IL-27基因多態(tài)性和血清IL-27p28水平與骨肉瘤風(fēng)險相關(guān)性分析

喻紫晨

作者單位:430300 湖北省武漢市黃陂區(qū)人民醫(yī)院

?

IL-27基因多態(tài)性和血清IL-27p28水平與骨肉瘤風(fēng)險相關(guān)性分析

喻紫晨

作者單位:430300 湖北省武漢市黃陂區(qū)人民醫(yī)院

【摘要】目的評估IL-27基因多態(tài)性和血清IL-27p28水平與骨肉瘤風(fēng)險的相關(guān)性。方法對比研究160例骨肉瘤患者(研究組)和250例健康患者(對照組)。IL-27基因-964 A/G，2905 T/G，和4730 T/C多態(tài)性采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性測定。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清中IL-27p28的水平。結(jié)果與對照組相比，骨肉瘤患者血清IL-27p28水平顯著降低(P<0.01)。Ⅲ～Ⅳ期骨肉瘤患者血清IL-27p28水平低于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)。同樣，轉(zhuǎn)移患者的血清IL-27p28水平低于非轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。IL-27-964 A/G，2905 T/G，4730 T/C的基因型和等位基因頻率與骨肉瘤風(fēng)險無相關(guān)性(P>0.05)。分層分析也未能顯示-964 A/G，2905 T/G，和4730 T/C多態(tài)性與臨床分期和骨肉瘤的轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論血清IL-27p28低水平可能與骨肉瘤進(jìn)展有關(guān)，但I(xiàn)L-27基因-964 A/G，2905 T/G，和4730 T/C多態(tài)性和它們的單倍型不與骨肉瘤的風(fēng)險相關(guān)聯(lián)。

【關(guān)鍵詞】骨肉瘤；IL-27基因；IL-27p28；風(fēng)險相關(guān)性

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:183～186)

骨肉瘤是間葉原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞所產(chǎn)生的侵襲性惡性腫瘤。它是原發(fā)性骨腫瘤中最常見的病理形態(tài)，多發(fā)生在青少年和50歲以上的人群[1]。骨肉瘤具有成骨細(xì)胞的惡性骨樣的分化和功能。目前，有研究表明，針對癌癥的免疫防御系統(tǒng)的主要機(jī)理是依賴于T細(xì)胞應(yīng)答。白細(xì)胞介素(IL)-27，IL-12和IL-23是同一家族的成員[2]。IL-27參與的Th1淋巴細(xì)胞的分化，增強(qiáng)細(xì)胞類型的免疫應(yīng)答，以及抑制Th2細(xì)胞體液免疫反應(yīng)的過程。證據(jù)表明，IL-27可以通過多種機(jī)制抑制腫瘤的進(jìn)展，不受腫瘤免疫原性的影響;這些特征可能對腫瘤的治療具有很大的價值。本研究評估IL-27基因多態(tài)性和血清IL-27p28水平與骨肉瘤風(fēng)險相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1　一般資料

對比研究160例骨肉瘤患者(研究組)和250例健康患者(對照組)。骨肉瘤的診斷是基于病理檢查，患者均無家族癌癥病史。研究組患者平均年齡(27.5±8.5)歲，男性105例(65.6%)，女性55例(34.4%)；長管狀骨133例(83.1%)，軸向骨架27例(16.9%)；轉(zhuǎn)移患者56例(35.0%)，無轉(zhuǎn)移患者104 例(65.0%)。對照組患者平均年齡(27.9±7.8)歲，男性155 例(62.0%)，女性95例(38.0%)。2組年齡和性別無差異，具有可比性(P>0.05)。本研究獲得患者知情同意書及醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2　血清IL-27p28和IL-12p40的測定

室溫靜脈血收集血清，-80 ℃存儲直至使用。定量測定血清中IL-27p28是通過酶聯(lián)免疫檢測試劑盒進(jìn)行(Fermentas公司中國有限公司，中國深圳)。OD 450單位下進(jìn)行顯色反應(yīng)(酶聯(lián)免疫吸附測定閱讀器)(BIO-RAD680，東京，日本)。細(xì)胞因子的濃度，使用0～10 000 pg/mL范圍試劑盒，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定。

1.3　DNA提取

根據(jù)鹽析法從抗凝的外周血白細(xì)胞中，利用乙二胺四乙酸萃取DNA。簡言之，將3 mL的血液用Triton緩沖液混合(0.32 M蔗糖，1%的Triton100，5 mM的氯化鎂，H2O，10 mM Tris-HCl，調(diào)節(jié)pH為7.5)。H2O離心白細(xì)胞并洗滌。56 ℃下慢慢形成蛋白酶K共沉淀物，并隨后在4 ℃下用飽和NaCl溶液進(jìn)行鹽析。通過離心除去沉淀的蛋白質(zhì)。將上清液中的DNA溶解在300 μL水中。

1.4　IL-27變異基因型

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)限制性片段長度多態(tài)性方法測定所述IL-27基因-964 A/G，2905 T/G，和4730 T/C基因型。根據(jù)GenBank參照序列設(shè)計(jì)PCR引物。確認(rèn)基因分型結(jié)果，PCR擴(kuò)增的DNA樣品進(jìn)行了DNA測序檢查，結(jié)果為100%一致。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性是由Pearson相關(guān)檢驗(yàn)確定。IL-27組之間的基因型和等位基因頻率比較使用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)。適合測試Hardy-Weinberg平衡(HWE)，計(jì)算各基因型的期望頻率，并與觀測值比較，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　IL-27p28和IL-12p40的血清水平

健康對照組血清IL-27p28水平為(243.7±108.5)pg/mL,顯著高于研究組的(158.6±97.3)pg/mL，P<0.01。我們還發(fā)現(xiàn)，健康對照組血清IL-12p40的水平為(268.2±107.4)pg/mL，明顯高于研究組的(201.2±90.3)pg/mL，P<0.01。相關(guān)分析顯示，IL-27p28與IL-12p40相關(guān)(γ=0.567，P=0.004)。

2.2　血清IL-27p28和骨肉瘤臨床特點(diǎn)的關(guān)系

結(jié)果表明，Ⅲ～Ⅳ期患者血清中IL-27p28水平低于Ⅰ～Ⅱ期骨肉瘤患者(P<0.05);轉(zhuǎn)移患者血清中IL-27p28水平低于非轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)；然而，IL-27p28水平與患者的年齡，性別，腫瘤大小，組織學(xué)類型和腫瘤部位沒有相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

臨床特點(diǎn) 例數(shù)IL-27p28P年齡/歲0.534 ≥2051162.4±94.8 <20109153.6±77.3性別0.725 男105160.2±90.5 女55155.4±61.7腫瘤尺寸/cm0.186 ≥788148.8±71.2 <772166.5±96.2組織學(xué)類型0.518 成骨細(xì)胞88152.3±72.1 毛細(xì)血管擴(kuò)張20160.4±90.2 軟骨細(xì)胞17157.9±71.7 成纖維細(xì)胞18159.3±78.5 未分化17157.8±91.9腫瘤位置0.778 長管狀骨133158.4±96.5 軸向骨架27152.7±92.1臨床分期0.003 Ⅰ~Ⅱ76169.2±92.8 Ⅲ~Ⅳ84132.7±55.6轉(zhuǎn)移0.022 是56130.4±58.3 否104161.9±92.4

2.3　IL-27基因多態(tài)性與骨肉瘤血清IL-27p28水平

血清中檢測到IL-27基因多態(tài)性沒有顯著差異(-964 A/G，2905 T/G和4730 T/C)，見表2。骨肉瘤患者和對照組之間的IL-27-964 A/G，2905 T/G以及4730 T/C多態(tài)性的基因型和等位基因頻率，見表3。骨肉瘤患者和對照組之間的3種多態(tài)性的基因型分布均符合HWE協(xié)議。然而，骨肉瘤患者血清IL-27-964 A/G，2905 T/G，4730 T/C多態(tài)性的基因型和等位基因頻率與骨肉瘤的風(fēng)險無相關(guān)性(P>0.05)。

3討論

IL-27是由多個抗原呈遞細(xì)胞，諸如脂多糖刺激的單核細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的[3]。

表2　相對于血清IL-27p28水平的IL-27基因多態(tài)性

表3　2組IL-27基因多態(tài)性的基因型和等位

IL-27的生物學(xué)功能由WSX-1介導(dǎo)，其高度表達(dá)在CD4+淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中。IL-27在Th1細(xì)胞的上調(diào)以及在Th2細(xì)胞因子GATA的下調(diào)中扮演多種角色。白細(xì)胞介素-27的表達(dá)增加被認(rèn)為與多個肉芽腫性疾病，如結(jié)核病，結(jié)節(jié)病，克羅恩病有關(guān)[4]。先前的研究已經(jīng)表明，IL-27參與了多種腫瘤的發(fā)病機(jī)理。Feng等[5]表明，IL-27能夠誘導(dǎo)表達(dá)的干擾素γ誘導(dǎo)蛋白(干擾素誘導(dǎo)蛋白-10/CXCL10)和單核因子誘導(dǎo)CXCL9(單核因子誘導(dǎo)干擾素γ/CXCL9)。這兩種分子都能夠通過它們的抗血管生成的效果，抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。Yoshimoto等[6]發(fā)現(xiàn)IL-27能夠在多個WSX-1陽性人黑色素瘤中直接發(fā)揮抗增殖作用。目前的證據(jù)表明，IL-27能抑制原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤，這可能使得它成為弱免疫原性腫瘤的一種有價值的治療劑。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤患者血清IL-27p28水平顯著低于健康對照，這表明低血清水平IL-27p28可能通過降低Th1型細(xì)胞毒性應(yīng)答而導(dǎo)致骨肉瘤的發(fā)展。值得注意的是，除IL-27外，還有其他異二聚體ILS，如IL-23，IL-12，IL-35，IL-27和IL-12通過樹突細(xì)胞分泌[7]。因此，通過確定的IL-27和IL-12的血清水平，我們可以知道，IL-27低水平是否與骨肉瘤臨床情況相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，與IL-27的結(jié)果相近，骨肉瘤患者血清IL-12水平低于健康對照組，這兩個細(xì)胞因子呈正相關(guān)，這表明低血清IL-27水平在骨肉瘤患者中是很普遍的現(xiàn)象。接下來，我們調(diào)查IL-27與骨肉瘤患者臨床特征的關(guān)聯(lián);結(jié)果表明，IL-27與患者的年齡，性別，腫瘤大小，組織學(xué)類型和位置無相關(guān)性。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期骨肉瘤患者和腫瘤轉(zhuǎn)移患者的血清IL-27水平明顯降低，這表明低血清IL-27水平與骨肉瘤進(jìn)展相關(guān)。我們注意到，先前不同種族人群的流行病學(xué)研究的數(shù)據(jù)與我們的結(jié)果一致[8]。在目前的研究中，健康對照組的IL-27-964 G，2905 G和4730 C的等位基因頻率分別為0.352，0.090，和0.086。相對于所述的IL-27基因多態(tài)性與血清中IL-27p28的水平，盡管骨肉瘤患者血清IL-27p28水平較低，但我們沒有發(fā)現(xiàn)血清IL-27p28水平和IL-27基因-964 A/G，2905 T/G和4730 T/C多態(tài)性之間的差異，這表明上述3個變體不影響IL-27p28水平。

關(guān)于IL-27多態(tài)性，以前的研究已經(jīng)表明，IL-27基因的-964 A/G多態(tài)性與-964 A/G，2905 T/G和4730T/C中的單倍型與炎性腸病、哮喘、慢性阻塞性肺病的易感性相關(guān)聯(lián)。然而，在設(shè)定的腫瘤中，未發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性和單倍型與食管癌、鼻咽癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和肝細(xì)胞癌相關(guān)。我們的研究結(jié)果與腫瘤研究結(jié)果一致[9]。此外，我們還沒有發(fā)現(xiàn)-964 A/G，2905 T/G，4730T/C和骨肉瘤臨床參數(shù)之間有任何關(guān)系，這表明這些單核苷酸多態(tài)性3基因型和等位基因不是骨肉瘤的易患風(fēng)險因素[10]。

據(jù)我們所知，這是第一次研究評估IL-27基因-964 A/G，2905 T/G和4730 T/C多態(tài)性與骨肉瘤的風(fēng)險關(guān)系。我們并沒有觀察到IL-27的基因型，等位基因和單倍型與骨肉瘤風(fēng)險存在任何關(guān)聯(lián)。我們的研究結(jié)果表明，IL-27基因多態(tài)性可能不是骨肉瘤癌變的重要因素?？傊?，本研究表明，低血清IL-27p28水平可能與骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān);然而，IL-27基因多態(tài)性及其單倍型可能與骨肉瘤易患風(fēng)險無關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]毛建華,羅慶豐,劉志禮,等.LY294002 抑制成骨肉瘤細(xì)胞 U2-OS 侵襲遷徙〔J〕.實(shí)用癌癥雜志,2014,29(2)：123-125.

[2]Vignali DAA,Kuchroo VK.IL-12 family cytokines:immunological playmakers〔J〕.Nat Immunol,2012,13(8):722-728.

[3]Hunter CA.New IL-12-family members:IL-23 and IL-27,cytokines with divergent functions〔J〕.Nat Rev Immunol,2005,5(7):521-531.

[4]袁穎,金素安,何世民.中藥對 Th1/Th2 細(xì)胞因子平衡調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展〔J〕.上海中醫(yī)藥雜志,2011,45(5):90-92.

[5]Feng XM,Chen XL,Liu N,et al.Interleukin-27 upregulates major histocompatibility complex class Ⅱ expression in primary human endothelial cells through induction of major histocompatibility complex class Ⅱ transactivator〔J〕.Hum Immunol,2007,68(12):965-972.

[6]Yoshimoto T,Morishima N,Mizoguchi I,et al.Antiproliferative activity of IL-27 on melanoma〔J〕.J Immunol,2008,180(10):6527-6535.

[7]王雷,劉麗華,劉慶熠,等.抗原致敏 IL-27 基因修飾的樹突細(xì)胞活化的細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞對食管癌裸鼠移植瘤生長的影響〔J〕.解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2014,39(8):609-613.

[8]Peng Q,Qin X,He Y,et al.Association of IL27 gene polymorphisms and HBV-related hepatocellular carcinoma risk in a Chinese population〔J〕.Infect Genet Evol,2013,16:1-4.

[9]胡奕,謝川,呂農(nóng)華.白細(xì)胞介素基因多態(tài)性與胃癌關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.中華內(nèi)科雜志,2014,53(12):992-995.

[10]曾鳳彥,宋文惠,陳曉娟.CXC 趨化因子配體 10 與 1 型糖尿病〔J〕.國際內(nèi)分泌代謝雜志,2012,32(1):53-55.

(編輯：甘艷)

Associations of IL-27 Polymorphisms and Serum IL-27p28 Levels with

Osteosarcoma Risk

YUZichen.HuangbeiPeople’sHospitalofWuhan,Wuhan,430300

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the correlation of L-27 gene polymorphism and serum levels of IL-27p28 and osteosarcoma risk.MethodsA comparative study of 160 cases of osteosarcoma patients(study group) and 250 healthy patients(control group) were conducted.IL-27 gene-964 A/G,2905 T/G,and 4730 T/C polymorphism received polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism determination.ELISA serum levels of IL-27p28.ResultsCompared with the control group,the serum levels of IL-27p28 of patients with osteosarcoma were significantly lower(P<0.01).Serum levels of IL-27p28 of patients with osteosarcoma Ⅲ~Ⅳ were lower than below Ⅰ~Ⅱ patients(P<0.05).Serum levels of IL-27p28 of patients with metastasis were lowere than non-metastasis patients(P<0.05).IL-27-964 A/G,2905 T/G,4730 T/C genotype and allele frequencies and osteosarcoma risk had no correlation(P>0.05).Stratified analysis failed to show the correlation of-964 A/G,2905 T/G,and 4730 T/C polymorphism with clinical stage and metastasis of osteosarcoma(P>0.05).ConclusionLow serum levels of IL-27p28 maybe related with progression of osteosarcoma,but IL-27 gene-964 A/G,2905 T/G,and 4730 T/C polymorphism and their haplotypes are not associated risk of osteosarcoma.

【Key words】Osteosarcoma;IL-27 gene;IL-27p28;Risk Relevance

(收稿日期2015-03-24修回日期 2015-07-24)

中圖分類號：R738.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)02-0183-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.02.003