玉米秸稈與廢棄白菜的混貯品質(zhì)及乳酸菌多樣性研究

任海偉，趙拓，李金平，李雪雁，徐娜，王永剛，王曉力，高曉航

(1.蘭州理工大學(xué)西部能源與環(huán)境研究中心，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050；

3.西北低碳城鎮(zhèn)支撐技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730050；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050)

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玉米秸稈與廢棄白菜的混貯品質(zhì)及乳酸菌多樣性研究

任海偉1,2,3，趙拓2，李金平1,3*，李雪雁2，徐娜2，王永剛2，王曉力4，高曉航2

(1.蘭州理工大學(xué)西部能源與環(huán)境研究中心，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050；

3.西北低碳城鎮(zhèn)支撐技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730050；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050)

摘要：為研究玉米秸稈和廢棄白菜混合青貯可行性，考查二者在不同質(zhì)量比時(shí)的混貯品質(zhì)，設(shè)計(jì)了6個(gè)不同的混貯比例，分別為29∶19，27∶21，25∶23，23∶25，21∶27和19∶29。混合青貯30 d后對(duì)其化學(xué)組分和發(fā)酵品質(zhì)進(jìn)行分析，篩選品質(zhì)最佳的混貯比例，并進(jìn)一步研究了品質(zhì)最佳混貯組的乳酸菌多樣性。結(jié)果表明，質(zhì)量比為21∶27的混貯5(ME5)組的pH和氨態(tài)氮/總氮顯著低于其余混貯組(P<0.05)，乳酸含量顯著高于其余混貯組(P<0.05)。ME5組的干物質(zhì)和能源組分綜纖維素含量較高，而酸性洗滌木質(zhì)素含量較低，綜合判定該組的混貯品質(zhì)優(yōu)于其他5組。乳酸菌多樣性結(jié)果顯示，從ME5組中共分離出10株乳酸菌，分屬于3個(gè)屬，4個(gè)種。3個(gè)屬分別是乳桿菌屬、腸球菌屬和明串珠菌屬。4個(gè)種分別是2株短乳桿菌、1株屎腸球菌、5株腸膜明串珠菌腸膜亞種和2株植物乳桿菌，其中同型發(fā)酵乳酸菌乳桿菌屬和腸球菌屬為該青貯體系的關(guān)鍵乳酸菌。

關(guān)鍵詞：玉米秸稈；廢棄白菜；混合青貯；乳酸菌

青貯不僅是一種傳統(tǒng)的動(dòng)物飼草貯存方式，還可用于能源植物的貯存[1]。青貯是在厭氧條件下，利用原料表面附生微生物，以可溶性碳水化合物為底物轉(zhuǎn)化為乳酸等有機(jī)酸，降低pH從而抑制有害微生物繁殖，達(dá)到長(zhǎng)期貯存原料的目的[2-4]。玉米(Zeamays)秸稈多用作青貯飼料和沼氣發(fā)酵原料，但因其季節(jié)性收獲和農(nóng)民耕作習(xí)慣等因素，秸稈大量收獲時(shí)已變干黃或枯蔫，水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量流失，無(wú)法直接青貯。另一方面，廢棄蔬菜富含水分和糖分，若能將其與秸稈進(jìn)行混合貯存，則不僅能有效解決玉米秸稈的貯存問(wèn)題，還能減少蔬菜廢棄引發(fā)的環(huán)境污染。

有關(guān)玉米秸稈與其他原料的混合青貯研究已十分深入。楊道蘭等[5]認(rèn)為花椰菜(Brassicacapitata)莖葉與玉米秸稈混貯(質(zhì)量比7∶3)能顯著提高青貯料的可溶性碳水化合物、乳酸和丙酸含量，降低pH、丁酸含量。李樹(shù)成等[6]認(rèn)為隨著白花草木樨(Melilotusalbus)比例增大，其與玉米秸稈混貯過(guò)程中的pH、氨態(tài)氮/總氮和粗蛋白含量呈升高趨勢(shì)，乳酸、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量呈降低趨勢(shì)。黃曉輝等[7]將苦豆子(Sophoraalopecuroides)和玉米秸稈混貯后發(fā)現(xiàn)，混貯料的pH、氨態(tài)氮/總氮和粗蛋白含量隨苦豆子比例的升高而增加。究其原因，混貯品質(zhì)的提高有賴于乳酸菌發(fā)酵作用，因此乳酸菌多樣性研究對(duì)解析青貯品質(zhì)變化具有重要意義。

近年來(lái)，16S rDNA序列分析技術(shù)被認(rèn)為是乳酸菌分類鑒定和多樣性研究的有效方法[4,8]。有學(xué)者從玉米、意大利多花黑麥草(Loliummultiflorum)、水稻(Oryzalatifolia)和尖葉胡枝子(Lespedezahedysaroides)的青貯料中分離得到植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、腸膜明串珠菌(Leuconostopseudomesenteroides)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)[9-11]。也有學(xué)者從其他青貯料中鑒定出一些鮮見(jiàn)的乳酸菌。Cai等[12]從蘇丹草(Sorghumvulgare)中分離了新種那須乳桿菌(Lactobacillusnasuensissp.nov.)。楊楊等[13]從藏北嵩草(Kobresialittledalei)中分離得到17株乳酸菌，其中6株為食竇魏斯氏乳酸菌(Weissellaconfusa)，其余均為融合魏斯氏乳酸菌(Weissellacibaria)。司丙文等[14]從山竹巖黃芪(Hedysarumfruticosum)中分離得到1株乳酸菌為蒙氏腸球菌(Enterococcusmundtii)。

本研究以干玉米秸稈與廢棄白菜(Brassicapekinensis)混合青貯為原料，旨在從化學(xué)組分和發(fā)酵品質(zhì)角度分析不同質(zhì)量比對(duì)二者混合青貯品質(zhì)的影響，并利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法和16S rRNA序列分析技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)品質(zhì)最佳混貯組的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，為該混貯模式的實(shí)踐推廣奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

干玉米秸稈取自甘肅省隴西縣，玉米品種為豫玉，采集時(shí)間2013年10月，摘穗后田間留置1個(gè)月后收集，水分含量為28.47%；廢棄白菜葉取自蘭州市七里河區(qū)菜市場(chǎng)，水分含量為94.42%。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biomiga公司。2×Taq MasterMix購(gòu)自上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。DNA Marker-D購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)青貯含水量為65%~75%的基本要求，將干玉米秸稈與廢棄白菜按不同質(zhì)量比(依次為29∶19，27∶21，25∶23，23∶25，21∶27和19∶29)進(jìn)行混貯，混貯體系對(duì)應(yīng)的水分含量為65%，67%，69%，71%，73%和75%，分別編號(hào)為ME1、ME2、ME3、ME4、ME5和ME6。每個(gè)試驗(yàn)組3個(gè)重復(fù)。

1.3青貯調(diào)制

將玉米秸稈切斷至1～2 cm后與長(zhǎng)寬為2 cm×2 cm廢棄白菜按一定質(zhì)量比例進(jìn)行混合，混勻后裝入1.5 L青貯瓶中。為減少原料空隙一邊裝填一邊壓實(shí)，25℃恒溫密封貯存30 d。貯存時(shí)間為2013年11月至12月。

1.4分析方法

1.4.1理化指標(biāo)分析準(zhǔn)確稱取50 g青貯料，按1∶10比例加入蒸餾水混合打漿，過(guò)濾后對(duì)濾液和濾渣進(jìn)行分析。干物質(zhì)(dry matter，DM)測(cè)定采用105℃烘干法；中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)和酸性洗滌木質(zhì)素(acid detergent lignin，ADL)測(cè)定采用ANKOMA200i全自動(dòng)纖維分析儀；纖維素(cellulose，CL)、半纖維素(hemicellulose，HC)和綜纖維素(holocellulose，HoC)含量由公式計(jì)算，CL=ADF-ADL，HC=NDF-ADF，HoC=CL+HC；氨態(tài)氮(ammonia nitrogen，AN)測(cè)定采用苯酚-次氯酸鈉比色法[15]；可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrates，WSC)測(cè)定采用蒽酮硫酸法[16]；乳酸(lactic acid，LA)測(cè)定采用SBA-40X生物傳感器；總氮(total nitrogen，TN)測(cè)定采用凱氏定氮法[17]；乙酸(acetic acid，AA)、丁酸(butyric acid，BA)等有機(jī)酸分析采用GC9790Ⅱ氣相色譜儀，測(cè)試條件為進(jìn)樣口溫度200℃，載氣為高純氮?dú)?99.999%)，不分流進(jìn)樣，升溫程序：40℃保持2 min，以2℃/min升至100℃后保持5 min，再以10℃/min升至200℃，保持5 min。

1.4.2微生物分析無(wú)菌環(huán)境稱取ME5組青貯料25 g加入到225 mL無(wú)菌生理鹽水中，37℃恒溫振蕩2 h，將菌懸液進(jìn)行梯度稀釋，取10-3, 10-4和10-5三個(gè)稀釋度液體各0.2 mL分別涂布于MRS(Man Rogosa Sharpe，乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基)固體平板上，每個(gè)稀釋度分別做3個(gè)重復(fù)， 37℃厭氧培養(yǎng)72 h。根據(jù)菌落的大小、光澤、透明程度等挑取MRS固體平板上不同的典型菌落分離純化2～3次后，觀察記錄菌落形態(tài)并進(jìn)行革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。

生理生化試驗(yàn)包括明膠液化、吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原、H2S產(chǎn)氣、精氨酸水解、0.1%美蘭還原、10和45℃生長(zhǎng)、pH 4.5和pH 9.6生長(zhǎng)、6.5% NaCl生長(zhǎng)試驗(yàn)等[18]。采用糖微量發(fā)酵管法進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)。

參考乳酸菌通用引物進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA基因擴(kuò)增，正向引物為27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG[19]；反向引物為1492r：CTACGGCTACCTTGTTACGA[20]，上述引物由上海桑尼生物技術(shù)有限公司合成。細(xì)菌基因組DNA提取按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，采用DYY11電泳儀進(jìn)行DNA檢測(cè)，并在MG96+PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50 μL：2×Taq MasterMix 25 μL、上下游引物各2 μL、模板DNA 1 μL、RNase-Free Water 20 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1600 bp。將未純化PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

同源性與系統(tǒng)發(fā)育分析：將測(cè)序結(jié)果利用DNAstar進(jìn)行序列拼接處理，并與NCBI上Microbes Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)分析，同時(shí)采用MEGA 5.1軟件中的Clustal W對(duì)序列進(jìn)行多重比較，利用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用Bootstrap法對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行1000次重復(fù)統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證，獲得分類或系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)不同混合比例處理進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05代表數(shù)據(jù)存在顯著性差異。

2結(jié)果與分析

2.1青貯原料的化學(xué)成分分析

由表1可知，玉米秸稈中干物質(zhì)含量為71.53%，WSC含量為28.04%，CL和HC含量豐富，二者之和高達(dá)為53.76%。廢棄白菜中水分含量豐富，高達(dá)94.42%，WSC含量為23.74%。因此，玉米秸稈與廢棄白菜混貯能實(shí)現(xiàn)水分含量的互補(bǔ)性，彌補(bǔ)干秸稈水分缺失，達(dá)到青貯基本要求。

表1　青貯原料的化學(xué)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))

由表2可知，玉米秸稈與廢棄白菜按照不同比例混貯30 d后，與表1中原料相比，所有混貯組中的WSC含量顯著下降(P<0.05)，WSC被青貯過(guò)程中的乳酸菌等微生物繁殖代謝所利用。ME2組的DM含量顯著高于其他混貯組(P<0.05)，且DM高于50%，但該組ADL含量相對(duì)較高，僅次于ME6組。從能源物質(zhì)組分HoC角度來(lái)看，ME1和ME5組的HoC含量顯著高于其他組(P<0.05)，但ME1和ME5組之間無(wú)顯著差異。盡管6個(gè)混貯組之間的組分變化規(guī)律不明顯，但總體上看ME5組的DM損失小，且HoC保存較好，ADL含量相對(duì)較低。

表2　不同質(zhì)量比對(duì)混貯中化學(xué)組分的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

注：表中同列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: The means in the same column with different small letters indicate significant difference atP<0.05. The same below.

2.2發(fā)酵品質(zhì)分析

由表3可知，6個(gè)試驗(yàn)組的pH均處于發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)良的青貯pH 范圍3.5～4.5，且隨著廢棄白菜比例的增加，混貯組中pH總體呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。其中，ME5組中的pH和AN/TN最低，顯著低于其他混貯組(P<0.05)；且LA含量最高，顯著高于其他組(P<0.05)。說(shuō)明混貯過(guò)程中白菜的適當(dāng)增加有利于乳酸菌的快速繁殖和pH快速下降。另一方面，6個(gè)混貯組中的AA和BA含量微弱，濃度均小于0.01%，推測(cè)玉米秸稈與廢棄白菜的混貯過(guò)程以同型發(fā)酵為主，有利于減少干物質(zhì)的損失。綜合分析化學(xué)組分和發(fā)酵品質(zhì)的結(jié)果，確定ME5組的貯存品質(zhì)優(yōu)于其他混貯組。

2.3乳酸菌的多樣性分析

2.3.1形態(tài)學(xué)鑒定挑取MRS固體平板上直徑2~3 mm、 白色或乳白色、 表面光滑凸起、 大小不一的菌落,經(jīng)革蘭氏染色為陽(yáng)性,過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)為陰性的菌株標(biāo)記為乳酸菌,共分離到10株,編號(hào)為CSCWL1-2、CSCWL1-4、CSCWL1-6、CSCWL1-7、CSCWL1-11、CSCWL1-14、CSCWL1-16、CSCWL1-17、CSCWL1-18和CSCWL1-19。

2.3.2 生理生化鑒定 如表4可知,菌株CSC-WL1-2、CSCWL1-7、CSCWL1-17和CSCWL1-18為革蘭氏陽(yáng)性桿菌,過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)為陰性,不產(chǎn)生吲哚和硫化氫,pH4.5條件下能夠正常生長(zhǎng),初步認(rèn)定為乳桿菌屬(Lactobacillus)。

表3 不同質(zhì)量比對(duì)青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響Table3 Effectsofmixedproportiononfermentationcharacteristicsofsilages%DM混貯MixedensilingpH值pHvalue乳酸LA氨態(tài)氮/總氮AN/TN乙酸AA丁酸BAME13.85±0.03d18.62±0.05b1.60±0.02d<0.01<0.01ME24.03±0.15b14.69±0.03f2.65±0.10c<0.01<0.01ME33.96±0.06c16.37±0.02d1.12±0.15e<0.01<0.01ME43.94±0.08c17.81±0.06c2.81±0.19b<0.01<0.01ME53.72±0.03e20.76±0.11a1.11±0.19e<0.01<0.01ME64.32±0.05a15.87±0.05e3.24±0.27a<0.01<0.01標(biāo)準(zhǔn)誤SEM0.0770.0570.161<0.001<0.001P值P-value0.0060.0030.026<0.001<0.001

從表5可知,菌株CSCWL1-4為革蘭氏陽(yáng)性球菌,過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)為陰性,0.1%美蘭還原試驗(yàn)、pH 9.6和6.5% NaCl生長(zhǎng)試驗(yàn)為陽(yáng)性，在15和45℃條件下生長(zhǎng)，符合腸球菌屬(Enterococcaceae)的特征，初步確定為腸球菌屬；菌株CSCWL 1-6、CSCWL 1-11、CSCWL 1-14、CSCWL 1-16和CSCWL 1-19為革蘭氏陽(yáng)性球菌，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)和硝酸鹽還原試驗(yàn)為陰性， pH 9.6生長(zhǎng)試驗(yàn)為陽(yáng)性，0.1%美蘭還原試驗(yàn)為陰性，在15℃條件下生長(zhǎng)，45℃條件下不生長(zhǎng)，根據(jù)以上結(jié)果暫不能在屬水平上做出準(zhǔn)確判斷。

表4　乳桿菌屬的鑒定結(jié)果

+：陽(yáng)性Positive; -：陰性Negative. 下同The same below.

表5　球狀乳酸菌的鑒定結(jié)果

由表6可知，菌株CSCWL 1-2和CSCWL 1-17在15℃條件下生長(zhǎng)，45℃條件下不生長(zhǎng)，能利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可發(fā)酵果糖產(chǎn)酸，水解精氨酸，顯微鏡下為短桿狀，初步確定為異型發(fā)酵短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)。菌株CSCWL 1-7和CSCWL 1-18能利用葡萄糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，可發(fā)酵阿拉伯糖、麥芽糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、棉籽糖、蔗糖和纖維二糖產(chǎn)酸，不能水解精氨酸，初步確定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。結(jié)合表5和6結(jié)果，球狀菌株CSCWL 1-4能在15℃、45℃、pH 9.6和6.5% NaCl條件下生長(zhǎng)，0.1%美蘭還原試驗(yàn)為陽(yáng)性，精氨酸產(chǎn)氨，利用葡萄糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，可發(fā)酵阿拉伯糖、果糖、半乳糖、蜜二糖、海藻糖、麥芽糖、纖維二糖和乳糖產(chǎn)酸，不能發(fā)酵松三糖和山梨醇，暫無(wú)法對(duì)其在種水平上進(jìn)行判斷。菌株CSCWL 1-6、CSCWL 1-11、CSCWL 1-14、CSCWL 1-16和CSCWL 1-19能利用葡萄糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，所以均為同型發(fā)酵乳酸菌，不能發(fā)酵利用松三糖、鼠李糖和山梨醇，精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)為陰性，符合明串珠菌屬(Leuconostocaceae)的特征，暫無(wú)法在種水平上做出判斷。故菌株CSCWL 1-4、CSCWL 1-6、CSCWL 1-11、CSCWL 1-14、CSCWL 1-16和CSCWL 1-19的鑒定結(jié)果需要結(jié)合16S rRNA序列分析技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。

表6　乳酸菌糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

2.3.316S rRNA序列同源性分析提取10株乳酸菌的基因組DNA，電泳檢測(cè)結(jié)果為單一清晰條帶(圖1)，能滿足PCR擴(kuò)增條件，如圖2所示，所擴(kuò)增的目的片段條帶清晰，長(zhǎng)度約為1500 bp，滿足測(cè)序要求。

將測(cè)序結(jié)果利用DNAstar軟件進(jìn)行拼接處理，并與Microbes Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的細(xì)菌16SrRNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，找出與目的序列同源性最高的菌種，如表7所示。

圖1　基因組DNA檢測(cè)電泳圖Fig.1　Electrophoresis picture of genome DNA detection

圖2　PCR產(chǎn)物檢測(cè)電泳圖Fig.2　Electrophoresis picture of PCR products

菌株Strain登記號(hào)Accession最大分Maxscore總分Totalscore覆蓋度Querycover(%)期望值E-value相似度Ident(%)相似性比對(duì)結(jié)果BlastresultCSCWL1-2NC_008497.1259712982990.099短乳桿菌LactobacillusbrevisCSCWL1-4NC_017960.1261415601990.099屎腸球菌EnterococcusfaeciumCSCWL1-6NC_008531.1261410456990.099腸膜明串珠菌腸膜亞種Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroidesCSCWL1-7NC_004567.2255112740990.099植物乳桿菌LactobacillusplantarumCSCWL1-11NC_008531.1261010441990.099腸膜明串珠菌腸膜亞種Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroidesCSCWL1-14NC_008531.12593103751000.099腸膜明串珠菌腸膜亞種Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroidesCSCWL1-16NC_008531.1256610264990.099腸膜明串珠菌腸膜亞種Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroidesCSCWL1-17NC_008497.12641132031000.099短乳桿菌LactobacillusbrevisCSCWL1-18NC_004567.2263813174990.099植物乳桿菌LactobacillusplantarumCSCWL1-19NC_008531.1262310493990.099腸膜明串珠菌腸膜亞種Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides

由表7可知，菌株CSCWL 1-2和CSCWL 1-17與短乳桿菌的同源性最高；菌株CSCWL 1-4與屎腸球菌的同源性最高；菌株CSCWL 1-6、CSCWL 1-11、CSCWL 1-14、CSCWL 1-16和CSCWL 1-19與腸膜明串珠菌腸膜亞種的同源性最高；菌株CSCWL 1-1和CSCWL 1-18與植物乳桿菌的同源性最高。

構(gòu)建10株乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示。菌株CSCWL 1-7和CSCWL 1-18聚為第1類群，同時(shí)與其他乳桿菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株親緣關(guān)系較近；菌株CSCWL 1-2和CSCWL 1-17單獨(dú)聚為一類，且與第1類群相似性達(dá)100%；菌株CSCWL 1-4聚為第2類群,且與其他腸球菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株相似性達(dá)100%；菌株CSCWL 1-6、CSCWL 1-11、CSCWL 1-14、CSCWL 1-16和CSCWL 1-19聚為第3類群,且與其他明串珠菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株親緣關(guān)系較近。故確定菌株CSCWL 1-7和CSCWL 1-18為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)；菌株CSCWL 1-2和CSCWL 1-17為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)；菌株CSCWL 1-4為屎腸球菌(Enterococcusfaecium)；菌株CSCWL 1-6、CSCWL 1-11、CSCWL 1-14、CSCWL 1-16和CSCWL 1-19為腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)。將分離的10株乳酸菌序列提交GenBank，所得注冊(cè)號(hào)按菌株編號(hào)依次為KM985449~KM985458。

圖3　16S rRNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3　Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequence　圖中分支數(shù)字表示Bootstrap驗(yàn)證中該分支可信度百分?jǐn)?shù)；標(biāo)尺表示序列差異度。Numbers in tree branch represent percentage of confidence for each branch; scale represent difference in sequence.

3討論

原料中WSC和水分是青貯發(fā)酵的必備條件，適宜的WSC和水分含量有利于乳酸生成和pH的快速下降。本研究中玉米秸稈與廢棄白菜的水分含量具有良好互補(bǔ)性，且WSC含量較高，二者混貯可實(shí)現(xiàn)水分含量的互補(bǔ)，從而達(dá)到青貯基本要求[21]。另一方面，CL是由β-(1→4)-D-葡聚糖鏈聚合形成的亞晶體聚合物，HC則包括木葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖以及β-(1→3,1→4)葡聚糖等多糖。玉米秸稈中的CL和HC含量高達(dá)53%以上，這2種組分是生物能源轉(zhuǎn)換過(guò)程中微生物或酶降解的重要底物。因此，CL和HC的高保存率是評(píng)價(jià)混貯過(guò)程中化學(xué)組分變化的主要指標(biāo)之一，即HoC含量越高意味著可轉(zhuǎn)化為生物能源的潛力越大。另一方面，CL與HC和ADL相互交聯(lián)形成木質(zhì)纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，ADL的存在對(duì)CL和HC的生物降解有屏障作用[22]。表2中顯示，ME5組的DM含量為49.52%，且DM和HoL含量較高，ADL相對(duì)較低，貯存過(guò)程中的能源組分損失少，這對(duì)提高玉米秸稈的生物能源轉(zhuǎn)化量具有積極意義。

乳酸菌的快速繁殖和pH迅速降低是青貯成功與否和品質(zhì)高低的關(guān)鍵所在。因此，pH可間接反映青貯品質(zhì)的高低。pH快速降低能夠抑制不利于青貯的厭氧微生物如腸細(xì)菌和梭菌的生長(zhǎng)，減少蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分的損失。高pH(>4.5)是發(fā)酵失敗的標(biāo)志之一[23]。試驗(yàn)中6個(gè)混貯組的pH均低于4.5，低pH能使青貯發(fā)酵過(guò)程停滯，減少DM損失。當(dāng)pH低于4.5時(shí)，蛋白質(zhì)分解成較為穩(wěn)定的氨基酸，對(duì)青貯料不會(huì)造成損失，同時(shí)可以抑制蛋白質(zhì)水解微生物的生長(zhǎng)[24-25]，故6個(gè)混貯組的AN/TN均較低，說(shuō)明蛋白質(zhì)分解較少。青貯料中有機(jī)酸的種類和濃度可以反映青貯發(fā)酵過(guò)程的好壞，其中最重要的是AA、BA和LA。LA有利于pH降低，減少發(fā)酵過(guò)程中DM損失。AA能有效抑制酵母菌生長(zhǎng)，是抑制酵母等真菌生長(zhǎng)的主要物質(zhì)。BA是梭菌等不良微生物分解青貯料中蛋白質(zhì)或氨基酸等生成的產(chǎn)物。LA含量越高意味著pH下降越迅速，其DM和能量組分流失少，發(fā)酵品質(zhì)越好[26]。同時(shí)，本試驗(yàn)中6個(gè)混貯組的AA和BA含量均小于0.01%，推測(cè)同型發(fā)酵乳酸菌占主導(dǎo)地位，梭菌等有害微生物被有效抑制。綜合考慮混貯過(guò)程中的化學(xué)組分和發(fā)酵品質(zhì)，ME5組的混貯效果優(yōu)于其余5組，故確定ME5組為貯存品質(zhì)最佳的混貯比例，即玉米秸稈和廢棄白菜的質(zhì)量比為21∶27。

采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法從ME5組中分離得到10株乳酸菌，利用16S rDNA序列分析技術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)，這10株乳酸菌分屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)和明串珠菌屬(Leuconostoc)3個(gè)屬和4個(gè)種。4個(gè)種分別是短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)2株、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)1株、腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)5株和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)2株。其中，乳桿菌屬和腸球菌屬均為同型發(fā)酵乳酸菌，對(duì)青貯發(fā)酵品質(zhì)起著關(guān)鍵作用。

然而，由于傳統(tǒng)微生物學(xué)分離培養(yǎng)方法的不足，若要全面準(zhǔn)確了解混貯料中的乳酸菌群落多樣性，還需要借助高通量測(cè)序技術(shù)等方法從分子水平研究其多樣性，這也是今后工作的研究?jī)?nèi)容。

4結(jié)論

干玉米秸稈與廢棄白菜的混合比例為21∶27時(shí)混貯品質(zhì)最佳，二者混合青貯不僅可以實(shí)現(xiàn)干秸稈的長(zhǎng)期保存，還能使白菜在貯存期間得到降解。該混貯模式的提出為干黃秸稈的長(zhǎng)時(shí)間貯存和尾菜污染防治提供了一條新途徑，方法可行，也具有實(shí)際利用價(jià)值。

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*Quality and lactic acid bacteria of mixed corn stalk and cabbage waste silage

REN Hai-Wei1,2,3, ZHAO Tuo2, LI Jin-Ping1,3*, LI Xue-Yan2, XU Na2, WANG Yong-Gang2, WANG Xiao-Li4, GAO Xiao-Hang2

1.WesternChinaEnergy&EnvironmentResearchCenter,LanzhouUniversityofTechnology,Lanzhou730050,China; 2.SchoolofLifeScienceandEngineering,LanzhouUniversityofTechnology,Lanzhou730050,China; 3.ChinaNorthwesternCollaborativeInnovationCenterofLow-carbonUrbanizationTechnologies,Lanzhou730050,China; 4.AnimalandVeterinaryPharmaceuticsScienceofChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730050,China

Abstract:Silage made with a mixture of corn stalk (CS) and cabbage waste (CW) were mixed and ensilaged at different ratios, 29∶19 (ME1), 27∶21 (ME2), 25∶23 (ME3), 23∶25 (ME4), 21∶27 (ME5) and 19∶29 (ME6), respectively. The chemical composition and fermentation traits were measured after 30 days (d) to identify the optimal ratio of corn stalk and cabbage waste and the diversity of lactic acid bacteria in each mixture. The pH and the ratio of ammonia nitrogen to total nitrogen (AN/TN) of the ME5silage was significantly lower than the other mixes (P<0.05). The lactic acid content (LA) of ME5was significantly higher than the other mixes (P<0.05) whereas the ammonia nitrogen/total nitrogen ratio (AN/TN) of ME5was significantly lower than other mixes. Analysis of lactic acid bacteria showed that a total of 10 lactic acid bacteria strains were isolated from the ME5group, belonging to three different genera;Lactobacillus,EnterococcusandLeuconostoc. Two strains ofLactobacillusbrevis, one strain ofEnterococcusfaecium, five strains ofLeuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroidesand two strains ofLactobacillusplantarumwere identified. Among these isolates,LactobacillusandEnterococcuswere homofermentative lactic bacteria, which are able to produce more lactic acid than heterofermentative lactic bacteria.LactobacillusandEnterococcusplayed a key role in the fermentation of these silages. In conclusion, mixed silages of CS and CW were found to be feasible with an optimum ratio of 21∶27 respectively.

Key words:corn stalk; cabbage waste; mixed silage; lactic acid bacteria

*通信作者Corresponding author. E-mail：lijinping77@163.com

作者簡(jiǎn)介：任海偉(1983-)，男，山西孝義人，副教授。 E-mail：rhw52571119@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(51366009)，國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)(2014AA052801)，甘肅省自然科學(xué)基金(145RJZA064)，蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)專項(xiàng)(2014-2-20)和蘭州理工大學(xué)“紅柳青年教師培養(yǎng)計(jì)劃”(Q201207)資助。

*收稿日期：2015-02-20；改回日期：2015-05-29

DOI：10.11686/cyxb2015095

http://cyxb.lzu.edu.cn

任海偉, 趙拓, 李金平, 李雪雁, 徐娜, 王永剛, 王曉力, 高曉航. 玉米秸稈與廢棄白菜的混貯品質(zhì)及乳酸菌多樣性研究.草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(1): 197-206.

REN Hai-Wei, ZHAO Tuo, LI Jin-Ping, LI Xue-Yan, XU Na, WANG Yong-Gang, WANG Xiao-Li, GAO Xiao-Hang. Quality and lactic acid bacteria of mixed corn stalk and cabbage waste silage. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(1): 197-206.