不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)流行性乙型腦炎病毒感染的影響

徐曉偉，魏建超，劉 珂，邵東華，李蓓蓓，曹瑞兵，陳溥言，馬志永，胡敬東, 邱亞峰

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095）

流行性乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是一種神經(jīng)嗜性的黃病毒[1]。該病毒通過(guò)蚊子傳播，可感染水鳥、豬、犬等多種宿主，表現(xiàn)為病毒性腦炎，又稱日本乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE）。人和馬是JEV的終末宿主。JE的分布具有一定的區(qū)域性，主要分布在南亞和東南亞地區(qū)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，JEV感染每年可導(dǎo)致10 000～15 000人死亡[2-3]。JEV感染具有重要的公共衛(wèi)生意義，但是，目前對(duì)JE的免疫致病機(jī)制的理解還不十分清楚。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體的主要免疫細(xì)胞，在宿主的先天性免疫和獲得性免疫反應(yīng)中都起著重要的作用。在蚊子叮咬過(guò)程中，巨噬細(xì)胞如朗漢斯細(xì)胞是最先識(shí)別JEV感染的免疫細(xì)胞。研究顯示，相對(duì)于非免疫細(xì)胞如Vero細(xì)胞[4]、MEF細(xì)胞等[5]，巨噬細(xì)胞具有明顯的抑制JEV感染作用，這與巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)快速及高水平的I型干擾素相關(guān)。另外，激活的巨噬細(xì)胞如IFN-γ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞，可通過(guò)促進(jìn)NO的產(chǎn)生抑制JEV的復(fù)制[6]。因此，巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)影響JEV的感染。

根據(jù)激活狀態(tài)，巨噬細(xì)胞主要分為M1型巨噬細(xì)胞（主要由Th1細(xì)胞因子如IFN-γ等誘導(dǎo)產(chǎn)生）、M2型巨噬細(xì)胞（主要由Th2細(xì)胞因子如IL-4等誘導(dǎo)產(chǎn)生）[7-8]。雖然已有的研究顯示M1型巨噬細(xì)胞可通過(guò)促進(jìn)NO的產(chǎn)生抑制JEV的復(fù)制，但是，目前對(duì)M2型巨噬細(xì)胞是影響JEV感染的具體機(jī)制還不清楚。

為了解析不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV感染的影響，本研究利用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7作為模型，分別通過(guò)IFN-γ和IL-4將巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞，分析JEV強(qiáng)毒株NJ2008[9]在巨噬細(xì)胞中的感染情況。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和病毒 C6/36細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的SF9培養(yǎng)基中，置于28℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。BHK-21細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞購(gòu)置于中科院細(xì)胞庫(kù)，于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。上述培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Thermo Fisher公司。利用C6/36細(xì)胞對(duì)JEV強(qiáng)毒株NJ2008進(jìn)行增殖，隨后對(duì)增殖好的病毒利用BHK-21細(xì)胞進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。

1.2 試劑與抗體 小鼠重組細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4購(gòu)自R&D公司；TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green qPCR Mix購(gòu)自TaKaRa公司；抗JEV NS3多克隆抗體[10]由本實(shí)驗(yàn)室保存；熒光標(biāo)記的二抗購(gòu)自Invitrogen公司 。

1.3 M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞的制備及病毒感染 將RAW264.7細(xì)胞傳至24孔培養(yǎng)板，等長(zhǎng)到70%滿時(shí)，加入細(xì)胞因子IFN-γ（終濃度100 ng/mL）或IL-4（終濃度200 ng/mL），同時(shí)設(shè)有PBS對(duì)照組。加入IFN-γ或IL-4后24 h，細(xì)胞接種10 MOI JEV毒株NJ2008，孵育2 h后，PBS洗2次，換為含有5%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)至特定感染時(shí)間時(shí)，進(jìn)行樣品的制備。

1.4 間接免疫熒光分析 首先，將滅菌玻片放入24孔板中，按照上述的方法分別制備不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞并接種10 MOI JEV毒株NJ2008。接毒后24 h，用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，進(jìn)行免疫熒光分析。利用1% NP-40打孔后，加入封閉液，室溫孵育30 min；加入一抗，室溫孵育30 min，洗滌3次；加入已稀釋好的二抗，繼續(xù)孵育30 min后，洗滌3次；加入DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，最后洗滌3次后，進(jìn)行封片；利用熒光顯微鏡進(jìn)行分析和拍照記錄。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 病毒感染24 h后，利用TRIzol試劑裂解不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行總RNA的提取，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物由Invitrogen公司合成。擴(kuò)增Arg1、iNOS及GAPDH引物序列見(jiàn)文獻(xiàn)[11]；擴(kuò)增JEV E 基因的引物序列分別為JEV E-forward：5'-CCTCCGTCACCA TGCCAGTCTTAG-3'，JEV E-reverse：5'-TTCGCC ATGGTCTTTTTCCTCTC-3'。然后，根據(jù)SYBR Green qPCR Mix的說(shuō)明書，進(jìn)行PCR反應(yīng)試劑的配置，具體的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火30 s, 40個(gè)循環(huán)。通過(guò)與內(nèi)標(biāo)GAPDH進(jìn)行比對(duì)獲得相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 JEV強(qiáng)毒株NJ2008在巨噬細(xì)胞及非巨噬細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性分析 研究表明，相對(duì)于非免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞顯示出明顯的抗JEV的作用。JEV毒株NJ2008在巨噬細(xì)胞上的感染特性，還不清楚。因此，我們對(duì)毒株NJ2008在BHK-21細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)特性進(jìn)行了分析。根據(jù)前期結(jié)果，在病毒感染前12 h，毒株NJ2008感染維持一個(gè)較低的病毒滴度（結(jié)果未顯示）。為此，本研究在病毒感染后12、24、48 h取細(xì)胞上清，通過(guò)TCID50的測(cè)定比較JEV毒株NJ2008在BHK-21細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞上的感染情況。結(jié)果顯示，盡管毒株NJ2008可以在巨噬細(xì)胞和非巨噬細(xì)胞上造成持續(xù)感染，但是，相對(duì)于在BHK-21細(xì)胞上感染增殖情況，毒株NJ2008在巨噬細(xì)胞上的復(fù)制明顯受到了抑制，具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 JEV毒株NJ2008在BHK-21細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性分析（＊ P＜0.05）Fig.1 Growth characteristics analysis of JEV strain NJ2008 on BHK-21 cells and RAW264.7 cells(＊ P＜0.05)

2.2 不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV強(qiáng)毒株NJ2008感染的影響 已有的研究顯示M1型巨噬細(xì)胞即IFN-γ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV具有明顯的抑制作用，而M2型巨噬細(xì)胞對(duì)JEV感染影響還不清楚。本研究比較了毒株NJ2008在不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞上的感染情況。鑒于在JEV感染后24 h，病毒滴度已達(dá)到高峰，本研究選擇病毒感染后24 h進(jìn)行樣品的制備。結(jié)果顯示，相對(duì)于PBS組，M1型巨噬細(xì)胞顯著地抑制JEV的復(fù)制，培養(yǎng)上清中檢測(cè)不到病毒；相對(duì)于PBS組，JEV對(duì)M2型巨噬細(xì)胞的感染沒(méi)有發(fā)生顯著的變化，結(jié)果詳見(jiàn)圖2。

利用間接免疫熒光方法檢測(cè)不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV感染的影響。在感染JEV毒株NJ2008后24 h，IFN-γ處理組未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性感染細(xì)胞，但是，PBS處理組和IL-4處理組發(fā)現(xiàn)了很多感染細(xì)胞，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 感染JEV毒株NJ2008的不同激活狀態(tài)巨噬細(xì)胞上清中病毒滴度分析Fig.2 Virus titer analysis in supernatants of different activated macrophages infected with JEV strain NJ2008

2.3 不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞影響JEV感染的可能機(jī)制 巨噬細(xì)胞抑制JEV感染的機(jī)制可能有多種，有研究顯示M1型巨噬細(xì)胞即IFN-γ處理的巨噬細(xì)胞主要通過(guò)誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生介導(dǎo)抗JEV的作用。進(jìn)一步，在巨噬細(xì)胞中，NO產(chǎn)生取決于誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）和精氨酸酶1（Arg1）的表達(dá)情況，同時(shí)，iNOS和Arg1分別為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞的指示標(biāo)志。最后，我們利用相對(duì)定量PCR對(duì)調(diào)控NO產(chǎn)生的iNOS和Arg1的表達(dá)情況以及JEV的感染情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，相對(duì)于PBS處理組，IL-4處理組顯著地上調(diào)Arg1的表達(dá)并抑制iNOS的表達(dá)（圖4），從而降低iNOS/Arg1的比值（ratio=0.0005）；而IFN-γ處理組也可上調(diào)Arg1的表達(dá)，但更顯著上調(diào)iNOS的表達(dá)（圖4），從而顯著上調(diào)iNOS/Arg1的比值（ratio=13.266）。此外，熒光定量PCR結(jié)果顯示，相對(duì)于PBS組，IFN-γ處理組中的E基因的水平顯著降低，而IL-4處理組中E基因的水平?jīng)]有差異（圖5），與上述TICD50和間接免疫熒光的結(jié)果相符。

圖3 間接免疫熒光法分析NJ2008在不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞上的感染情況Fig.3 Analysis of JEV strain NJ2008 infection in differential activation of macrophages by IFA

3 討論

巨噬細(xì)胞作為一種重要的免疫細(xì)胞，在宿主免疫防御中起著重要的作用。本研究結(jié)果表明，相對(duì)于非免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的抑制JEV感染的作用。進(jìn)一步的研究表明，不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV感染的作用不同：相對(duì)于非激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞（PBS處理組）或M2型巨噬細(xì)胞，Ⅰ型巨噬細(xì)胞顯示出明顯的抑制JEV感染的作用；而M2型巨噬細(xì)胞，相對(duì)于PBS組并沒(méi)有顯示出明顯的抑制或促進(jìn)JEV感染的作用。本研究較系統(tǒng)地比較了不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV感染的影響，為將來(lái)揭示巨噬細(xì)胞在JEV感染中作用提供參考和依據(jù)。

圖4 熒光定量PCR分析iNOS(A)和Arg1(B)在不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞上的表達(dá)情況（＊P＜0.05）Fig.4 Expression analysis of iNOS(A) and Arg1(B)in different infected macrophages by real-time qPCR(＊P＜0.05)

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析JEV E基因在不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞上的表達(dá)水平（＊P＜0.05）Fig.5 Quantitative analysis of JEV E gene in different infected macrophages by real-time qPCR(＊P＜0.05)

JEV感染巨噬細(xì)胞維持一個(gè)相對(duì)較低的病毒滴度。首先，這與JEV感染巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生相關(guān)。他人研究顯示JEV感染巨噬細(xì)胞RAW264.7后12 h已激活I(lǐng)型干擾素的產(chǎn)生，從而限制病毒的擴(kuò)散，抑制已感染細(xì)胞中病毒的復(fù)制[4]。相對(duì)于I型干擾素，IFN-γ主要通過(guò)誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生抑制JEV的復(fù)制[6]。在巨噬細(xì)胞中，Th1型細(xì)胞因子IFN-γ顯著上調(diào)iNOS的表達(dá)，繼而上調(diào)表達(dá)的iNOS可利用精氨酸促進(jìn)NO的產(chǎn)生；相對(duì)而言，Th2型細(xì)胞因子IL-4顯著上調(diào)Arg1的表達(dá)，然而Arg1僅消耗精氨酸不產(chǎn)生NO。為此，在巨噬細(xì)胞中iNOS/Arg1的比值對(duì)巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)以及NO的產(chǎn)生具有指導(dǎo)作用。本研究顯示IFN-γ誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)較高水平的iNOS，并且明顯地抑制JEV的感染，這一結(jié)果與上述結(jié)果相符。因此，這些結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗JEV感染的作用，不僅可通過(guò)快速產(chǎn)生I型干擾素抑制病毒的感染，而且可通過(guò)誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生進(jìn)一步發(fā)揮抗JEV感染的作用。

Th2免疫反應(yīng)促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生。有研究顯示，Th2免疫反應(yīng)對(duì)JEV感染具有保護(hù)作用，這主要是與Th2免疫反應(yīng)抑制促炎性因子的表達(dá)，同時(shí)，也與增加JEV特異的抗體滴度相關(guān)[12]。然而，對(duì)Th2免疫反應(yīng)誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞在JEV感染中的作用還不清楚。我們研究結(jié)果顯示，盡管Th2細(xì)胞因子抑制促炎性因子的產(chǎn)生（結(jié)果未顯示），促進(jìn)Arg1的產(chǎn)生，但有意思的是，與PBS組相比，M2型巨噬細(xì)胞并未抑制JEV的復(fù)制。這一結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了Th2免疫反應(yīng)介導(dǎo)的抗JEV作用，主要與抑制促炎性因子的產(chǎn)生及增加病毒特異的體液免疫反應(yīng)相關(guān)。

總之，本研究通過(guò)體外試驗(yàn)明確了M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞對(duì)JEV感染的影響，不僅豐富JEV與巨噬細(xì)胞相互作用的知識(shí)，而且為將來(lái)進(jìn)一步揭示巨噬細(xì)胞作為一種抗原提呈細(xì)胞在JEV感染中的作用奠定基礎(chǔ)。