,發(fā)現(xiàn)葉面附著AOB主要屬于Nitrosospiracluster3以及Nitrosomonasoligotropha。劉東山等[16]測定了不同時期東湖氮循環(huán)細菌在水體及底泥中的分布,發(fā)現(xiàn)水體中氨化細菌數(shù)量在平水期最高、豐水期次之,枯水期最低。邱珊蓮[17]以氨單加氧酶(amoA)基因作標記,用限制性片段長度多態(tài)性方法(RFLP)研究了月湖中氨濃度不同的5個采樣點沉積物中AOB的群落結構,結果表明AOB多樣性與沉積物間隙水氨濃度正相關。

為了研究不同營養(yǎng)水平湖泊沉積物中AOB群落的異同,對江蘇省太湖(TH)、玄武湖(XW)、洪澤湖(HZ)、石臼湖(SJ)、白馬湖(BM)、固城湖(GC)的細菌構建10個克隆文庫。隨機選擇AOB19-34陽性克隆子測序,基于3%的序列差異水平,194個克隆子分為26個可操作分類單元(OTUs),其中60.4%的序列屬于亞硝化螺旋菌屬(Nitrosospira-like),18.7% 的序列屬于亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonasoligotrophalineage)。在所有沉積物樣品中都存在亞硝化螺旋菌屬(Nitrosospira-like),而亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)僅僅出現(xiàn)在富營養(yǎng)化湖區(qū)中(圖2)。采用限制性內切酶Hpy8Ⅰ對AOB基因片段進行酶切得到8個主要片段T-RF60,T-RF97,T-RF104,T-RF154,T-RF234,T-RF256,T-RF264和T-RF491；片段T-RF60,T-RF104,T-RF154 僅在亞硝化螺旋菌屬檢測到,其中T-RF60最多,其他片段僅在亞硝化單胞菌屬檢測到[18]。因此,湖泊水體和沉積物中廣泛存在硝化細菌,其種類和數(shù)量隨湖泊環(huán)境條件不同而存在較大差異。

圖2　江蘇不同湖泊沉積物中細菌amoA的相對豐度[18]

2.2　氨氧化古菌(AOA)

根據(jù)古生菌16S rRNA將古生菌劃分為3個門,其中奇古菌(Thaumarchaeota)幾乎囊括了所有的氨氧化古菌,主要包括Group I 、HWCGⅢ、SAGMCG-1、FFS、YNPFFA、THSC1等,而Group I是分布最多的,對于Group I又進一步分為Group I.1、Group I.2、Group I.3和MBG, Group I.1又能分為Group I.1a、Group I.1b、Group I.1c[13]。在不同湖泊或同一湖泊不同湖區(qū),由于環(huán)境條件差異導致AOA種類和數(shù)量變化較大。2010年,對太湖沉積物AOA群落的研究表明,所有AOA的amoA基因序列分屬GroupI.1a和GroupI.1b,并以Group1.1b為主。藍藻水華暴發(fā)后AOA的物種多樣性減少,群落結構也發(fā)生變化。岳冬梅等[19]采用熒光原位雜交(FISH)技術研究了太湖梅梁灣和貢湖灣湖區(qū)沉積物中微生物的主要種群及氮循環(huán)功能微生物的數(shù)量和分布,發(fā)現(xiàn)隨著沉積物深度增加,細菌和古生菌數(shù)量均逐漸減少,但古生菌在總菌數(shù)中所占比例有所增加。在太湖沉積物中泉古菌普遍存在且數(shù)量高于氨氧化細菌,表明其在淡水湖泊氮循環(huán)中可能發(fā)揮重要作用。

2011年11月,王文玲[20]采用熒光定量PCR方法對南湖、三角湖、南太子湖、蔡甸西湖、后官湖、梁子湖、獅子口水庫和馬龍水庫8個不同營養(yǎng)狀態(tài)水體中水樣和底泥中氨氧化古菌amoA基因拷貝數(shù)進行定量分析,結果表明水樣中拷貝數(shù)為7.80×l04～1.34×l06個/L,底泥中拷貝數(shù)在4.64×l04～3.19×l05個/g之間。水樣中amoA基因拷貝數(shù)在不同湖泊和不同湖區(qū)存在顯著差異性。小南湖、梁子湖、東湖和湯遜湖4個湖泊沉積物中氨氧化微生物的amoA基因數(shù)量定量PCR測定結果表明，小南湖AOA和AOB的amoA基因數(shù)量最多,分別達2.1×104copies/g和2.8×103copies/g (干質量)。梁子湖僅檢測到了AOAamoA基因的存在,平均值為4.9×103copies/g。東湖和湯遜湖的AOAamoA基因數(shù)量比較接近,約為3.0×103copies/g,而AOB的amoA基因數(shù)量在這2個湖泊中僅分別為37 copies/g和86 copies/g。在這些采樣點中,AOA的amoA基因數(shù)量是AOB的3～278倍。

為了研究不同營養(yǎng)水平湖泊沉積物中AOA群落結構組成,選擇江蘇省太湖、玄武湖、洪澤湖、石臼湖、白馬湖、固城湖的湖泊或湖區(qū)構建10個克隆文庫。對于古生菌amoA文庫而言,隨機選擇17~31陽性克隆子測序,基于3%的序列差異水平,142個克隆子分為19個可操作分類單元(OTUs),其中93.1% 的序列屬于泉古菌海洋簇Crenarchaeotal Group (CG) I.1a (M),6.9%的序列屬于泉古菌土壤簇CG I.1b (S)(圖3)。泉古菌土壤簇CG I.1b (S)的序列都集中在富營養(yǎng)湖區(qū),而泉古菌海洋簇CG I.1a (M)則所有區(qū)域都覆蓋,同時這些序列進一步劃分為6個亞簇,大多數(shù)序列為S3、M1 and M2三個亞簇,M2亞簇在10個研究區(qū)域占優(yōu)勢(圖3)。采用限制性內切酶MspⅠ對AOA序列進行酶切得到4個主要片段T-RF56、T-RF196、T-RF239和T-RF635,片段T-RF 56在Group (CG) I.1a (M)和CG I.1b (S)都有,但主要集中在(CG) I.1a (M);而片段T-RF196、T-RF239和T-RF635只出現(xiàn)在其中一個簇,主要集中在CG I.1b (S)[18]。因此,淡水湖泊中存在大量AOA,其群落結構受到各種因素影響,湖泊富營養(yǎng)化水平越低,AOA數(shù)量越多。

圖3　江蘇不同湖泊沉積物中古生菌amoA的相對豐度[18]

2.3　厭氧氨氧化菌(Anaerobic Ammonia-oxidizing bacteria)

20世紀90年代荷蘭的Mulder等發(fā)現(xiàn)了一種新型細菌—厭氧氨氧化菌,這類細菌可以在缺氧條件下以亞硝酸鹽作為電子受體將氨氧化成氮氣。厭氧氨氧化菌是嚴格厭氧自養(yǎng)菌,鑒定有5屬10種,均歸為細菌域浮霉菌門(Planctomycetes),5個屬分別為Brocadia、Kuenenia、Anammoxoglobus、Jettenia和Scalindua。Schubert等[21]在天然淡水湖泊Tanganyika湖中發(fā)現(xiàn)了與CandidatusScalinduabrodae類似的序列,首次證明了淡水湖泊中存在厭氧氨氧化。近幾年,在湖泊環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的厭氧氨氧化菌及其反應過程使人們意識到厭氧氨氧化在湖泊中也具有重要作用。在自然環(huán)境中,厭氧氨氧化菌的種群多樣性較低,每種細菌都有其特定的生存環(huán)境,大量研究已證實,Scalindua屬的厭氧氨氧化菌存在于海水中,具有一定的耐鹽能力,而Kuenenia和Brocadia屬的厭氧氨氧化菌屬于淡水菌種,比較適宜生存于淡水環(huán)境。張亞平等[22]應用分子生物學方法鑒定淺水湖泊陽澄湖沉積物中厭氧氨氧化細菌和好氧氨氧化細菌,得到的厭氧氨氧化菌序列大多與CandidatusBrocadiafulgida相似性較高,提供了陽澄湖中好氧氨氧化菌與厭氧氨氧化菌共存的分子證據(jù)。王衫允等[23]結合同位素示蹤與分子生物學技術研究了白洋淀湖泊濕地沉積物中厭氧氨氧化菌的群落結構、多樣性及活性,發(fā)現(xiàn)了與CandidatusBrocadiafulgida和CandidatusBrocadiaanammoxidans相似的厭氧氨氧化菌序列,但生物多樣性相對較低,空間異質性較大。張鈺[24]通過巢式PCR從污染較重的東湖、南湖、藕塘及魚塘沉積物中擴增出了厭氧氨氧化菌的特異性條帶,而在一些低污染河流和湖泊中,僅在少數(shù)釆樣點發(fā)現(xiàn)了厭氧氨氧化菌,表明在重污染水體中厭氧氨氧化菌的脫氮作用可能比低污染水體更為重要。因此,不同湖泊中厭氧氨氧化菌群落組成存在差異,受湖泊富營養(yǎng)化程度影響。

3湖泊微生物反硝化過程

3.1　反硝化細菌

以亞硝酸鹽還原酶基因(NirS)為分子標記,探討富營養(yǎng)化湖泊武漢東湖沉積物中NirS類反硝化細菌群落的結構和多樣性,在武漢東湖4個典型子湖郭鄭湖、湯菱湖、團湖和廟湖采集沉積物樣品,基于NirS序列的生物多樣性和豐富度分析,結果表明團湖生物多樣性和豐富度指數(shù)最高,而廟湖各項指數(shù)均較低。各子湖供測試序列及其代表序列綜合RFLP聚類分析表明,武漢東湖沉積物中NirS類反硝化微生物種群具有豐富的多樣性。NJ系統(tǒng)發(fā)育分析表明東湖沉積物NirS類反硝化菌群可分成3個群體(群Ⅰ-Ⅲ)。群Ⅰ占總群體的67.7%,廣泛分布于不同的生態(tài)環(huán)境。來自郭鄭湖代表菌中81%NirS類反硝化菌分布于群Ⅰ,而廟湖的代表菌中65%NirS類反硝化菌分布于群Ⅱ。比較分析發(fā)現(xiàn)來自于東湖和人工濕地兩種生境的NirS群落間具有較高的相似性,因此,淡水富營養(yǎng)型湖泊東湖沉積物中亞硝酸還原酶基因具有豐富的多樣性[37]。

3.2　反硝化分子機制

圖4　反硝化過程的關鍵功能酶

反硝化過程第三步是一氧化氮還原酶將一氧化氮催化轉化成氧化亞氮,一氧化氮還原酶Nor主要存在于細胞膜中,主要由norC和norB基因編碼的兩個亞基組成[35, 39]。反硝化過程的最后一步是由氧化亞氮還原酶將一氧化二氮催化成氮氣,氧化亞氮還原酶主要由nosZ基因編碼的含有8個Cu離子的兩個相同亞基組成,nosZ基因也廣泛用來研究環(huán)境中反硝化菌的群落結構[40]。

4影響湖泊微生物硝化反硝化過程的因素

4.1　影響湖泊硝化過程的環(huán)境因素

4.1.1對氨氧化細菌AOB的影響

AOB的空間異質性除與其自身的生理生化特性有關外,還與其棲息的環(huán)境有關。氨作為氨氧化反應的底物,是影響AOB分布的關鍵因子,不同種屬AOB對氨的親和力(Km)以及耐氨能力差異較大[41]。pH是另一個調控AOB分布的關鍵因素[42-44]。AOB對pH的耐受范圍較窄,當pH小于7時AOB的生長受到限制,此時非離子氨降低,AOB受到底物濃度限制。雖然AOB的某些種屬適應低pH環(huán)境,但是在pH小于6.5時基本檢測不到其活性[45-46]。提高溫度能促進微生物的新陳代謝,有利于AOB的生長和硝化活性,但當溫度大于40℃時檢測不到AOB存在[46-49]。一些生物因子也會影響AOB的生長和活性,比如水體中大型水生植物通過根系泌氧作用促進AOB的生長,改變群落結構,沉積物的底棲動物通過捕食和擾動改變AOB的群落結構。

4.1.2對氨氧化古菌AOA的影響

隨著編碼氨單加氧酶amoA基因作為分子標記物的廣泛應用,發(fā)現(xiàn)AOA廣泛存在于環(huán)境中,其中在淡水沉積物中也發(fā)現(xiàn)大量的AOA存在[54-55]。氨作為氨氧化反應的底物,影響AOA的分布和群落結構,不同種屬AOA的最適氨濃度和耐氨濃度存在差異,總體而言AOA的Km值較低,對氨的親和力較高[46,55]。研究表明環(huán)境中NH3濃度增加會延長淡水或沉積物富集AOA的時間[54]。pH是另一個調控AOA生長的因素,AOA對pH的耐受范圍較寬,在2.5～9.0之間都能存活。Nicol等[44]發(fā)現(xiàn)pH會篩選出不同表型的AOA,這些AOA都有不同的生理特征和生態(tài)位,并且AOA的豐度隨pH增加而降低,表明在低pH環(huán)境下硝化過程可能由AOA驅動。

AOA對溫度的耐受范圍較寬,在0.2～97℃都能檢測到AOA的存在。在低溫環(huán)境中,AOA的多樣性降低,同時出現(xiàn)與低溫相對應的特異性的AOA,表明AOA通過自身群落結構的變化,出現(xiàn)適應溫度的特異性菌屬[56-57]。于2011年11月對南湖、三角湖、南太子湖、蔡甸西湖、后官湖、梁子湖、獅子口水庫、馬龍水庫8個不同營養(yǎng)負荷水平水體的水樣和底泥中的氨氧化古菌amoA基因拷貝數(shù)進行定量測定,相關性分析顯示水樣中amoA拷貝數(shù)與TN和NH3正相關,而與pH、TP、透明度、Chl-a不具相關性。底泥amoA拷貝數(shù)豐度與底泥總氮呈極其顯著正相關,而與pH、TP、NH3、有機質、含水率等都不具相關性。

沉積物中amoA基因數(shù)量與間隙水中亞硝態(tài)氮無顯著相關性,但與硝態(tài)氮濃度呈顯著正相關。除了上面因素外,溶解氧[9]、沉積物類型、硫和磷含量[39]、有機質含量等都會影響AOA的分布和群落特征。對小南湖、梁子湖、東湖和湯遜湖4個湖泊沉積物中氨氧化微生物的amoA基因數(shù)量與環(huán)境因子之間的關系分析發(fā)現(xiàn),隨著湖泊營養(yǎng)水平和間隙水中氨的上升,AOA和AOB的amoA基因數(shù)量均呈增加趨勢,但氨增加對AOB的促進作用要大于AOA,導致AOA和AOB的amoA基因數(shù)量比值與間隙水中氨濃度呈顯著負相關。pH上升對氨氧化微生物的抑制作用則與氨增加對它們的促進作用相反。

4.1.3對厭氧氨氧化的影響

影響厭氧氨氧化菌活性的因素有很多,基質與產(chǎn)物、溶解氧及有機物都對其生長有重要影響。一般認為厭氧氨氧化菌能夠耐受較高濃度的氨氮和硝酸鹽,但高濃度的亞硝酸鹽對其生長會產(chǎn)生明顯抑制。由于厭氧氨氧化菌是嚴格厭氧菌,因此其活性易被溶解氧所抑制。很多研究均表明,有機物的存在對厭氧氨氧化菌的生長有著不利影響。反硝化反應會釋放出比厭氧氨氧化反應更高的自由能,且反硝化菌的生長速率要遠大于厭氧氨氧化菌,因此在一定量有機物存在的條件下,厭氧氨氧化菌將難以與反硝化菌競爭亞硝酸鹽。

影響厭氧氨氧化反應最顯著的因素是厭氧氨氧化菌的種類和數(shù)量,還有一些其他的環(huán)境因子,如有機質、溫度和 pH值等，高濃度的有機質將與氨氮競爭電子受體,且往往有機質更易成為電子供體,從而使厭氧氨氧化的脫氮效率降低。溫度和pH值的變化都是影響厭氧氨氧化菌的生長速率及酶活性的因子。在自然環(huán)境中厭氧氨氧化細菌表現(xiàn)出較強的溫度適應范圍,15～25℃為多數(shù)菌的最適溫度,若溫度超過25℃,厭氧氨氧化反應速率急劇下降; 若溫度達到27℃,反應基本處于停止狀態(tài)。厭氧氨氧化適宜厭氧環(huán)境,氧氣對厭氧氨氧化有明顯的抑制作用,當溶解氧質量濃度高至5 mg/L時,厭氧氨氧化活性被完全抑制。

4.2　影響湖泊反硝化過程的因素

反硝化過程的調控因子主要包括硝態(tài)氮濃度、碳可利用性、溶解氧濃度、溫度以及水生植物的生長、沉積物特性等。硝態(tài)氮濃度是反硝化過程的一個重要影響因素,當硝態(tài)氮濃度小于1 mmol/L時反硝化速率與硝態(tài)氮濃度呈顯著正相關[58],研究發(fā)現(xiàn)當硝態(tài)氮濃度從2 mmol/L增加到20 mmol/L時,反硝化速率反而受到抑制[26]。硝態(tài)氮濃度也能調控反硝化的最終產(chǎn)物N2O與N2的比例,通常高濃度硝態(tài)氮時兩者呈現(xiàn)高比例,因為反硝化菌在還原硝態(tài)氮過程中獲得的能量比還原N2O獲得的要多,因此優(yōu)先進行硝態(tài)氮還原。反硝化過程需要添加微生物可利用的碳源,理論上還原1 mol的硝態(tài)氮需要1.25 mol的碳,實驗中則發(fā)現(xiàn)需要2.86 mol的COD,這種差異主要是因為部分碳源需用于細胞合成。因此,異養(yǎng)反硝化過程受微生物可利用碳的影響,能影響碳礦化的因素也能影響反硝化過程。反硝化通常在厭氧環(huán)境下進行,氧氣是抑制反硝化過程最重要的因素之一。少量的氧氣(0.02 atm)就能導致潛在反硝化速率大幅度的降低,在反硝化還原酶中Nos對氧的敏感度最高,更易受到氧的抑制,導致不完全反硝化過程。

由于水體中有機物含量會影響湖泊反硝化過程,富營養(yǎng)化湖泊藻華暴發(fā)會提供大量碳源,有利于湖泊反硝化脫氮過程。模擬研究自然或人工沉降的太湖藍藻在厭氧條件下作為碳源對底泥微生物反硝化脫氮具有促進作用,藻體中大量生物可降解碳素在厭氧分解后產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸等一些可供反硝化菌直接利用的小分子物質,促進了硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮還原成N2和N2O的過程,提高湖泊水體脫氮能力。

4.3　底棲動物對氮轉化的影響

底棲動物(zoobenthos)是指生活史的全部或大部分時間生活于水體底部的水生動物群。湖泊沉積物中存在大量的底棲動物和氮轉化微生物,底棲動物能通過生物擾動、攝食、排泄等方式,增加溶解氧在沉積物的滲透深度,使上覆水中有機質進入沉積物,加速無機氮(DIN)和顆粒性有機氮(PON)在沉積物與上覆水之間好氧-厭氧界面的氮循環(huán),改變氮在湖泊中的轉化途徑[59-60]。

對掘穴類底棲動物而言,受擾動的沉積物洞穴內好氧-厭氧界面增多,更多的可溶性有機質沉降到穴壁,溶解氧和DIN濃度隨底棲動物的活動呈現(xiàn)波動性變化,而氨含量則增加[61]。底棲動物通過擾動和自身排泄增加掘穴內溶解氧和氨濃度,從而增強硝化菌活性,使穴內硝化菌豐度高于未受擾動沉積物中硝化菌豐度,同時在底棲動物掘穴過程中,消耗部分溶解氧,上覆水中可溶性有機質和硝態(tài)氮進入穴內,促進耦合的硝化反硝化過程[62]。掘穴底棲動物中某些種屬(搖蚊幼蟲、寡毛類正顫蚓、沙蠶等)能通過密度依賴型影響水體氮循環(huán),通常高密度的底棲動物伴隨較高的通氣環(huán)境,提高泥水間氮循環(huán)速率和DIN的轉化通量。研究表明高密度搖蚊幼蟲能顯著促進沉積物硝化反硝化作用,加快DIN在泥水界面的交換,而反硝化作用只有在底棲動物顯著改變掘穴內好氧狀況時才受到影響[63]。

造礁類底棲動物主要棲息在淺水湖泊的硬質沉積物表層,在造礁結構中,底棲動物能改變水流狀況和沉積物沉降速率,通過生物沉降和自身排泄增加有機質和氨,其濾食特性能使水質變清從而增加透明度,明顯影響淺水湖泊中微生物介導的營養(yǎng)鹽轉化,尤其是氮循環(huán)。雙殼類底棲動物為微生物膜的形成提供一個載體,硝化細菌和古生菌附著在殼表面的生物膜內,代謝產(chǎn)生氨和CO2[64]。在低流速封閉的水域環(huán)境中雙殼類底棲動物通過濾食活動加速懸浮物沉降,降低水體浮游植物生物量,增加透明度和溶解氧,增加底棲大型藻的數(shù)量和活性,從而促進沉積物耦合的硝化反硝化作用[65-66]。當雙殼類底棲動物密度過高則會降低溶解氧,從而抑制沉積物的硝化作用[67-69]。這類底棲動物能通過打撈的方式去除掉一部分的湖泊氮負荷[68]。

刮食類底棲動物能捕食沉積物中微生物,減少底棲環(huán)境中氮循環(huán)相關微生物豐度,降低硝化反硝化速率[70]。但底棲動物捕食的細菌和古生菌僅占沉積物總細菌的很小一部分,對沉積物總細菌的影響并不大,沉積物細菌的快速繁殖能彌補被捕食的細菌數(shù)量[71-72]。不過底棲動物通過持續(xù)的捕食能有效地降低沉積物中低生長速率的細菌數(shù)量,研究表明沉積層內搖蚊幼蟲的存在導致生長較慢的硝化細菌豐度明顯降低,而在通氣層內總硝化細菌豐度顯著高于下層沉積物,在下層沉積物中硝化速率降低。對某些底棲動物而言,捕食能影響AOA與AOB的相對比例,改變氨氧化微生物群落結構,從而影響硝化速率,但對氨氧化細菌總豐度沒有影響[61]。通過持續(xù)性的捕食對湖泊水體反硝化能力影響可能不大,這主要是由于反硝化細菌的高生長率以及反硝化細菌在底棲動物腸道的高存活率。

通過估算,底棲動物的存在能分別提高沉積物硝化和反硝化強度3.0倍和2.4倍,氨釋放和硝態(tài)氮增加分別為5.3倍和2.2倍,DIN的轉移通量在無底棲動物和有底棲動物時分別為24 μmolN/(m2·h)和162 μmolN/(m2·h)[62],底棲動物對沉積物硝化和反硝化作用的促進強度比較接近,而對氨釋放促進強度要高于硝態(tài)氮。底棲動物不僅能加速氨從湖泊沉積物向上覆水的遷移,降低沉積物DIN,還能促進沉積物釋放N2O[63],其原因為底棲動物的擾動引起其棲息微環(huán)境的好氧厭氧交替變化,增加營養(yǎng)鹽的濃度,提高氮轉化速率,產(chǎn)生N2O,同時排泄物內反硝化菌能進一步強化沉積物反硝化形成N2O[73]。

近年來研究表明底棲動物的腸道或表面生物膜也能釋放N2O,其釋放量在0～93.1 nmol/(g·h)之間,底棲動物自身并不能釋放N2O,其主要是由腸道內反硝化微生物所產(chǎn)生[63,74-75]。底棲動物腸道內氧氣接近于0,pH在7.7～8.2,含有各類可溶性的有機酸和硝態(tài)氮、亞硝氮,為反硝化和其他厭氧微生物提供一個很好的微環(huán)境,經(jīng)反硝化釋放N2O和N2[76]。底棲動物腸道釋放N2O的能力與其覓食類型、體重、腸道氧濃度以及沉積物的硝態(tài)氮濃度和溫度有關[60,74]。研究表明Ephemendanica釋放N2O速率與其濕重顯著正相關,棲息環(huán)境硝態(tài)氮濃度、溫度、溶解氧是影響底棲動物的主要因素[62]。這些因素超過一定閾值后才會促進底棲動物釋放N2O,例如當沉積物硝態(tài)氮濃度在25～50 μmol/L時,搖蚊幼蟲(Chironomusplumosus)釋放N2O速率才會隨著溫度升高而增加,當溫度在4～10℃時,N2O釋放速率才會隨環(huán)境硝態(tài)氮濃度增加而增加[60]。底棲動物釋放N2O速率存在一個季節(jié)性變化,這與湖泊沉積物反硝化的一個季節(jié)性波動有關,比如在溫帶湖泊沉積物硝態(tài)氮在夏季較低,冬季較高,而硝化速率則是在夏季較高,冬季較低,因此可以預測在夏季底棲動物釋放N2O速率高而在冬季釋放速率低。

圖5　藍藻對搖蚊幼蟲腸道反硝化基因和16S rDNA豐度的影響(添加藍藻+C)[77]

5展望

對湖泊氮素轉化的微生物群落結構組成和影響因素進行了大量研究,了解了生物硝化反硝化的微生物群落結構,湖泊水體和沉積物中都存在硝化反硝化過程,但是為了深入了解湖泊氮素轉化過程,必須開展大量定量的氮素轉化的分析,闡明氮素轉化微生物的功能。因此,開展微生物硝化反硝化過程及底棲動物對其群落結構和功能影響及其自身氮轉化的能力研究都具有十分重要的現(xiàn)實意義。

a. 針對非富營養(yǎng)化湖泊,開展氮素轉化生物學機制定量研究。深入開展湖泊硝化反硝化潛力的研究,探索不同營養(yǎng)化水平湖泊反硝化脫氮潛力,同時分析硝化反硝化的微生物群落組成和多樣性,開展氮素微生物硝化反硝化過程與影響因素研究,分析不同微生物對氮素轉化作用權重,闡明湖泊保持氮素平衡的生物學機制,有利于增加對湖泊氮素生物地球化學循環(huán)的認識。

b. 針對富營養(yǎng)化湖泊,開展氮素削減的生物學機制定量研究。對于藍藻水華暴發(fā)的湖泊,由于藻密度大的區(qū)域,底棲動物與微生物數(shù)量也多,底泥中存在強烈的硝化反硝化過程,在夏天太湖藍藻暴發(fā)時通常會由磷限制轉變?yōu)榈拗?富營養(yǎng)化湖區(qū)的反硝化能力增強。因此,需進一步探索氮素轉化與水生態(tài)系統(tǒng)結構關系。同時加強微生物硝化反硝化作用研究,探索增強硝化反硝化過程的影響因素和高效原位氮素轉化的潛力,探索湖泊內源污染削減的新方法,加快湖泊水生態(tài)系統(tǒng)的恢復。

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Study on microbial nitrification and denitrification processes and influence factors in freshwater lakes

YANG Liuyan, WANG Chuchu, SUN Xu, GUO Liyun, XIAO Lin, SONG Xiaojun

(SchoolofEnvironment,NanjingUniversity,Nanjing210023,China)

Abstract：Types and influence factors of microbe which take part in the nitrification and denitrification processes are resumed. It is pointed out that benthonic animals in lakes increase the abundance of ammonia oxidizing bacteria in sediments and accelerate the denitrification process in sediments and overlying water. Meanwhile, the intestines of benthonic animals are also the room of denitrification and release N2O. The structure and diversity of microbe community which take part in the nitrification and denitrification processes are studied. Molecular biology mechanism of nitrification and denitrification is stated. Impacts of benthonic animals on structure and function of microbe community which play role in the nitrification and denitrification processes were also explored.

Key words：freshwater lake; microbe; nitrification; denitrification; benthonic animals

(收稿日期：2015-10-01編輯：徐娟)

中圖分類號：X172

文獻標志碼：A

文章編號：1004-6933(2016)01-0012-11

作者簡介:楊柳燕(1963—),男,教授,主要從事環(huán)境污染生物修復和污染物生物處理技術研究。E-mail:yangly@nju.edu.cn

基金項目:太湖水污染治理專項資金課題(TH2014205);國家水體污染控制與治理重大專項(2012ZX07101006)

DOI：10.3880/j.issn.1004-6933.2016.01.002