豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白在疫苗上的應(yīng)用研究進(jìn)展

姚睿智，樊宏超，鄧清華，姚春雨，馬德慧*

（內(nèi)蒙古民族大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白在疫苗上的應(yīng)用研究進(jìn)展

姚睿智，樊宏超，鄧清華，姚春雨，馬德慧*

（內(nèi)蒙古民族大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的主要病原。GP5蛋白是PRRSV的主要糖蛋白，是中和抗體的主要靶標(biāo)。因此，GP5蛋白的研究在PRRSV感染的診斷和新型基因工程疫苗的研發(fā)上具有重要意義。近年來(lái)，對(duì)于GP5蛋白的研究取得了重要的進(jìn)展，本文就GP5蛋白的特性、功能和應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。

豬繁殖與綜合征病毒；GP5蛋白；基因工程疫苗

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）所引起的一種嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的急性、接觸性、高致死性傳染病。其主要臨床表現(xiàn)為妊娠母豬繁殖障礙和新生仔豬重癥肺炎，并常伴有免疫抑制、持續(xù)感染及繼發(fā)感染。1996年郭寶清等首次從國(guó)內(nèi)暴發(fā)PRRS豬群流產(chǎn)胎兒中分離到PRRSV，從而證實(shí)了我國(guó)豬群存在PRSSV感染。目前，PRRSV普遍流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PRRSV是一種具有囊膜結(jié)構(gòu)、不分節(jié)段、單鏈RNA病毒，屬動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬。PRRSV根據(jù)基因組序列不同可分為美洲型和歐洲型，兩者之間約有40%氨基酸序列差異。近幾年，在我國(guó)主要流行的高致病性PRRS的分離毒株與美洲型在抗原結(jié)構(gòu)上具有同源性。PRRSV基因組大小約為15kb，包含10個(gè)開(kāi)放性閱讀框，可編碼多種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白5。其中ORF5編碼的GP5蛋白是一種N端糖基化的囊膜蛋白，是PRRSV三種主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一。GP5蛋白是主要的保護(hù)性抗原蛋白，其表面具有多個(gè)抗原決定簇，且含有PRRSV主要的中和位點(diǎn)，具有較好的免疫原性，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體，并具有最強(qiáng)中和PRRSV的能力，產(chǎn)生較多的免疫保護(hù)率。此外，GP5蛋白在病毒裝配和免疫反應(yīng)中也扮演著重要角色，同時(shí)還具有誘導(dǎo)某些細(xì)胞發(fā)生程序性死亡等功能。因此，對(duì)GP5蛋白的研究在PRRSV感染的診斷和新型基因工程疫苗的研發(fā)上具有重要意義。

1 GP5蛋白的概述

GP5蛋白是由ORF5所編碼的一種位于PRRSV包膜上的跨膜糖蛋白，分子質(zhì)量約為24.5～26KD。根據(jù)PRRSV的基因型及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，美洲型和歐洲型GP5蛋白的氨基酸數(shù)目分別為200和201個(gè)，且變異性較高，歐洲型毒株自身GP5蛋白的同源性為87.1%～99.25%，而美洲型毒株則為89%～94%，這種高突變率使得兩種基因型的PRRSV之間缺少免疫交叉反應(yīng)。GP5蛋白的N末端含有一個(gè)信號(hào)肽序列，共由31個(gè)氨基酸殘基組成，其功能是引導(dǎo)蛋白質(zhì)的形成。

GP5蛋白含有6個(gè)抗原決定簇，其中有一個(gè)血清型特異的線性中和決定簇，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體，并可以在體外中和PRRSV的感染。研究發(fā)現(xiàn)，GP5蛋白含有2個(gè)B細(xì)胞抗原位點(diǎn)，分別為非中和性A抗原表位和中和性B抗原表位。A抗原表位位于B抗原表位上游，當(dāng)A抗原表位與B抗原表位同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，A抗原表位可能作為誘騙因子（誘騙表位），在PRRSV感染后迅速誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生非中和性抗體，使抗中和性B抗原表位的抗體產(chǎn)生至少延緩3周，從而抑制了中和性抗原表位B被免疫系統(tǒng)識(shí)別。中和性抗體產(chǎn)生的推遲是PRRSV逃逸免疫監(jiān)視的主要機(jī)制，也是PRRSV感染的主要特征。

PRRSV美洲型和歐洲型均能在機(jī)體內(nèi)、外引起細(xì)胞凋亡。而PRRSV所引發(fā)的細(xì)胞凋亡作用與GP5蛋白密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，GP5蛋白所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并不能被抗凋亡蛋白Bcl-2所抑制。這說(shuō)明GP5蛋白所誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡可能作用于抗凋亡因子Bcl-2的下游，因而增加了促凋亡蛋白的表達(dá)量，打破了細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間的平衡，使細(xì)胞色素C從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中，引發(fā)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，有研究顯示GP5蛋白N端的前119個(gè)氨基酸在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，而C端缺失并不影響其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性。

2 基于GP5蛋白的新型疫苗

目前，PRRS疫苗主要是滅活和弱毒疫苗。但是，就其在臨床上的使用效果來(lái)看，兩者的安全性或有效性存在著一些缺陷。故而，開(kāi)發(fā)更加安全、高效、廉價(jià)的新型基因工程疫苗已成為當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。由于GP5蛋白具有良好的免疫學(xué)特性，使其成為了研制新型基因工程疫苗的首選蛋白。因此，以GP5蛋白為基礎(chǔ)的DNA疫苗、重組亞單位疫苗及活病毒載體疫苗成為了主要的PRRS新型疫苗。

2.1 DNA疫苗 DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗。Kwang等應(yīng)用真核表達(dá)載體分別構(gòu)建了 PRRSV ORF4、ORF5、ORF6、ORF7 4種重組DNA疫苗，并進(jìn)行了動(dòng)物試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)PRRSV的抗原中和表位主要集中于GP4和GP5蛋白上。Barfoed等將PRRSV的ORF1～7均制成了DNA疫苗，免疫豬后發(fā)現(xiàn)，以O(shè)RF5構(gòu)建的DNA疫苗進(jìn)行免疫的豬體內(nèi)抗體滴度最高，證明GP5蛋白是制備DNA疫苗的首選蛋白。馬德慧等將GP5和M蛋白基因克隆在PEGFP-C1載體上，成功構(gòu)建了基因疫苗表達(dá)載體pEGP5-C1和pEM-C1，并對(duì)小鼠進(jìn)行了免疫試驗(yàn)，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了特異性抗體，并在二次免疫后的第一周開(kāi)始檢測(cè)到特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，證明該重組質(zhì)粒具有良好的免疫原性，為接下來(lái)進(jìn)行豬體免疫試驗(yàn)和DNA疫苗的研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

“自殺性”DNA疫苗（Suicidal DNA vaccine）是近年來(lái)以甲病毒復(fù)制子為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的一種新型DNA疫苗，具有安全、高效、易制備、易保存等優(yōu)點(diǎn)，一些“自殺性”DNA疫苗的免疫劑量較現(xiàn)階段常規(guī)疫苗少100倍左右，是基因疫苗發(fā)展的一項(xiàng)重大突破。方六榮等成功構(gòu)建了一株含有ORF5基因的“自殺性”DNA疫苗，并對(duì)豬進(jìn)行了2次免疫試驗(yàn)，間隔期為4周，結(jié)果證明“自殺性”DNA疫苗在誘導(dǎo)中和抗體和細(xì)胞免疫等方面都優(yōu)于常規(guī)DNA疫苗。江云波等成功構(gòu)建了共表達(dá)GP5和M蛋白的“自殺性”DNA疫苗pSFV-56，通過(guò)體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和Western blot檢測(cè)，證實(shí)表達(dá)的GP5和M蛋白可以形成GP5/M異源二聚體，從而產(chǎn)生協(xié)同作用，能夠更好的誘發(fā)小鼠和斷奶仔豬產(chǎn)生較高的特異性中和抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，為獲得能夠較好地防制PRRSV的新型疫苗提供了新的思路和途徑。

雖然，DNA疫苗的研究已經(jīng)取得很大的進(jìn)展，但因其受母源抗體及外源基因不斷刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體造成免疫抑制等因素的影響，其免疫效果并不穩(wěn)定，因此DNA疫苗在實(shí)際應(yīng)用上受到了一定的限制，還需要進(jìn)一步的研究和完善。

2.2 重組亞單位疫苗 重組亞單位疫苗又稱生物合成亞單位疫苗。Plana等將PRRSV ORF2～ORF7基因分別插入到桿狀病毒表達(dá)載體內(nèi)，用表達(dá)的ORF3和ORF5基因產(chǎn)物對(duì)懷孕母豬進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GP3和GP5蛋白免疫母豬后可提供部分保護(hù)，說(shuō)明GP3和GP5亞單位疫苗具有良好的免疫原性，可以作為研制重組亞單位疫苗的候選基因。病毒樣顆粒（birus-like particles，VLPs）疫苗因具有較強(qiáng)的免疫原性和生物學(xué)活性，且不具有感染性和細(xì)胞毒性，而成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。乙型肝炎病毒核心蛋白（hepatitis B virus core protein，HBc）是一類(lèi)用于病毒顆粒疫苗的載體，它能夠在原核、真核和植物表達(dá)系統(tǒng)中高效組裝成病毒樣顆粒，且外源序列的插入位點(diǎn)并不單一，本身也可以作為佐劑，因此使其具有廣闊的發(fā)展空間。曹佳媛等將GP5蛋白基因插入乙型肝炎病毒核心蛋白（hepatitis B virus core protein，HBc）載體中，成功構(gòu)建含有GP5蛋白的HBc-GP5病毒樣顆粒疫苗，為研發(fā)新型PRRS亞單位疫苗提供了新思路。

2.3 活載體疫苗 PRRS的活載體疫苗主要是以腺病毒、雞痘病毒和偽狂犬病毒等為載體來(lái)表達(dá)PRRSV的主要免疫原性基因。Alonso等首次以傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis coronavirus，TGEV）輔助表達(dá)系統(tǒng)為載體，成功構(gòu)建了表達(dá)GP5蛋白的重組TGEV，并采用滴鼻、口服和胃腸道三種途徑對(duì)仔豬進(jìn)行三次聯(lián)合免疫，結(jié)果可檢測(cè)到很高的 GP5特異性抗體。許信剛等將去除信號(hào)肽的 PRRSV ORF5基因插入到PYA3341表達(dá)載體上，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pYA3341-ORF5，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入鼠傷寒沙門(mén)氏菌疫苗株X4550，獲得口服重組減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌活載體疫苗株X4550（pYA3341-ORF5），并對(duì)豬進(jìn)行了免疫試驗(yàn)，證明重組疫苗菌株X4550（pYA3341-ORF5）能有效刺激誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗GP5蛋白抗體，且具有良好的免疫效果，為PRRSV口服基因工程疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

3 小結(jié)

GP5蛋白是PRRSV的主要保護(hù)性抗原蛋白，具有較好的免疫原性，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體，還具有錨定細(xì)胞膜吸附宿主細(xì)胞的功能。此外，GP5蛋白能夠參與病毒裝配和免疫反應(yīng)，也可以誘導(dǎo)某些細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。雖然，關(guān)于GP5蛋白的一些免疫學(xué)機(jī)理尚未明確，但在新型PRRSV疫苗的研究中，GP5仍是首選蛋白。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外針對(duì)PRRSV疫苗的研究都有很大的進(jìn)展，但PRRSV的預(yù)防與控制仍舊是危害當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)的一大難題，因此，開(kāi)發(fā)安全、高效、廉價(jià)的PRRSV新型疫苗并將其推廣至臨床應(yīng)用仍是今后努力的方向。

[1]郭寶清，等.從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J].中國(guó)畜禽傳染病，1996（2）:1-4.

[2]Hanada K，et al.The Origin and Evolution of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Viruses[J].Mol Biol Evol，2005，22（4）: 1024-1031.

[3]Chand RJ，et al.Pathogenesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Curr Opin Virol，2012，2（3）:256-263.

[4]劉彪.PRRSV ORF5與ETEC菌毛FaeG融合基因在畢赤酵母中的表達(dá)研究[D].吉林長(zhǎng)春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[5]楊閩楠.RNAi靶向PRRSV N基因及GP5基因ADE表位缺失重組腺病毒免疫原性研究[D].吉林長(zhǎng)春:吉林大學(xué)，2014.

[6]Thaa B，et al.Signal peptide cleavage from GP5 of PRRSV:a minor fraction of molecules retains the decoy epitope，apresumed molecular cause for viral persistence[J].PLoS One，2013，8（6）: e65548.

[7]Lee SM，et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus induces apoptosis through a mitochondria-mediated pathway[J]. Virology，2007，365（2）:419-434.

[8]Barfoed AM，et al.DNA vaccination of pigs with open reading frame 1-7 of PRRS virus[J].Vaccine，2004，22（27-28）:3628-3641.

[9]江云波，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5和M蛋白共表達(dá)的自殺性DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫應(yīng)答[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39 （5）:1011-1017.

[10]曹佳媛，等.以乙型肝炎病毒核心蛋白為載體的PRRSV病毒樣顆粒疫苗的構(gòu)建[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2015，45（10）:1000-1004.

[11]許信剛，等.表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌疫苗株的構(gòu)建及動(dòng)物免疫試驗(yàn)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42（7）:955-962.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．03.001

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