藏靈菇源酵母菌和乳酸菌降膽固醇蛋乳發(fā)酵飲料的研制

張 晶，張紅星，謝遠(yuǎn)紅，劉 慧*

（1.北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206）

隨著生活水平的不斷提高，人們對飲料產(chǎn)品的功效要求越來越高。國內(nèi)外已有蛋乳發(fā)酵飲料研制成功的報道，但大多利用普通酸奶菌種研制而成，并沒有降低膽固醇的功效。藏靈菇中含有60%～70%的乳酸菌，其他為酵母菌、醋酸菌等[1]。人們直接將藏靈菇添加到經(jīng)加熱滅菌，冷卻后的牛乳中，使之發(fā)酵而生成具有酸味和起泡性的酒精性保健飲料[2]，長期飲用該種飲料可以調(diào)節(jié)血清膽固醇水平，改善動脈硬化，預(yù)防心臟病等病癥。劉慧等[2-6]研究表明，藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3、干酪乳桿菌KL1、嗜熱鏈球菌Tx、乳酸乳球菌乳酸亞種KS4菌株在體內(nèi)、體外具有較強(qiáng)的降膽固醇功效。有關(guān)利用藏靈菇源乳酸菌和酵母菌制備降膽固醇蛋乳飲料尚未見國內(nèi)外文獻(xiàn)報道。降膽固醇蛋乳飲料是以雞蛋和牛奶為原料，采用藏靈菇源乳酸菌和酵母菌進(jìn)行二次混合發(fā)酵研制而成的，亞健康人群通過飲用該種飲料可達(dá)到預(yù)防高膽固醇血癥的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）M3、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、Tx干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）KL1、乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）KS4，均從吉林藏靈菇中篩選得到，并鑒定為產(chǎn)生膽鹽水解酶[7-9]，具有降低膽固醇功能的菌株。

材料：新鮮雞蛋、蒙牛純牛奶、綿白糖（市售）。

試劑：鄰苯二甲醛、無水乙醇、冰醋酸、濃硫酸、甲醇、氯仿、膽固醇、氫氧化鈉（分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

BCD-301型冰箱：青島海爾；LS-B5OL型立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；GHP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-LJ-IFD型潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BS224S型分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HZS-HA型水浴振蕩器：哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；DT-10d型高精度循環(huán)恒溫水浴槽：北京德天佑科技發(fā)展有限公司；22PC型可見分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵液的制備

（1）乳酸菌發(fā)酵液的制備

將活化好的KL1、Tx、KS4三株菌按2%的接種量分別移入滅菌牛奶三角瓶中，37℃培養(yǎng)12h。一次發(fā)酵接種前將3株菌按1∶1∶1的比例混合使用。

（2）酵母菌發(fā)酵液的制備

將活化好的M3菌種按1%～2%的接種量移入滅菌牛奶三角瓶中，28℃培養(yǎng)20h～24h備用。

1.3.2 飲料的工藝流程

1.3.3 降膽固醇蛋乳發(fā)酵飲料二次發(fā)酵條件確定

（1）發(fā)酵溫度的選擇：一次發(fā)酵（乳酸菌發(fā)酵）條件：3%總接種量，接種比例KL1∶KS4∶TX=1∶1∶1，43℃發(fā)酵8h。二次發(fā)酵（酵母菌發(fā)酵）M3菌株接種量為2%，發(fā)酵時間為24h，發(fā)酵溫度分別為26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，每組3個重復(fù)。將產(chǎn)品4℃后熟24h，以感官評分為試驗指標(biāo)確定發(fā)酵溫度。

（2）發(fā)酵時間的選擇：在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，M3菌株接種量為2%，發(fā)酵時間分別為20h、24h、28h、32h、36h，每組3個重復(fù)。將產(chǎn)品4℃后熟24h，以感官評分為試驗指標(biāo)確定發(fā)酵時間。

（3）接種量的選擇：在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，M3菌株接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%，每組3個重復(fù)。將產(chǎn)品4℃后熟24h，以感官評分為試驗指標(biāo)確定接種量。

1.3.4 正交試驗優(yōu)化二次發(fā)酵條件

選擇發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量為試驗因素，采用3因素3水平正交試驗優(yōu)化二次發(fā)酵條件，以后熟前后感官評分為試驗指標(biāo)確定降膽固醇蛋乳發(fā)酵飲料最佳發(fā)酵條件。

表1 蛋乳發(fā)酵飲料發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of egg and milk beverage

1.3.5 試驗指標(biāo)測定方法

（1）酸度的測定

方法見參考文獻(xiàn)[10]。

（2）感官評分標(biāo)準(zhǔn)

選經(jīng)過訓(xùn)練的10人根據(jù)感官評分標(biāo)準(zhǔn)對產(chǎn)品進(jìn)行感官評價。評分標(biāo)準(zhǔn)（滿分為20分）如下：

A、B、C、D四種指標(biāo)，分別為色澤、口感、滋味、香氣，每項滿分5分，總共20分。

A色澤：色澤呈現(xiàn)出蛋乳的純色4～5分，色澤過黃或偏白0～3分；B口感：口感細(xì)膩、幼滑4～5分，口感粗糙有結(jié)塊0～3分；C滋味：酸甜適中、無澀味4～5分，滋味偏淡、無明顯特點2～3分，酸甜不適、有明顯澀味0～1分；D香氣：有明顯醇香和奶香4～5分，醇香氣味較淡0～3分。

（3）酒精度的測定

方法見參考文獻(xiàn)[10]。

（4）膽固醇的測定

①膽固醇含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：膽固醇及其脂類在硫酸作用下與鄰苯二甲醛產(chǎn)生紫紅色物質(zhì)，此物質(zhì)在波長550nm處有極大吸收，用比色法測定總膽固醇含量。按表2操作加入各種試劑于比色管中，在20℃～37℃靜置10min[11]。以試劑空白調(diào)零，立即于紫外可見分光光度計波長550nm處測定吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立膽固醇含量與A550nm值線性回歸方程為y=0.0026x+0.0364（R2=0.9943）。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制Table 2 Solution preparation of standard curve

②鄰苯二甲醛法測定蛋乳發(fā)酵飲料中膽固醇含量：試管中加入發(fā)酵蛋奶樣品1.00g，然后加入2mL～3mL甲醇氯仿混合液，混勻，于45℃水浴加熱15min，過濾于具塞比色管，并補(bǔ)充甲醇氯仿混合液至10mL。取上述樣品處理液0.4mL，然后加入1000mg/L鄰苯二甲醛0.2mL、混合酸4.0mL，在20℃～37℃靜置10min。以試劑空白（甲醇氯仿混合液0.4mL、鄰苯二甲醛0.2mL、混合酸4.0mL）調(diào)零，于波長550nm處測定樣品的吸光度值，根據(jù)線性回歸方程計算樣品膽固醇含量，再計算膽固醇的降低率。

2 結(jié)果與分析

2.1 降膽固醇蛋乳發(fā)酵飲料二次發(fā)酵條件確定

2.1.1 發(fā)酵溫度的確定

圖1 發(fā)酵溫度對產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effects of fermentation temperature on sensory quality of the product

酵母菌最適生長溫度一般為25℃～28℃，不同發(fā)酵溫度影響菌體產(chǎn)生的酒精含量，進(jìn)而影響飲料感官指標(biāo)[12]。由圖1可知，34℃時產(chǎn)品感官評分最高，口感細(xì)膩，酸甜適宜，醇香濃郁；30℃和32℃時產(chǎn)品口感粗糙，醇香過濃，感官評分較低；26℃和28℃時產(chǎn)品口味不協(xié)調(diào)，滋味偏淡，感官評分最低。

2.1.2 發(fā)酵時間的確定

圖2 發(fā)酵時間對產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響Fig.2 Effects of fermentation time on sensory quality of the product

不同發(fā)酵時間影響酵母菌產(chǎn)生的酒精含量。發(fā)酵時間過短時，產(chǎn)生的酒精含量較少；發(fā)酵時間過長時，會使菌體發(fā)生自溶，產(chǎn)生酵母臭味，導(dǎo)致產(chǎn)品風(fēng)味變劣。由圖2可見，發(fā)酵24h的產(chǎn)品酸甜適中，醇香適宜，口味協(xié)調(diào)；20h時由于發(fā)酵時間太短，產(chǎn)品滋味、醇香氣味較淡；28h、32h、36h時產(chǎn)品口感及風(fēng)味較差。

2.1.3 接種量的確定

不同接種量影響酵母菌產(chǎn)生的酒精含量。接種量過低，產(chǎn)生酒精含量較少；接種量過高，后期產(chǎn)生酒精含量過多，導(dǎo)致產(chǎn)品風(fēng)味變劣。由圖3可知，接種量為1%時的飲料口感最好且香氣怡人，接種量為2%～5%時產(chǎn)品口感及風(fēng)味較差。

2.2 正交試驗優(yōu)化二次發(fā)酵條件

影響飲料感官指標(biāo)的主要因素有發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量等，根據(jù)R值大小可以直觀分析試驗因素的主次順序，再利用方差分析進(jìn)行檢驗。由表3可知，RB＞RA＞RC，RB'＞RA'＞RC'，即發(fā)酵時間是影響產(chǎn)品感官指標(biāo)的主要因素，發(fā)酵溫度次之，接種量影響最小。由表4、表5可見，不同發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對產(chǎn)品感官指標(biāo)影響極顯著（p＜0.01），接種量對產(chǎn)品感官指標(biāo)影響不顯著。由表4可知，KA3＞KB2＞KC1，KA3'＞KB2'＞KC1'，二次發(fā)酵條件最佳組合為A3B2C1，即發(fā)酵溫度34℃，發(fā)酵時間24h，接種量1%。在此最佳條件下，產(chǎn)品感官評分為18分。

圖3 接種量對產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響Fig.3 Effects of inoculum on sensory quality of the product

表3 蛋乳發(fā)酵飲料發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Fig.3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of egg and milk beverage

2.3 產(chǎn)品酸度測定

由圖4可見，產(chǎn)品后熟前后的酸度變化不大，說明藏靈菇源乳酸菌后熟期間產(chǎn)酸緩慢，有助于解決產(chǎn)品后酸化過快，導(dǎo)致乳品感官質(zhì)量下降及保質(zhì)期短等問題，從而保證產(chǎn)品質(zhì)量。

表4 后熟前正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results before post-fermentation

表5 后熟后正交試驗結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results after post-fermentation

圖4 產(chǎn)品后熟前與后熟后酸度對比Fig.4 Comparison of acidity between before and after post-fermentation

2.4 產(chǎn)品膽固醇和酒精度含量的測定

表6 產(chǎn)品膽固醇含量測定結(jié)果Table 6 Determination results of cholesterol content of the product

表7 產(chǎn)品酒精度測定結(jié)果Table 7 Determination results of alcoholic content of the product

由表6可知，一次發(fā)酵前、一次發(fā)酵后、二次發(fā)酵后熟前后，膽固醇含量明顯下降，說明藏靈菇源乳酸菌和酵母菌在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生膽鹽水解酶[13-15]，從而降低了原料中的膽固醇。由于酵母菌在二次發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生大量的膽鹽水解酶，因而二次發(fā)酵后熟前比一次發(fā)酵的膽固醇含量降低了38.96個百分點；飲料后熟后的膽固醇含量比后熟前又下降了3.22個百分點，說明低溫有利于膽鹽水解酶的產(chǎn)生。由表7可知，產(chǎn)品酒精度為0.5g/100mL～1.0g/100mL，且后熟前后酒精含量變化不大，適合眾多人群飲用。

3 結(jié)論

3.1 發(fā)酵時間是影響產(chǎn)品感官指標(biāo)的主要因素，發(fā)酵溫度次之，接種量影響最小。通過正交試驗確定二次發(fā)酵最佳條件為發(fā)酵溫度34℃，發(fā)酵時間24h，接種量1%。

3.2 通過乳酸菌一次發(fā)酵和酵母菌二次發(fā)酵，產(chǎn)品膽固醇含量的降低率分別為32.81%和71.77%，二次發(fā)酵后熟之后的膽固醇含量降低率為74.99%，說明藏靈菇源酵母菌M3菌株具有良好的降膽固醇作用。

3.3 產(chǎn)品酒精度為0.5g/100mL～1.0g/100mL，且后熟前后酒精含量變化不大，適合眾多人群飲用。產(chǎn)品色澤柔和，呈乳黃色，淡淡的奶香伴著醇香，口感酸甜適中，是一種集營養(yǎng)與保健為一體的功能性飲料。

[1]岳 春，馬長新，楊慧靜.藏靈菇菌發(fā)酵麥芽汁飲料的研究[J].中國釀造，2012，31（8）：183-184.

[2]劉 慧，熊利霞.藏靈菇中高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選及其發(fā)酵性能的研究[J].食品科學(xué)，2007，28（5）：211-215.

[3]劉 慧，陳湘寧，張紅星，等.藏靈菇酵母菌M3耐胃腸道逆環(huán)境特性及降膽固醇的實驗研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25（15）：60-63.

[4]LIU H,XIONG L X,ZHANG H X,et al.Effect and mechanism of cholesterol-lowering byKluyveromycesfrom Tibetan kefir[J].Adv Mater Res，2012，343-344：1290-1298.

[5]LIU H,XIE Y H,ZHANG H X,et al.Studies on the action mechanism for cholesterol-lowering ofLactobacilluswhich yields bile salt hydrolase from kefir grains[J].Adv Mater Res，2013，781-784：1336-1340.

[6]劉 慧，王世平，張紅星，等.藏靈菇源酸奶復(fù)合菌發(fā)酵劑對大鼠肝臟膽固醇的作用[J].中國食品學(xué)報，2010，10（2）：35-39.

[7]劉 慧，潘昌莉，張紅星，等.蔵靈菇源克魯維酵母M3菌株膽鹽水解酶的特性研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25（24）：102-107.

[8]劉 慧，熊利霞，張紅星，等.藏靈菇源干酪乳桿菌KL1高產(chǎn)膽鹽水解酶發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24（12）：114-118.

[9]劉 慧，杜 薇，張紅星.乳酸乳球菌乳酸亞種高產(chǎn)膽鹽水解酶發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[J].食品科學(xué)，2006，27（11）：322-326.

[10]劉 慧.現(xiàn)代食品微生物學(xué)實驗技術(shù)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2006.

[11]丁卓平，王明華，劉振華，等.食品中膽固醇含量測定方法的研究與比較[J].食品科學(xué)，2004，25（1）：130-135.

[12]金 慧，劉榮厚.溫度對固定化酵母酒精分批發(fā)酵的影響及動力學(xué)模型[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2009（25）：258-261.

[13]韓俊華，盛曉甘，張柏林，等.乳酸菌降膽固醇作用研究現(xiàn)狀[J].中國乳品工業(yè)，2002（3）：16-20.

[14]潘昌莉，張紅星，劉 慧，等.藏靈菇源克魯維酵母M3菌株膽鹽水解酶的分離純化研究[J].中國釀造，2011，30（3）：58-62.

[15]王玉文，王延祥，李平蘭，等.膽鹽水解酶的分離純化與部分特性研究[J].中國食品學(xué)報，2007（7）：36-40.