地表水微生物溯源技術的開發(fā)和應用進展

魏源送,鄭嘉熹,王光宇,張玉秀,王亞煒

(1.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心,北京　10085; 2.美國加州環(huán)境保護署圣塔莫尼卡灣治理委員會,洛杉磯CA 90013;3.中國礦業(yè)大學(北京)化學與環(huán)境工程學院,北京　100083)

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地表水微生物溯源技術的開發(fā)和應用進展

魏源送1,鄭嘉熹1,王光宇2,張玉秀3,王亞煒1

(1.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心,北京10085; 2.美國加州環(huán)境保護署圣塔莫尼卡灣治理委員會,洛杉磯CA 90013;3.中國礦業(yè)大學(北京)化學與環(huán)境工程學院,北京100083)

摘要：論述了微生物溯源(microbial source tracking, MST)技術的發(fā)展背景與特征,從源指示物的選擇、源指示物的檢測和源解析總結了MST技術的開發(fā)與應用進展,并介紹了用于支持最大日負荷總量(total maximum daily load, TMDL)方案制定或實施的MST技術工作流程,對今后MST技術的研究與應用進行了展望,以期為我國地表水病原微生物污染控制提供參考。

關鍵詞：水體污染;地表水病原微生物;污染控制;源指示物;微生物溯源技術;TMDL

河流等地表水的病原微生物污染對人類健康構成了巨大的潛在威脅,我國各大水系均已受到不同程度的病原微生物污染,其中畜禽糞便和生活污水是地表水病原微生物污染的最主要來源之一[1]。病原微生物是美國地表水質不能達標的首要肇因[2]。隨著我國對“水污染防治行動計劃(簡稱“水十條”)”的嚴格實施和水污染防治工作的持續(xù)推進,地表水體的黑臭、富營養(yǎng)化等問題將會逐步得到有效控制,而地表水病原微生物污染及其控制將日益得到人們的重視。最近20多年以來,歐美發(fā)達國家開展了大量的地表水病原微生物污染防控工作,其中實施病原微生物污染源調查,開展源控制以降低病原微生物風險,已被證明是一個高效、實用的水體保護措施[3]。因此,筆者通過文獻調研,從地表水病原微生物的指示與溯源入手,通過梳理微生物溯源(microbial source tracking, MST)技術的發(fā)展背景與技術特征,從源指示物的選擇、源指示物的檢測和源解析等方面論述地表水微生物溯源技術的進展,介紹用于支持流域病原微生物污染控制的工作流程和案例,以期為我國地表水病原微生物污染控制和地表水環(huán)境質量標準中有關病原微生物指標的修訂提供參考。

1地表水中病原微生物的指示與溯源

1.1　糞便污染指示微生物

地表水環(huán)境中病原微生物污染評價方法包括①直接檢測地表水環(huán)境中的病原微生物;②采用病原微生物的指示微生物,間接反映水環(huán)境的病原微生物污染狀況。由于病原微生物的直接檢測具有較多困難,如種類繁多、部分微生物不可培養(yǎng)、濃度較低、檢測繁瑣,故通常廣泛采用指示微生物方法。病原微生物的指示微生物通常應具備以下幾個特征:①僅存在于受污染水體;②數(shù)量上高于待測定的病原微生物;③與病原微生物對自然條件和污染處理過程的抗性相似;④易于通過簡單、經濟的方法進行分離、鑒定和計數(shù)。目前常用的指示微生物包括①細菌指示物,如細菌總數(shù)(Totalbacteria, TB)、總大腸菌群(Totalcoliforms,TC)、糞大腸菌群(Fecalcoliforms, FC)、腸球菌(IntestinalEnterococci,IE)、大腸桿菌(EscherichiaColi,EC)、糞鏈球菌(StreptococcusFaecilis)以及沙門氏菌(Salmonella)和志賀氏菌(Shigella)等致病菌;②病毒指示物,如SC噬菌體(SomaticColiphages),F-RNA噬菌體(F-specificRNAbacteriophages)和脆弱擬桿菌噬菌體(Bacteroidesfragillisbacteriophage)等;③原生動物指示物,如賈第鞭毛蟲(Giardialamblia),隱孢子蟲(Cryptosporidium)等[1]。目前糞便污染指示菌(fecalindicatorbacteria, FIB)被各國作為水質標準采用。我國目前實施的GB 3838—2002《地表水環(huán)境質量標準》采用FC為指示微生物，但基于大量的流行病學研究結果,已有部分發(fā)達國家摒棄了應用已久的TC和FC指標,改為采用EC和IE作為指示微生物[1]。

1.2　病原微生物污染來源

地表水病原微生物污染的最主要來源是畜禽糞便和生活污水[1]。來自人類的病原微生物污染源主要包括未經處理的直排污水、污水管道破損和處理設施失效(工藝失敗或者缺乏消毒措施)導致的排放污水;非人類來源的病原微生物主要來自畜禽(豬、牛、雞等)和野生動物或寵物(鳥類、貓、狗)等。當城市污水直接排放、污水處理廠違規(guī)排放或管道泄漏等主要點源逐步被有效控制后,非點源如化糞池滲漏、畜禽/寵物/野生動物等就可能成為地表水體病原微生物指數(shù)超標的主要原因。目前已知至少有200 多種動物傳染病和寄生蟲病可傳染給人類,其中最常見的人畜共患傳染病有幾十種,新出現(xiàn)的各種感染性疾病越來越呈現(xiàn)出“人禽共患” 或“人畜共患”的關系。大多數(shù)此類共患傳染病,如布氏桿菌病病菌、結核病病菌、沙門氏菌病等是通過糞便污染飲用水和食物等間接接觸方式進行傳播[4]。僅僅測量FIB不能夠有效提供有關病原微生物污染來源或宿主的信息,因為一方面來自人、牛、狗、鳥這些污染源的病原微生物共同存在,另一方面,多種來源(人、畜禽、野生動物)的病原微生物是否對人群有同樣的致病作用尚不可知。病原微生物的污染源信息是實施決策的前提,如僅僅采用FIB指標,將會導致缺乏足夠的信息,這不僅將嚴重影響管理部門的判斷,而且會造成事倍功半的效果,因此,如何從繁多的病原微生物來源中高效、準確查明罪魁禍首,正是微生物溯源(Microbial Source Tracking, MST)技術亟須解決的問題。

1.3　結合TMDL制定流域保護方案

MST技術開發(fā)的動力主要來自美國最大日負荷 (total maximum daily load, TMDL)方案制定與實施的需要[5-6]。TMDL方案是美國聯(lián)邦環(huán)保署推行的控制水污染源、保護地表水環(huán)境質量的計劃和措施[7]。自TMDL開展30多年以來,人們在流域水質模擬、安全邊際估算等方面積累了大量經驗,對改善水質、控制污染發(fā)揮了重要作用。目前國內已有較多的針對化學污染物控制TMDL方案的研究報道,但還沒有基于病原微生物污染控制的TMDL方案報道。制定TMDL方案的主要步驟包括源識別、負荷分配以及實施效果評估。源識別是MST技術在TMDL編制過程中最重要的用途,MST技術的結果不僅可以幫助方案編制者確定首要控制的病原微生物污染源,以便有針對性地提高流域的污染負荷削減效率,而且還可為優(yōu)化方案的制定提供指導。

2微生物溯源技術的開發(fā)進展

2.1　開發(fā)歷程

近幾十年以來,人們利用指示微生物開展了大量的水體病原微生物污染來源診斷的研究工作,并逐步形成了MST的概念。MST就是利用宿主特異性或者與宿主相關(單個物種或者群體)的微生物指標,建立區(qū)別、鑒定糞便污染和其他污染源的流程[3]。MST起源于20世紀80年代[8-9],可劃分為如下幾個階段:①初期階段。主要是定義新的病原微生物污染指示物[10-12]。②溯源方法開發(fā)階段[13-14]。隨著聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)和實時定量PCR (qPCR)等分子生物學技術的發(fā)展,MST技術得到了迅速發(fā)展[15]。③大規(guī)模的MST比選階段(2003年至今)[16]。該階段 MST技術已展現(xiàn)出作為管理手段的潛質,主要是同一種方法在不同實驗室間的可重復性,以及不同方法間的大規(guī)模對比工作[17-19]。④應用階段(2005年至今)。主要標志是MST技術作為病原微生物污染源診斷的管理工具得到了美國聯(lián)邦環(huán)保署的認可,并出版了MST工作導則[20],這表明MST已開始進入實地應用功效評估和實用標準程序制定的階段[21]。需要注意的是,新的方法至今仍在不斷被開發(fā)。

MST技術應用前景廣泛,如污染責任界定[3]、水質風險評價[22]、食品安全保障[23-24]等。MST技術的推廣應用不僅大大提高了水體病原微生物污染防治的針對性,而且提高了治理效率和整體治理成果。在水環(huán)境保護領域,應用MST技術主要有3個目的[21]:①確定人類來源(如市政污水、小區(qū)化糞池系統(tǒng)或人類其他行為)的糞便污染物是否存在以及所占比例;②確定與人類活動相關的非人源污染來源(如家畜)的存在及其所占比例;③明確所有糞便污染物來源(如人、牛、馬、狗、貓、鳥、水禽、嚙齒動物等)中各類別的存在及其所占比例。MST技術方案包括3個環(huán)節(jié):源指示物的選擇、源指示物的檢測和源解析。

2.2　源指示物的選擇

MST技術所用的源指示物是能夠指示水體病原微生物污染來源的代表性物質,包括大量具有種屬、遺傳物質特異性的微生物或者某些特殊的化學物質。選擇合適的源指示物是MST技術的基礎和關鍵。除了在傳統(tǒng)糞便監(jiān)測中使用的FIB (細菌、病毒、原生動物),許多研究表明,某些化學物質也可用作人或動物糞便污染的指示物。這是因為人類和動物的飲食組成和習慣有很大差異,經過體內代謝會產生不同的副產物,特異性副產物可用作標記物,進而推測其污染來源?，F(xiàn)有MST源指示物采用的主要化學物質有糞甾醇、脂肪酸、膽汁酸等,以及與人生活習性有關系的化學物質,如咖啡因、熒光增白劑等[25]。雖然化學檢測法簡單易行,但受環(huán)境因素的影響很大,穩(wěn)定性不高,難以區(qū)分各種病原微生物的來源,目前主要用于判定人源污染物是否存在。

2.3　源指示物的檢測

MST技術有多種分類方法,但基于檢測和溯源的方法是最主要的分類方法。按照分離培養(yǎng)和建立樣本庫,MST技術方法有4類[25]:培養(yǎng)建庫法 (culture-dependent library-dependent);培養(yǎng)非建庫法 (culture-independent library-independent);非培養(yǎng)建庫法(culture-independent library-dependent)和培養(yǎng)非建庫法(culture-dependent library-independent)。指示物的檢測方法是MST方法學的關鍵組成部分,主要有表型法(phenotypic methods)、基因法(genotypic methods)和化學法。表1所列各項常用MST技術的原理與特征已有較多綜述進行了整理[2, 23, 25-27],本文不再贅述。

表1　常用的微生物溯源技術

表型法主要依賴培養(yǎng)的結果,利用微生物在不同環(huán)境因素誘發(fā)下產生的特有生化代謝產物來判斷宿主來源。表型法主要包括抗生素抗性分析、碳源利用鑒定、血清型法和噬菌體法[28]等。基于培養(yǎng)法的MST,通過富集步驟增加靶標微生物的數(shù)量或提供分離的菌株,其優(yōu)勢是相對價格便宜、技術門檻低、易于廣泛使用。培養(yǎng)法常用FIB的存活、運輸以及相關流行病學資料較為充分[25],但其不足之處是培養(yǎng)法無法提供用于溯源的FIB種群多樣性和宿主特定種群,這是因為：①大多數(shù)細菌難以培養(yǎng),限制了培養(yǎng)法MST技術的應用范圍;②微生物群落的組成可能在培養(yǎng)時發(fā)生劇烈變化[25, 29],定量評價時必須考慮“培養(yǎng)偏差”;③與培養(yǎng)法配合的菌株分子生物學鑒別方法價格較高,如脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)和擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP),部分抵消了培養(yǎng)法成本低的優(yōu)勢。

基因法的原理是利用微生物在不同宿主內環(huán)境(如pH值、營養(yǎng)元素、菌群變化等)而發(fā)生的適應性改變,并產生遺傳多樣性,反向追蹤其所在宿主?；蚍ㄖ饕獧z測方法有PFGE、核糖體分型(ribotyping)、限制性片斷長度多態(tài)性分析(terminal restriction fragment length polymorphism, TRFLP)[30]、qPCR 以及反轉錄定量PCR(qRT-PCR)[31]等。相對于表型法,基因法具有靈敏、特異、簡便、快速和可靠等優(yōu)勢,越來越廣泛應用于源指示微生物的檢測。表2是基于分子生物學的常規(guī)檢測方法,在實際應用時應綜合考慮各項技術特征選用。非培養(yǎng)MST技術的優(yōu)點是可以覆蓋樣品中的整個種群,沒有培養(yǎng)偏差,不僅可用于易培養(yǎng)指示菌,還可用于難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的指示菌[20]。在美國加州,經過評估,人們認為分子生物學方法將成為MST的最有效工具,因而近年來投入大量資源支持分子生物學方法的研究,但分子生物學方法的不足之處是某些條件下特定標記物的含量很低(如病毒)或稀少(如毒力基因,宿主腸道細胞),需要大量水樣(超過100 L)或富集步驟來開展檢測。

表2　常用分子生物學菌種鑒定技術比較[32]

2.4　源解析方法

按照是否需要建立已知單一污染源樣本庫,源解析方法可分為建庫和非建庫微生物溯源(表1)。建庫MST方法是通過與基礎樣本庫或已知糞便來源的細菌菌株的基因型或表型指紋水樣進行比對,進而確定病原微生物污染的糞便來源。非建庫MST方法基于所述細菌或病毒的已知宿主特定特征的來源,無需與樣本庫進行對比。樣本庫可根據(jù)源指示微生物的宿主特異性來建立,而宿主特異性好的源指示微生物及其特異基因片段可直接用于非建庫微生物溯源方法[20, 26-27]。

建庫解析方法的優(yōu)點是可以識別指示菌(如大腸桿菌或腸球菌)的多種來源(人、寵物、家畜和野生動物等),但比較昂貴。建庫MST方法具有勞動密集型特點,樣本量大,需滿足代表性和地理穩(wěn)定性等復雜要求,樣本量少會導致評價效果不佳[33]。對于特殊地點,需要建立專門的樣本庫[25],如果是跨流域使用,還需要開展大量校正工作。一般來說,采用基因型檢測方法的樣本庫通常包含35～500株菌,采用表型法(如應用最廣泛的抗生素抗性分析)的樣本庫一般含有1 000～6 000株菌[34]。因此,近年來基于建庫的源解析方法已大量被非建庫方法所替代,這是因為美國的大學或研究機構中仍保留的水體病原微生物樣本庫已經很少,一些使用樣本庫的研究組已經逐步轉移了開發(fā)重點[21]。

2.5　MST方法的比選

迄今為止,人們對最佳MST方法還沒有形成廣泛的共識[21],但經過多年來人們對多種分子生物學方法的研究和篩選,非建庫的聚合酶鏈式反應(PCR)技術由于靈敏度高、特異性強、測試簡單、檢測時間短等優(yōu)點已顯示出巨大潛力,特別是基于擬桿菌16S rRNA基因序列擴增與比較的方法。目前很多實驗室已經開發(fā)并注冊了針對人或某類動物特有的16S rRNA序列的基因探針(表3),這些方法檢測復雜樣品(如污水、廢水)比菌種檢測方法更為方便,但在做定量評價時需要謹慎,因為標記物可以在多菌種的菌株上存在,或者每個菌株上標記物的數(shù)量不確定[35]。因此,新指示生物的開發(fā)和新檢測或定量方法的改善仍然是當今的研究熱點。MST方法之間的比較有利于方法的完善,這其中3次大規(guī)模比較研究極大地推動了MST方法的進步,克服了小規(guī)模比較研究的覆蓋范圍小、缺乏盲樣控制等不足[25]。

2.5.12003年美國實驗室間比較研究

20世紀90年代,美國許多實驗室已開展了基于分子生物學方法的MST溯源工作,但由于測試的樣本類別與數(shù)量有限,加之人們對不同MST溯源方法的效果缺乏統(tǒng)一和綜合的比較和鑒定,所以,為了考察MST方法的可推廣性,2003年美國南加州沿海水域研究所和美國加州環(huán)保局主持了一項大型的MST方法比較研究[36-38]。在這次研究中,參與人員得到一套含有人、牛、狗、海鷗、生活污水或它們的混合物的水樣(盲樣)以及組成這些盲樣的糞便樣品。參與溯源分析的比選方法包括基于大腸桿菌噬菌體、病毒、抗生素抗性、碳利用種類分析、Ribotyping、REP-PCR(重復序列PCR)、PFGE、微生物種群指紋、E.Coli毒力基因宿主特異性PCR、擬桿菌生物標記物PCR等12種方法,其中6種方法基于培養(yǎng)法[16]。

該項研究中，評價MST技術的指標包括病原微生物來源的識別率,糞便污染的定量分析和多種應用條件(淡水、咸水和腐殖酸干擾條件下)下的適用性。在這12種方法中,基于大腸桿菌毒素基因和擬桿菌標記物的宿主特異性PCR方法可準確查明樣品與人類糞便和污水的關系,沒有假陽性結果。該方法使用了人源、反芻類動物和狗的擬桿菌生物標記物,以及人源和牛的大腸桿菌的毒力基因標記物,但還缺少海鷗和狗的標記物。Ribotyping和PFGE方法在部分實驗室也可正確識別人源和其他4個來源。但基于樣品建庫的表型法和基因型法表現(xiàn)不佳,只能部分識別人源污染,并出現(xiàn)了大量假陽性結果?；诓《緳z測的方法可以非常有效地判別生活污水樣品,但在檢測人源糞便污染時表現(xiàn)欠佳?？傮w而言,該研究中沒有一種方法能正確識別所有樣品的污染來源,所有方法均在確定污染來源比例上表現(xiàn)不佳,并且同樣的方法在不同實驗室的差異也很大,這對MST方法的標準化提出了較高的要求。

2.5.22006年歐洲實驗室間比較研究

基于當時主流的MST方法,歐洲的研究人員于2006年開展了跨實驗室(西班牙、法國、瑞典、英國、塞浦路斯)的MST方法比較研究[17],檢測對象包括大腸桿菌噬菌體、擬桿菌噬菌體、山梨糖醇發(fā)酵雙歧桿菌(sorbitol-fermentingbifidobacteria)、FC噬菌體、大腸桿菌和腸球菌表觀分型、B.dentium與B.adolescentis的PCR基因型檢測、糞甾醇化學檢測等。該研究除了對MST方法進行單項評估外,還基于實驗結果開發(fā)出多個低參數(shù)要求的預測模型。本次比選與2003年美國比選的最大區(qū)別是沒有采用統(tǒng)一的盲樣進行分析,而是按照統(tǒng)一方法自行采集當?shù)匚鬯拓i場廢水進行樣品配制。雖然盲樣檢測可確保實驗室間方法的可比性,但針對不同地理位置的已知源樣品,該研究探明了在跨地區(qū)使用時哪些方法或哪些組合方法能有效識別人源和動物來源的病原微生物,這對完善MST方法具有重要意義。兩個最佳方法分別是通過檢測山梨糖醇發(fā)酵雙歧桿菌與噬菌體感染的擬桿菌(B.thetaiotaomicron)是否存在及其與噬菌體的比例判斷人源污染物的存在。雖然沒有一個方法可把人源污染100%地識別出來,但由微生物和化學指標定義的38個變量(獨立和組合變量)而開發(fā)的多個模型可有效識別人源污染物[17]。研究人員指出,下階段的研究重點是考察MST方法對實際樣品(如濃度較低的或者更多種來源的混合物)的檢測效果以及實際樣品中標記物的持久性。

2.5.32012年 美國實驗室間比較研究

MST方法經過10年的發(fā)展,主流方法除了病毒培養(yǎng)法之外,均是非建庫的方法。2011—2012年,南加州沿海水域研究所牽頭,聯(lián)合美國和歐洲27個研究機構的實驗室,對41種較為成熟的MST方法進行了特異性和敏感性的比較研究[16, 19]。

這次研究與2003年的比較研究存在較大的差異。這41種方法絕大多數(shù)都采用PCR或qPCR 技術,并以16S rRNA作為分子標記物(表3[39-65]),包括了專門針對人類、反芻動物類、狗、海鷗、豬、馬、羊的MST方法。針對病毒的分析多基于qRT-PCR技術,而噬菌體仍使用培養(yǎng)法檢測。參與測試的方法也包括3個以微生物群落分析為基礎的方法,分別是PhyloChip、16S 末端限制性片段長度多態(tài)性法(TRFLP)和 Bacteroidales 16S TRFLP。樣本分別來自生活污水和直接從各種動物體外采集的排泄物標本。用以識別人類糞便或生活污水的指示物包括病毒和噬菌體兩大類,其中病毒類指示物包括腺病毒(HAdV)、腸道病毒(EV)、Ⅰ類和Ⅱ類諾如病毒(NoV I 和NoV II)和多瘤病毒(HPyVs);噬菌體類包括用作一般性糞便污染指標的大腸桿菌噬菌體和F-特異性RNA噬菌體(F-RNAPH)。每一種方法都由1至7個實驗室進行測試。

比選結果表明:①按照以標記物在糞便樣品中的定性存在或不存在作為判定糞便來源的鑒定標準,針對不同宿主的敏感性和特異性最高的方法分別為HF183端點法和HF183SYBR法(人類),CF193法和Rum2Bac法(反芻動物類),CowM2和CowM3(牛),BacCan(狗),Gull2SYBR和LeeSeaGull(海鷗),PF163和pigmtDNA(豬),HoF597(馬),PhyloChip(豬,馬,雞,鹿),通用16S TRFLP(鹿)和Bacteroidales 16S TRFLP(豬,馬,雞,鹿)。這些方法的敏感性和特異性在所有實驗室都超過了80%。②按照定量分析的標準,表現(xiàn)最好的方法只有HF183Taqman[66]和BacH(人),Rum2Bac和BacR(反芻動物類),LeeSeaGull(海鷗)和Pig2Bac(豬),而針對牛或狗的檢測方法都沒達到定量分析的特異性和敏感性標準。

在這次測試中,幾種用來檢測人類特異病毒方法的測試結果都不太理想[67]。這些方法一般都具備高度的特異性,但對人類糞便源的敏感性都不高。特異性和敏感性方面表現(xiàn)最佳的方法是腺病毒qPCR法(Tetra Tech公司),雖然用該方法測試結果的準確度達到100%,但靈敏度僅為13.2%,也就是說，如果檢測出病毒標記物,可以有把握地確認污染源包括人糞便;如果沒有檢測到病毒標記物,研究者還不能輕易排除人類污染源。該研究結果很有代表性,反映了目前采用qRT-PCR技術檢測人體特異病毒的現(xiàn)狀和面臨的挑戰(zhàn)。除非受到大量生活污水的污染,一般情況下地表水中病毒含量偏低,需要將大量采集的水樣濃縮后進行病毒分析。雖然水樣富集方法近年來有所改進,但找到一個既可以有效提取和分離水樣中的病毒,同時又避免其副作用(富集濃縮過程同時干擾PCR反應)的方法還是一個難題。

表3　參與2011—2012美國南加州MST技術比較研究的指示微生物檢測方法

注：A—美國環(huán)保署國家風險管理研究實驗室,B—美國加州大學戴維斯分校土木環(huán)境工程系,C—奧地利維也納技術大學,D—法國海洋開發(fā)研究所微生物實驗室,E—美國俄勒岡州立大學微生物系,F—美國北伊利諾伊大學護理和健康研究學院,G—美國俄亥俄州立大學公共衛(wèi)生學院,H—加拿大魁北克大學國立科學研究所,I—比利時根特大學微生物生態(tài)學技術實驗室,J—美國環(huán)保署國家接觸研究實驗室,K—美國國家海洋大氣局沿海環(huán)境健康和分子生物研究中心,L—美國密蘇里大學獸醫(yī)病理系,M—英國布萊頓大學,N—美國夏威夷大學水資源研究中心,O—美國斯坦福大學土木和環(huán)境工程系,P—美國疾病控制預防中心,Q—美國南佛羅里達大學生物系,R—美國加州圣塔芭芭拉市,S—美國加州洛倫斯伯克利國家實驗室地球科學部,T—美國南加州沿海水域研究所。

2.6　MST綜合方法在TMDL中的應用

如果能提前進行MST診斷,TMDL方案中有關病原微生物污染負荷削減的任務分配將更加具體、準確和切合實際情況。如,削減措施可具體到控制畜牧區(qū)的徑流、某化糞池或者泄漏的污水管道。污染排放者通過排污權交易對流域內的經營行為進行調整,如調整放牧和農業(yè)用地的面積。目前美國聯(lián)邦環(huán)保署不建議將MST結果作為病原微生物污染源負荷估計或削減負荷分配的依據(jù),因為現(xiàn)有的MST方法在實際操作中尚不能進行可靠的定量分析,但MST結果可用于定性識別或者半定量識別污染源。在美國污染源管理體制下,MST結果可為國家污染物排放削減(national pollution discharge elimination System, NPDES)許可證持有人接受污染源控制方案提供有力證據(jù)。

圖1　基于水質保護的病原微生物溯源工作實施流程[21]

準確、可行的病原微生物污染控制方案的制定依賴于污染源的準確識別。在實際工作中究竟使用哪種MST方法和何時使用MST方法,主要取決于TMDL的要求、技術方法的效能和成本。根據(jù)MST方法比選的結果,單一方法不能有效解決源識別的問題[17],宜采用MST綜合方法。各種方法在效率、成本、檢測時間、操作便捷性等方面均各具特點,在實際工作中可結合多種手段形成復合方法。研究人員建議在制定TMDL方案之前,可在MST技術的“工具箱”中遵循從一般到特殊的方式選擇MST方法,或者使用多步檢測法(multi-tiered methods),實施從廉價到昂貴的檢測措施[16, 33]。其主要思路如下,一旦決定使用MST方法。開始時盡可能以較便宜的方法集中在一個或少數(shù)幾個具有高度可能的微生物污染來源,首先是識別的人源,然后采用宿主特異性PCR方法確定/選擇特定來源。一般情況下,MST的初步結果已能提供足夠的信息進行管理決策,也可作為是否需要采用更加昂貴、全面方法(如基于樣本庫的方法識別所有物種)的依據(jù)。圖1為TMDL框架下應用MST技術的工作流程。開始時使用化學物質溯源等低成本、低工作量的方法,后期綜合使用多種方法更為有效,如擬桿菌PCR[68]是一種常用的低成本方法,如果與低成本的病毒檢測組合,則可提供更為準確的結果。

佛羅里達州Lower St. Johns河流域的TMDL方案[21]制定過程中,采用了MST綜合診斷技術,流程如下:①資料收集,采用地理信息系統(tǒng)對流域內的數(shù)據(jù)進行整理;②大規(guī)模的現(xiàn)場調查,如 20人以上的為期8 d和2個水期的調查;③第一批10個支流所采用的MST綜合方法使用qPCR技術識別人源、反芻動物類和馬的細菌指示物。為提高檢測精確度,降低工作成本,其中對人源的細菌分析選用enterococcus faecium特異性引物和human polyomavirus(HPyV) 特異性標記物;④清查排污口點源,包括化糞池和連接錯誤的管線。

總體而言,MST方法已成為地表水中病原微生物檢測的首選,但在TMDL方案制定中需謹慎采用MST方案。弗吉尼亞環(huán)保署在Carters溪的TMDL方案中有關病原微生物污染控制部分采用了MST方案[21],其中MST的溯源結果給出了野生動物、人、牲畜和寵物4種來源的病原微生物相對豐度,該TMDL方案針對每種污染源做了負荷配置,這無疑提高了TMDL方案的精度,但在應用上需要小心謹慎,一方面這種方法假設樣本中的病原微生物豐度反映了流域內4種來源的實際貢獻,但這種假設不可靠,因為水體中病原微生物的污染程度不僅在空間上分布非常不均勻,而且所采集水樣只是部分代表實際情況,檢測結果還受采樣時間、采樣深度等參數(shù)的影響[69];另一方面,Carters溪的MST方案是基于抗生素耐藥性的分析,其培養(yǎng)偏差不能忽略。

制定和實施MST方案的最重要原則是從項目的需求出發(fā)選擇合適的MST方法,不僅需要考慮方法的用途、質量控制、盲樣檢測結果的精度,以及是否建實驗室適用的樣本庫,測試周期,樣本庫大小,檢測費用等,還需要綜合考慮項目的自然地理、社會經濟等因素。如迫切需要確定具體、多樣化的糞便來源,可選用建立DNA樣本庫的方法以提高檢測方法的區(qū)分度[25, 70]。如果成本是主要約束因素,則需要在檢測內容或者區(qū)分度上做出妥協(xié)。如果一個TMDL項目只需要識別人類和非人類污染來源的相對比例,就不推薦使用PFGE等可以識別特定種類的MST方法,因為PFGE價格遠超過噬菌體等方法。雖然MST方法在探明污染流域的病原微生物來源方面非常有效,但TMDL開發(fā)者應謹慎使用其結果。在評估和確定糞便細菌的來源時,MST方法應該用于補充而不是取代現(xiàn)有的方法和工具[21](現(xiàn)有的傳統(tǒng)工具包括檢測糞便細菌指標、衛(wèi)生學調查和現(xiàn)場調查),同時應采用管理部門的數(shù)據(jù)和流行病學報告等。

2.7　MST技術開發(fā)及應用中的挑戰(zhàn)

影響病原微生物源檢測推廣的障礙是MST結果的可靠性欠佳,不同實驗室對同一樣品的分析精度和準確性相差較大,其難點主要在于：①PCR檢測中出現(xiàn)的假陰性結果[71],這是最常見問題,因為糞便中含有大量Taq 聚合酶的抑制物質,可嚴重干擾結果的可靠性。②標記物自身的適應性。如,在采用MST技術評估美國各地采集的牛糞便標本時,由于各地喂養(yǎng)方法不同,牛糞便的生物標記物也有很明顯的改變[72]。③因為病原微生物濃度的波動極大,現(xiàn)場取樣時必須考慮所取水樣的代表性,同時需考慮遺傳標記物在體外自然環(huán)境中的持久性和衰減率、各種環(huán)境因素對靈敏度的潛在干擾[71]。如, PCR方法在檢測集中排放的城市污水中的病毒時非常有效,但對分散的小規(guī)?；S池等污染源的檢測效果較差,這會導致人們錯誤估算城市污染負荷的貢獻值。

基于生物標記物進行病原微生物溯源的缺點是與現(xiàn)行基于FIB的水質管理標準脫節(jié)[1]。目前生物標記物與FIB等糞便污染指示物的相關性知識較為欠缺,如,目前可用的標記物僅針對數(shù)量較少的動物物種,來源較窄,還不具備廣泛的動物代表性,但這個趨勢正在改變,如,加州環(huán)保署正在開展基于分子生物學標記物的水質標準研究。

3結語與展望

經過了20多年的發(fā)展,MST技術基本具備了實施病原微生物溯源的功能,較為成熟的MST方法包括宿主特異性病毒、擬桿菌和毒素/毒力基因的PCR檢測;在人源病原微生物識別方面,擬桿菌、擬桿菌噬菌體和FC噬菌體是綜合表現(xiàn)較好的方法。因此,更加準確、快捷、廉價的檢測手段仍然是今后MST方法的主要研發(fā)目標。

在我國河流污染治理有所改善的背景下,MST方法在河流TMDL應用領域還需要向標準化和規(guī)范化推進,尤其是對于TMDL應用人員而言,MST是個復雜的技術包,在方案編制過程中應從污染源識別的需求出發(fā),在應用中推動MST技術的發(fā)展與完善。

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Development and application progress of microbial source tracking in surface water

WEI Yuansong1, ZHENG Jiaxi1, WANG Guangyu2, ZHANG Yuxiu3, WANG Yawei1

(1.ResearchCenterforEco-EnvironmentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China；

2.SantaMonicaBayRestorationCommission,Cal/EPALARWQCB,LosAngelesCA90013,USA；

3.SchoolofChemicalEnviromentalEngineering,ChinaUniversityofMining&Technology,Beijing100083,China)

Abstract：The development background and characteristics of microbial source tracking (MST) technology are discussed. Development and application progress of MST are summarized from the aspect of selection, detection and analysis of source indicators. The technical process of MST supporting total maximum daily load (TMDL) scheme was also introduced. At last, the further study and application of MST were forecasted, to provide reference for pathogenic microorganism pollution control in surface water in China.

Key words：water pollution; surface water pathogenic microorganism; pollution control; source indicator; MST; TMDL

(收稿日期：2015-10-10編輯：彭桃英)

中圖分類號：X172

文獻標志碼：A

文章編號：1004-6933(2016)01-0001-11

作者簡介:魏源送(1969—),男,研究員，主要從事河流生態(tài)修復、污水處理與回用、有機固體廢棄物資源化處理的研究。E-mail:yswei@rcees.ac.cn通信作者:王亞煒,助理研究員,博士。E-mail:wangyawei@rcees.ac.cn

基金項目:國家水體污染控制與治理科技重大專項(2015ZX07203-005,2014ZX07510-001);國家自然科學基金(51478460);中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心“一三五”項目(YSW2013B02)

DOI：10.3880/j.issn.1004-6933.2016.01.001