dTDP-L-鼠李糖生物合成路徑的電噴霧多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜法表征

許瑩瑩，董晨影，周大煒,2,3

(1.南開大學(xué)泰達(dá)生物技術(shù)研究院，天津　300457；2.天津市微生物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津　300457；

3.南開大學(xué)分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津　300457)

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dTDP-L-鼠李糖生物合成路徑的電噴霧多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜法表征

許瑩瑩1，董晨影1，周大煒1,2,3

(1.南開大學(xué)泰達(dá)生物技術(shù)研究院，天津300457；2.天津市微生物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；

3.南開大學(xué)分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457)

摘要：本研究以2’-脫氧胸苷-5’-二磷酸-L-鼠李糖(dTDP-L-Rha)生物合成路徑涉及的系列酶促反應(yīng)產(chǎn)物為研究對(duì)象，建立了電噴霧碰撞誘導(dǎo)解離串聯(lián)質(zhì)譜(CID-ESI-MSspan)對(duì)罕見單糖生物合成路徑的表征方法。該方法首先通過ESI-MS技術(shù)分析2’-脫氧胸苷-5’-二磷酸-D-葡萄糖-4,6-脫氫酶(RmlB)、2’-脫氧胸苷-5’-二磷酸-4-酮-6-脫氧-葡萄糖-3,5異構(gòu)酶(RmlC)和2’-脫氧胸苷-5’-二磷酸-4-酮-鼠李糖還原酶(RmlD)酶活產(chǎn)物的形成，隨后應(yīng)用CID-ESI-MSspan技術(shù)對(duì)酶促反應(yīng)終產(chǎn)物L(fēng)-鼠李糖(dTDP-L-Rha)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。結(jié)果表明：dTDP-L-Rha 的生物合成始于2’-脫氧胸苷-5’-二磷酸-D-葡萄糖(dTDP-D-Glc)，依次涉及RmlB、RmlC 和RmlD 三個(gè)酶的參與。這與傳統(tǒng)的高效液相色譜法(HPLC)監(jiān)測、純化制備，核磁共振(NMR)及ESI-MS結(jié)構(gòu)表征的分析結(jié)果一致。該方法簡單、靈敏、快速，適用于重要罕見單糖生物合成路徑的表征。

關(guān)鍵詞：罕見單糖；dTDP-L-鼠李糖；生物合成路徑；電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)

doi：10.7538/zpxb.youxian.2015.0045

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-09-09；網(wǎng)絡(luò)出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20150909.1515.012.html

在植物、真菌和細(xì)菌次生代謝物結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的罕見單糖是自然界一類重要的碳水化合物，具有抗癌、抗病毒、抗真菌和抗菌活性。這些次生代謝物分子的糖部分通常發(fā)生不同程度的脫氧化，進(jìn)而參與藥物靶點(diǎn)的分子識(shí)別。大量的結(jié)構(gòu)和功能研究表明，罕見單糖對(duì)其母體化合物的生物活性必不可少[1]。罕見單糖(各種活化核苷二磷酸(dNDP)-脫氧己糖)的生物合成路徑重點(diǎn)涉及核苷二磷酸(dNDP)-己糖上C-2、C-3、C-4和C-6 羥基的脫氧，異構(gòu)化，氨基化，甲?；?，乙酰基化和甲基化轉(zhuǎn)化。近年來，一些研究結(jié)果已清楚地表明，為數(shù)眾多的罕見單糖僅存在于特殊種類的細(xì)菌中，而且，細(xì)菌表面酯寡糖化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有罕見單糖的O-抗原更容易逃避宿主細(xì)胞的免疫識(shí)別[2]。例如，L-鼠李糖(dTDP-L-Rha)生物合成路徑的破壞在嚴(yán)重影響其生存的同時(shí)，也大大減弱了毒性，但該生物合成路徑至今仍未在人類中發(fā)現(xiàn)[3]。在細(xì)菌，尤其是病原菌的形成和進(jìn)化過程中，罕見單糖起著非常關(guān)鍵的作用。為確定涉及病原菌致病機(jī)理的關(guān)鍵靶點(diǎn)，需要更好地理解上述罕見單糖的生物合成路徑。

dTDP-L-Rha的生物合成路徑示于圖1，目前該路徑的表征方法有高效液相色譜(HPLC)法和光譜法[4-6]等，但這些方法普遍存在樣品用量大、耗時(shí)長、實(shí)驗(yàn)程序繁瑣等缺點(diǎn)。特別是在酶活反應(yīng)體系較復(fù)雜(多酶偶聯(lián)反應(yīng)或含多種輔因子等)的情況下，需要分析化學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)人員探索適宜的分離條件。

近年來，電噴霧電離(ESI)離子化方式的發(fā)展和成熟，特別是碰撞誘導(dǎo)解離(CID)技術(shù)的應(yīng)用以及多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為糖精細(xì)結(jié)構(gòu)的解析提供了技術(shù)平臺(tái)[7-8]。因此，結(jié)合已知的罕見單糖生物合成途徑的專業(yè)知識(shí)，可以完成罕見單糖合成酶酶活的監(jiān)測和生物合成路徑的表征工作。本研究以高效液相色譜法和核磁共振(NMR)技術(shù)已證明的生物合成途徑的罕見單糖dTDP-L-Rha為研究模型，嘗試通過電噴霧離子阱質(zhì)譜(ESI-IT-MS)技術(shù)分析2’-脫氧胸苷-5’-二磷酸-D-葡萄糖4, 6-脫氫酶(dTDP-D-glucose 4,6-dehydratase, RmlB)、2’-脫氧胸苷-4-酮-6-脫氧-葡萄糖-3,5異構(gòu)酶(dTDP-4-keto-6-deoxy-glucose-3,5 epimerase, RmlC)、2’-脫氧胸苷-4-酮-鼠李糖還原酶(dTDP-4-keto-rhamnose reductase,RmlD) 酶活產(chǎn)物的形成；并在應(yīng)用電噴霧碰撞誘導(dǎo)解離串聯(lián)質(zhì)譜(CID-ESI-MSn)技術(shù)對(duì)酶促反應(yīng)終產(chǎn)物dTDP-L-Rha結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征的基礎(chǔ)上，建立簡單、高效、靈敏和準(zhǔn)確的罕見單糖生物合成路徑表征方法，以期為研究病原菌中罕見單糖生物合成涉及的酶奠定基礎(chǔ)。

圖1　dTDP-L-Rha的生物合成路徑Fig.1　Biosynthesis pathway of dTDP-L-Rha

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Finnigan LCQ Advantage MAX電噴霧離子阱質(zhì)譜儀：美國Thermo Electron公司產(chǎn)品。

脫氧胸苷二磷酸葡萄糖(dTDP-Glc)：美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；大腸桿菌O7中RmlB、RmlC和RmlD基因的克隆，含相應(yīng)重組質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)，以及上述3個(gè)表達(dá)產(chǎn)物的純化制備等按文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行；甲醇、乙腈：均為色譜純，美國Fisher公司產(chǎn)品；水為二次重蒸水。

1.2主要材料

1.2.1RmlB酶活反應(yīng)40 μL酶活反應(yīng)體系的組成：將3 mmol/L dTDP-D-Glc，5 mmol/L MgCl2，0.26 μmol/L RmlB和50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)在37 ℃溫育1 h，反應(yīng)結(jié)束后，在沸水浴中加熱3 min，以12 000 r/min離心5 min。取上清液，加入1 mL二次重蒸水，混勻后過再生的Envi-Carb柱，用2 mL冷二次重蒸水緩慢洗脫雜質(zhì)，然后以1 mL已預(yù)熱的50 ℃乙腈-水溶液(1∶1，V/V)洗脫酶促反應(yīng)產(chǎn)物。經(jīng)Envi-Carb柱前處理的產(chǎn)物混合物直接用于電噴霧離子化-離子阱多級(jí)質(zhì)譜分析。

1.2.2RmlB、RmlC和RmlD三酶偶聯(lián)反應(yīng)40 μL三酶(RmlB、RmlC 和RmlD)偶聯(lián)酶促反應(yīng)體系的組成：將3 mmol/L dTDP-D-Glc，5 mmol/L MgCl2，4 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，0.26 μmol/L RmlB，0.32 μmol/L RmlC，0.48 μmol/L RmlD和50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)在37 ℃溫育2 h，其他步驟同1.2.1節(jié)。

1.3ESI-MS條件

流動(dòng)注射泵進(jìn)樣，進(jìn)樣量0.2 mL/min，負(fù)離子檢測模式，噴霧電壓-4.5 kV，殼氣(N2)流速35個(gè)單位，金屬毛細(xì)管溫度220 ℃，碰撞氣為氮?dú)猓o助氣體為氦氣，碰撞能量20~35 eV。

2結(jié)果與討論

2.1負(fù)離子模式下，RmlB酶活性的ESI-CID-MS/MS分析

負(fù)離子模式下，RmlB酶促反應(yīng)產(chǎn)物的ESI-CID-MS譜圖示于圖2。由圖2可見，以m/z545.1 [M-H]-為前體離子，可以觀察到4個(gè)源于磷酸二酯鍵部分碎裂的MS2產(chǎn)物離子，分別為m/z321.0 [dTMP-H]-，m/z382.9 [dTDP-H2O-H]-，m/z222.9 [M-dTMP-H]-、m/z303.0 [M-dT-H]-，以及源于糖苷鍵斷裂的產(chǎn)物離子m/z400.9 [dTDP-H]-。

在圖2中，特征碎片離子m/z401、383和321分別對(duì)應(yīng)核苷分子離子[TDP-H]-以及該離子失去水分子和磷酸基得到的碎片離子，這與已發(fā)表的dTDP數(shù)據(jù)一致[9-10]。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了初始受體底物的TDP基團(tuán)并沒有受到酶活反應(yīng)的影響；從2個(gè)特征碎片離子m/z223 [M-dTMP-H]-和m/z303 [M-dT-H]-的存在，可以推斷糖環(huán)上發(fā)生了脫水反應(yīng)。

注：MS2m/z 545.1→圖2　RmlB催化反應(yīng)產(chǎn)物的ESI-CID-MS譜圖Fig.2　ESI-CID-MS spectrum of RmlB product

2.2負(fù)離子模式下，RmlB，RmlC和RmlD三酶偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物的ESI-CID-MS/MS分析

負(fù)離子模式下，三酶酶促偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物的ESI-CID-MS譜圖示于圖3。從圖3可見，以m/z547.1 [M-H]-為前體離子，可以觀察到4個(gè)源于磷酸二酯鍵部分碎裂的MS2產(chǎn)物離子，分別為m/z321.0 [dTMP-H]-，m/z382.9 [dTDP-H2O-H]-，m/z225.1 [M-dTMP-H]-、m/z305.0 [M-dT-H]-，以及源于糖苷鍵斷裂的產(chǎn)物離子m/z400.9 [dTDP-H]-和脫水碎片離子m/z529.1。

在圖3中，特征碎片離子m/z401、383和321分別對(duì)應(yīng)核苷分子離子[TDP-H]-以及該離子失去水分子和磷酸基得到的碎片離子，這與已發(fā)表的dTDP數(shù)據(jù)一致[7-8]。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了初始受體底物的TDP基團(tuán)并沒有受到酶活反應(yīng)的影響；從2個(gè)特征碎片離子m/z225 [M-dTMP-H]-和m/z305 [M-dT-H]-的存在，可以推斷4-酮-Rha的糖環(huán)上發(fā)生了氫化還原反應(yīng)。

注：MS2m/z 547.1→圖3　三酶酶促偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物的ESI-CID-MS譜圖Fig.3　ESI-CID-MS spectrumof three-enzyme tandem reaction product

2.3RmlD酶活產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)的ESI-MSn法表征

負(fù)離子模式下，RmlD酶活產(chǎn)物的質(zhì)譜圖示于圖4。從圖4a可見，以m/z225.1為前體離子，碎片離子m/z78.86 [PO3]-源于磷酸與戊糖之間糖苷鍵的斷裂；碎片離子m/z180.9([0,4X]-，[M-dTMP-C2H4O-H]-)、m/z151.0([0,3X]-，[M-dTMP-C3H6O2-H]-)和m/z120.9([0,2X]-，[M-dTMP-C4H8O3-H]-)源于4-酮-Rha開環(huán)。其裂解途徑與Wolucka等[10-11]對(duì)葡萄糖、半乳糖及甘露糖等-1-磷酸衍生物質(zhì)譜碎裂規(guī)律的研究結(jié)果一致。

從圖4b可見，以m/z321.0為前體離子，碎片離子m/z195.0 [dTMP-dT-H]-和m/z125.1 [dT-H]-源于脫氧胸腺嘧啶與戊糖之間糖苷鍵的斷裂；碎片離子m/z96.8[H2PO4]-源于磷酸與戊糖之間糖苷鍵的斷裂；碎片離子m/z176.9源于m/z195.0脫掉一分子水。

注：a.MS3m/z 547.1→ 225.1 →；b.MS3m/z 547.1→ 321.0 →；c.MS4m/z 547.1→321.0→194.9→圖4　dTDP-L-Rha的ESI-CID-MSn譜圖Fig.4　ESI-CID-MSnspectrum of dTDP-L-Rha

從圖4c可見，以m/z194.9為前體離子，碎片離子m/z177.0源于m/z194.9脫掉一分子水；碎片離子m/z97.0源于磷酸與戊糖之間糖苷鍵的斷裂；碎片離子m/z79.0源于m/z97.0脫掉一分子水。

在RmlD酶活產(chǎn)物的三級(jí)質(zhì)譜圖中(圖3a)，碎片離子m/z151.0 [0,3X]-源于RmlD酶活產(chǎn)物鼠李糖糖環(huán)上C0-C3鍵的跨環(huán)斷裂，排除了氫化還原反應(yīng)發(fā)生在4-酮-Rha糖環(huán)2-位和3-位的可能；碎片離子m/z180.9 [0,4X]-源于RmlD酶活產(chǎn)物4-酮-Rha糖環(huán)上C0-C4鍵的跨環(huán)斷裂，排除了氫化還原反應(yīng)發(fā)生在4-酮-Rha糖環(huán)6-位的可能，因此可確認(rèn)RmlB具有dTDP-Glc糖環(huán)上C-6脫水活性。綜上，可以推斷4-酮-Rha糖環(huán)4-位發(fā)生了氫化還原反應(yīng)。

通過質(zhì)量數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)RmlB和RmlD產(chǎn)物ESI-CID-MS的碎片離子主要源于糖苷鍵和磷酸二酯鍵的斷裂，提供的核苷糖骨架信息可證實(shí)糖環(huán)上發(fā)生了脫水和氫化還原反應(yīng)。負(fù)離子模式下，從RmlD酶活產(chǎn)物三級(jí)譜圖可觀察到的，以及可提供重要區(qū)域選擇性信息的跨環(huán)斷裂碎片離子表明：dTDP-Glc糖環(huán)的6-位和4-位分別發(fā)生了脫水和氫化還原反應(yīng)。

3結(jié)論

負(fù)離子模式下，RmlB、RmlC和RmlD酶促反應(yīng)混合物的MS2、MS3和MS4譜圖表明：dTDP-L-Rha的生物合成路徑涉及C-6脫水(RmlB)和C-4氫化還原反應(yīng)(RmlC、RmlD)，該結(jié)果與文獻(xiàn)[6]的分析結(jié)果一致。本研究建立了簡單、靈敏、快速的罕見單糖生物合成路徑表征方法，對(duì)O-抗原生物合成路徑中細(xì)菌罕見單糖合成酶功能的高通量準(zhǔn)確鑒定具有普遍適用性，也將對(duì)細(xì)菌O抗原合成機(jī)理的探索，以及利用實(shí)驗(yàn)探索O抗原在細(xì)菌生存和致病性中所扮演的角色奠定基礎(chǔ)。

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Characterization of Biosynthetic Pathway of the dTDP-L-Rha

by Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry

XU Ying-ying1, DONG Chen-ying1, ZHOU Da-wei1,2,3

(1.TEDAInstituteofBiologicalSciencesandBiotechnology,NankaiUniversity,Tianjin300457,China;

2.EngineeringandResearchCenterforMicrobialFunctionalGenomicsandDetectionTechnology,

Tianjin300457,China;3.KeyLaboratoryofMolecularMicrobiologyandTechnology,

NankaiUniversity,Tianjin300457,China)

Abstract:Considering the importance of carbohydrate moieties on infectivity and host mimicry, there is a need to better understand the biosynthetic pathways of these unusual sugars in order to identify key targets involved in bacterial pathogenesis. Since theinvitrobiochemical characterization of the biosynthetic pathway of unusual sugars is currently hindered by the demand for more accurate, sensitive, and rapid analytical methods for characterizing unusual sugar structures, information about the structure and biosynthesis pathway of these compounds is fragmentary. Mass spectrometry is a rapid, sensitive, and accurate approach for the direct monitoring of enzyme-catalyzed reactions that does not require a chromophore or radiolabeling and thus provides aviable alternative to existing analytical techniques. The objective of this study is to demonstrate the use of electrospray ionization-tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) as a powerful technique for the characterization of enzymatic products in the biosynthetic pathway of deoxythymidine 5’-diphosphate-D-rhamnose (dTDP-L-Rha) inE.coliO7. The dTDP-d-glucose 4,6-dehydratase (RmlB), dTDP-4-keto-6-deoxy-glucose-3,5 epimerase (RmlC), and dTDP-4-keto-rhamnose reductase (RmlD) catalyzed reactions were directly monitored by ESI-MS, followed by detailed structural characterization of the final enzymatic products using ESI-MS/MS in the negative-ion mode after minimal cleanup. The biosynthetic pathway of dTDP-L-Rha, beginning from dTDP-L-Rha in three reaction steps catalyzed by RmlB, RmlC, and RmlD, was characterized by ESI-MS/MS. The results obtained were in good agreement with that of traditional high-performance liquid chromatography (HPLC) monitoring and preparation, as well as NMR and ESI-MS structural characterization. Collectively, these data demonstrate that a CID-ESI-MSspanbased platform is applicable to the facile characterization of the biosynthetic pathway of important unusual dTNP-sugar in the O-chain and offers significant advantages over current methods in terms of speed, sensitivity, reproducibility, automation and reagent costs.

Key words：unusual sugar; dTDP-L-Rha; biosynthetic pathway; electrospray ionization-tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS)

通信作者：周大煒(1966—)，女(漢族)，吉林人，副研究員，從事微生物功能基因組學(xué)研究。E-mail: daweizhou@nankai.edu.cn

作者簡介：許瑩瑩(1990—)，女(漢族)，山東人，碩士研究生，微生物專業(yè)。E-mail: xuyingying320@qq.com

基金項(xiàng)目：南開大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)資金(J02006)資助

收稿日期：2015-03-18;修回日期：2015-04-22

中圖分類號(hào)：O657.63

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2997(2016)01-0017-06