代謝組學(xué)技術(shù)在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病中的應(yīng)用

曹　宇，孫玲偉，包　凱，王艷輝，夏　成，張洪友?

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江　大慶　163319；2.江蘇省肉羊產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，江蘇　南京　210095；3.上海奶牛育種中心有限公司，上?！?00436）

代謝組學(xué)技術(shù)在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病中的應(yīng)用

曹宇1，孫玲偉2，包凱3，王艷輝1，夏成1，張洪友1?

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶163319；2.江蘇省肉羊產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210095；3.上海奶牛育種中心有限公司，上海200436）

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，我國(guó)對(duì)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物及其產(chǎn)品的需求日漸增加，高效畜禽品種的選育，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病的發(fā)病率日趨增加。作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，代謝組學(xué)可對(duì)機(jī)體代謝物的變化進(jìn)行定量和定性的檢測(cè)，為探索各種營(yíng)養(yǎng)代謝病的發(fā)病過程及發(fā)病機(jī)理提供有力的技術(shù)平臺(tái)。目前代謝組學(xué)在人類營(yíng)養(yǎng)代謝病研究中已取得一定的成果，但在動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)代謝病上尚處于起步階段。本文就代謝組學(xué)在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，為今后的研究奠定理論依據(jù)。

動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝??；系統(tǒng)生物學(xué)；代謝組學(xué)；發(fā)病機(jī)理

1　前言

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，畜禽營(yíng)養(yǎng)代謝病在養(yǎng)殖業(yè)出現(xiàn)了高發(fā)狀態(tài)，且因?yàn)槠浒l(fā)病機(jī)理的復(fù)雜性以及治療困難，逐漸受到研究者們的重視。目前，人們對(duì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病的研究，主要在表觀的癥狀和防控治療方面。如何更加深入地了解營(yíng)養(yǎng)代謝病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，并應(yīng)用于臨床防治中，成為了畜牧業(yè)有待攻克的難題。

代謝組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，將人們對(duì)病理表觀的認(rèn)識(shí)和代謝物分子動(dòng)態(tài)變化聯(lián)系在一起。代謝組學(xué)可從分子水平更系統(tǒng)全面地揭示疾病病理變化和發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)由疾病過程引起的代謝異常，以及各代謝性疾病之間的關(guān)聯(lián)，為疾病的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)，還有助于疾病生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)并輔助臨床診斷與治療的目的。代謝組學(xué)來源于代謝組[1]，是以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，以數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模整合為目標(biāo)，通過對(duì)機(jī)體代謝產(chǎn)物在時(shí)間上的定量和定性分析，從總體上評(píng)價(jià)生命體的功能狀況及其改變[2]。代謝組學(xué)所研究的是相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000的代謝物[3]，與其他組學(xué)相比，代謝物含量的微細(xì)變化與生物表型的大改變有直接相關(guān)性[4]。根據(jù)研究的對(duì)象和目的的不同，2001年Taylor等[5]將代謝組學(xué)分為4個(gè)層次：①代謝物靶標(biāo)分析（metabol ite target analysis）：對(duì)某個(gè)或某幾個(gè)特定的樣品組分分析。②代謝輪廓（譜）分析（metabol ite prof i l ing analysis）：定量的對(duì)少數(shù)所預(yù)設(shè)的目標(biāo)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。③代謝組學(xué)（metabonomics）：對(duì)限定條件下的特定生物樣品中所有代謝組分的定性和定量。④代謝指紋分析（metabol ite f ingerprinting analysis）：不分離鑒定具體單一組分，而是對(duì)樣品進(jìn)行快速分類。鑒于代謝組學(xué)技術(shù)上述特征，本文通過對(duì)近幾年代謝組學(xué)在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病中的應(yīng)用進(jìn)行綜合論述，為今后動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病的研究提供理論依據(jù)。

2　分析技術(shù)平臺(tái)

根據(jù)研究目的和研究對(duì)象的不同，代謝組學(xué)的技術(shù)程序和分析方法也各有不同，但一般都包括以下幾個(gè)流程：樣品的采集和預(yù)處理、樣品的配制與檢測(cè)、數(shù)據(jù)的處理和分析、代謝標(biāo)志物識(shí)別和生化途徑分析等[6]。目前，代謝組學(xué)中最為常用的是液相與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）、氣相與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）和核磁共振技術(shù)（NMR）三種分析技術(shù)。通過這三種分析平臺(tái)將代謝組學(xué)對(duì)小分子代謝物的分析分為目標(biāo)分析和非目標(biāo)分析[7]。

2.1核磁共振技術(shù)核磁共振主要是由原子核自旋運(yùn)動(dòng)引起，根據(jù)電子繞原子核運(yùn)行所產(chǎn)生的屏蔽效應(yīng)可作出NMR圖譜。其中，1H NMR是目前疾病監(jiān)測(cè)研究中的主流技術(shù)手段，人們通過目標(biāo)質(zhì)子與參照物質(zhì)中相對(duì)應(yīng)的質(zhì)子之間共振頻率的差異（百萬分之一）來確定1H NMR的化學(xué)位移。

NMR分析技術(shù)具有多重優(yōu)點(diǎn)：針對(duì)樣品檢測(cè)無偏向性，且預(yù)處理簡(jiǎn)單、對(duì)樣品損傷性小，因此可較全面的對(duì)樣品進(jìn)行定性檢測(cè)；但由于其靈敏度較低，因此不適合分析大量低濃度代謝物。

2.2氣相色譜--質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是將色譜儀與質(zhì)譜通過適當(dāng)?shù)慕涌谙嘟Y(jié)合完整的分析儀器[8]。其原理是樣品主份不同，各主份通過色譜柱進(jìn)入質(zhì)譜分析儀，樣品被離子化經(jīng)過電場(chǎng)或磁場(chǎng)的篩選，通過樣品的質(zhì)譜和相關(guān)信息，可以得到樣品的定性定量結(jié)果[9]。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可提供較高的分辨率和檢測(cè)靈敏度，并且有可供參考、比較的標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫，可以方便地對(duì)相對(duì)質(zhì)子質(zhì)量小于800的熱穩(wěn)定、易揮發(fā)性含羥基、羧基、氨基和亞氨基等基團(tuán)的極性強(qiáng)的化合物或處理后具可揮發(fā)性的樣品定性結(jié)果[10]。但由于GC-MS只能對(duì)其中的揮發(fā)性組分實(shí)現(xiàn)直接分析，從而得不到體系中難揮發(fā)的大多數(shù)代謝組分的信息。而且樣品準(zhǔn)備工作比較繁瑣，因此，常常作為其他的輔助檢測(cè)技術(shù)。

2.3液相色譜--質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)主要由液相色譜系統(tǒng)（LC）和質(zhì)譜儀（MS）等部分組成。其基本原理是液相色譜對(duì)所檢測(cè)物質(zhì)進(jìn)行分離，然后通過質(zhì)譜來鑒定，具備LC的特性（如分辨率高、靈敏度高）和MS的特點(diǎn)（如測(cè)序速快、精確度高）。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)適用于那些熱不穩(wěn)定、不易揮發(fā)、極性更大、不易衍生化合分子量較大的物質(zhì)。相對(duì)于其他組學(xué)，LC-MS具有較高的靈敏度和選擇性；多種柱效結(jié)合分析（如C18，Amid，HILIC，T3，Phenyl），也使樣品的分析范圍廣泛；善于定性定量分析。但LC-MS需要標(biāo)準(zhǔn)品以及獨(dú)立的數(shù)據(jù)庫，致使其分析能力受到了限制。

通過代謝組學(xué)分析技術(shù)平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行一系列處理后，需要對(duì)各種分析手段（NMR、LC-MS和GC-MS）各自的特點(diǎn)，進(jìn)行相應(yīng)的算法對(duì)原始譜圖的數(shù)據(jù)進(jìn)行提取、峰對(duì)齊[11]、去噪[12]等處理。然后需要對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，挖掘隱含于其中的有用信息。數(shù)據(jù)分析包括無監(jiān)督模式識(shí)別方法和有監(jiān)督識(shí)別方法，無監(jiān)督模式識(shí)別：該方法用于從原始譜圖信息或與處理后的信息中對(duì)樣本進(jìn)行歸類，并釆用相應(yīng)的可視化技術(shù)直觀地表達(dá)出來。該方法將得到的分類信息和原始信息進(jìn)行比較，建立代謝產(chǎn)物與原始信息的聯(lián)系，篩選與原始信息相關(guān)的一些標(biāo)記物，進(jìn)而考察其中的代謝途徑。由于該方法沒有可供學(xué)習(xí)的訓(xùn)練樣本，成為無監(jiān)督識(shí)別方法。主要有：主成分分析[13]、非線性映射[14]、族類分析[15]等，其中應(yīng)用最廣泛的為主成分分析。有監(jiān)督識(shí)別方法：在已有知識(shí)的基礎(chǔ)上建立信息組，利用己知的信息組對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類、識(shí)別和預(yù)測(cè)分析。由于建立模型時(shí)有可供學(xué)習(xí)利用的訓(xùn)練樣本，故稱有監(jiān)督方法。最常用是主成分分析（Principal Component Analysis， PCA）和 偏 小 二 乘 法（Par tialleast squares,PLS）。PCA在不作任何介入和無任何假設(shè)的前提下給出待分析樣品的內(nèi)在區(qū)別，而PLS則有一定的假設(shè)。對(duì)這些方法，尤其是指導(dǎo)性方法的選擇都是有—定條件的，也正因?yàn)槿绱耸褂弥笇?dǎo)性分析方法時(shí)要格外注意假設(shè)的基礎(chǔ)和成立性。

3　代謝組學(xué)在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病中的應(yīng)用

3.1在單胃動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病研究中的應(yīng)用肝臟是糖、脂肪和氨基酸代謝的主要場(chǎng)所，在物質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)起到了舉足輕重的作用，肝臟發(fā)生代謝紊亂及損傷常常導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)代謝病的發(fā)生，而傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)通過血液指標(biāo)對(duì)肝臟及代謝過程的監(jiān)測(cè)，往往不能及時(shí)反映機(jī)體代謝狀態(tài)，而代謝組學(xué)通過對(duì)代謝物的檢測(cè)，為疾病的診斷和挖掘代謝通路提供有力的技術(shù)支持。Saitoh W等[16]使用液相色譜技術(shù)對(duì)小鼠肝臟急性損傷進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)小鼠肝臟受損時(shí)，精氨酸到鳥氨酸代謝途徑會(huì)受到影響，并闡明血中精氨酸和鳥氨酸水平有可能成為肝臟急性損傷的潛在標(biāo)志物。Matsuzaki K等[17]對(duì)過量攝入亮氨酸的大鼠血漿代謝組學(xué)分析表明，尿素和小-酮異已酸可能是氨基酸過量攝入時(shí)的標(biāo)識(shí)物。Ber t ram H C等[18]利用基于NMR的代謝組學(xué)的方法來探索分別以黑麥或小麥為主的富含纖維的飼糧對(duì)高膽固醇血癥豬內(nèi)源性生化效應(yīng)的影響，揭示了高膽固醇血癥豬攝入高纖維黑麥飼糧后，血漿堿含量增加，并找出了評(píng)價(jià)血漿堿含量的標(biāo)識(shí)物。李民等[19]進(jìn)行了營(yíng)養(yǎng)不良大鼠血漿小分子物質(zhì)代謝組學(xué)的研究，結(jié)果表明營(yíng)養(yǎng)不良組大鼠與正常大鼠相比，血漿中肉毒堿和色氨酸含量增加，而甜菜堿、棕櫚酰肉堿、亞麻酸、二十二碳六烯酸和花生四烯酸等含量均降低，因此代謝組學(xué)可作為營(yíng)養(yǎng)不良指標(biāo)的篩選方法。Kowalski G M等[20]通過飼喂高脂肪日糧對(duì)小鼠骨骼肌動(dòng)員葡萄糖代謝通路的氣象色譜-質(zhì)譜技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，骨骼肌動(dòng)員葡萄糖衍生碳進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行氧化，是通過丙酮酸氫化酶派生的，而不是通過丙酮酸羧化酶介導(dǎo)的。Noguchi Y等[21]表明用代謝組學(xué)的方法可以定量測(cè)定氨基酸代謝物，可估計(jì)攝入適量的氨基酸與安全范圍，可研究某種代謝產(chǎn)物與攝入過量的蛋白質(zhì)、氨基酸的相關(guān)性，以此確定適量安全的氨基酸攝入量。

養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)日糧存放不當(dāng)，會(huì)使飼料組成成分發(fā)生改變，而這對(duì)機(jī)體的傷害也會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)代謝病的高發(fā)。Solanky K S等[22]運(yùn)用基于NMR的代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，表兒茶素（EC）使SD鼠內(nèi)源代謝物水平發(fā)生明顯變化，EC進(jìn)入體內(nèi)影響內(nèi)源性物質(zhì)的代謝途徑，代謝能力降低，碳水化合物代謝水平下降，還可能引起肝臟、腎臟功能改變等。Toue S等[23]通過基于NMR代謝組學(xué)技術(shù)研究蛋氨酸代謝的標(biāo)識(shí)物，揭示了高半胱氨酸是監(jiān)測(cè)蛋氨酸是否過量的良好指標(biāo)。施壽榮[24]利用代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)共同揭示了脂類物質(zhì)代謝在腹水綜合征肉雞上發(fā)生了異常，二羥基丙酮可能是低溫誘導(dǎo)腹水綜合征肉雞的潛在代謝標(biāo)志物；甘油磷脂類物質(zhì)氧化生產(chǎn)溶血甘油磷脂類物質(zhì)是早期腹水綜合征肉雞發(fā)病的重要機(jī)制。兩種組學(xué)研宄手段的結(jié)合為系統(tǒng)地闡釋AS的代謝特征及其發(fā)生機(jī)制提供了更加全面的信息。谷類常常受到脫氧腐鐮刀菌烯醇的污染，而豬對(duì)其特別敏感，常常導(dǎo)致豬發(fā)生氧化應(yīng)激，腸上皮細(xì)胞的凋亡，同時(shí)會(huì)引起豬能量、脂肪和氨基酸代謝絮亂，而通過對(duì)小豬補(bǔ)充谷氨酸發(fā)現(xiàn)，谷氨酸可減少機(jī)體氧化應(yīng)激，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增值，減少DON引起的代謝絮亂[25]。

另外，代謝組學(xué)也可應(yīng)用于飼料添加劑對(duì)動(dòng)物的效果研究。He Q等[26]采用基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)飼糧中添加精氨酸對(duì)生長(zhǎng)豬的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)增加飼糧中精氨酸添加量能改變機(jī)體脂肪和氨基酸的代謝過程，提高骨骼肌中蛋白質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)腸道微生物的代謝，顯著提高豬的生長(zhǎng)性能。Avery L B等[27]對(duì)患有脂肪肝的大鼠飼喂丙戊醇發(fā)現(xiàn)，丙戊醇是酰苷酸活化蛋白的新的活化劑，它可減輕肝臟中脂肪的沉積。

3.2在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病研究中的應(yīng)用反芻動(dòng)物發(fā)生營(yíng)養(yǎng)代謝病主要是由飼養(yǎng)管理不當(dāng)引起。由于泌乳的需求，反芻動(dòng)物機(jī)體常常處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，而如何掌控反芻動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需求的量成為了當(dāng)今世界性的難題。隨著機(jī)體的病理變化，體液和組織中的代謝產(chǎn)物也產(chǎn)生了相應(yīng)的變化。代謝組學(xué)對(duì)這些由疾病引起的代謝產(chǎn)物的相應(yīng)進(jìn)行分析，能夠幫助更好地理解病變過程及機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑，還有助于疾病的生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和輔助臨床診斷的目的。目前，已有大量的研究報(bào)道利用代謝組學(xué)技術(shù)來研究動(dòng)物的各種代謝性疾病的發(fā)生過程和結(jié)果。Hai lemariam D等[28]通過液相色譜質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)圍產(chǎn)前期和圍產(chǎn)后期奶牛進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)肉毒堿、丙酰肉毒堿等三個(gè)化合物可能成為預(yù)防奶牛圍產(chǎn)期疾病的生物標(biāo)志物。孫玲偉[29]應(yīng)用1H NMR與GC/ MS聯(lián)用技術(shù)，獲得了奶牛臨床酮病和亞臨床酮病的代謝差異物，而其中有些代謝差異物可作為奶牛酮病診斷的生物編織物；并全景式地揭示了發(fā)生酮病時(shí)，機(jī)體發(fā)生了廣泛的代謝紊亂。Imhasly S等[30]通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)脂肪肝奶牛代謝標(biāo)志物進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)29個(gè)差異代謝物。Bert ram H C等[31]使用丙二醇誘導(dǎo)奶牛中毒，使用NMR對(duì)奶牛血液和瘤胃液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)丙二醇誘導(dǎo)中毒后，會(huì)導(dǎo)致奶牛呼吸困難血管收縮。肺部血管收縮，血中血紅蛋白氧飽和度顯著下降。Saleem F等[32]通過基于代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)奶牛飼喂高谷物日糧引起奶牛代謝病的紊亂增加的機(jī)制進(jìn)行了研究，表明泌乳早期飼喂高谷物日糧會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生大量的炎性因子，同時(shí)引起氨基酸代謝紊亂。李影[33]應(yīng)用代謝組學(xué)的1H NMR技術(shù)篩選和確證了Ⅰ型酮病和Ⅱ型酮病的血漿差異代謝物，不僅驗(yàn)證了奶牛酮病發(fā)生過程中糖、脂類和氨基酸的代謝紊亂，也為今后進(jìn)一步探究Ⅱ型酮病的發(fā)病機(jī)制和防治奠定理論基礎(chǔ)。

4　小結(jié)

目前，基于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病的代謝組學(xué)研究還有待于探究，但對(duì)于營(yíng)養(yǎng)代謝病的發(fā)病機(jī)制和營(yíng)養(yǎng)代謝病生物標(biāo)志物的研究中發(fā)揮越來越重要作用。由于代謝組學(xué)分析技術(shù)造價(jià)昂貴，目前在國(guó)內(nèi)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病領(lǐng)域中還沒有普及，此外，以目前的檢測(cè)技術(shù)對(duì)代謝物的全方位的檢測(cè)和分析限制很大，且對(duì)后期龐大的數(shù)據(jù)高效分析也是目前研究者們厄待解決的問題。因此，基于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病的代謝組學(xué)中研究還有很大發(fā)展的空間。由此展望，隨著各種代謝組學(xué)檢測(cè)手段和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)技術(shù)的不斷完善，以及代謝組學(xué)與各其他組學(xué)技術(shù)聯(lián)用，將為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病的發(fā)病過程和機(jī)理的系統(tǒng)研究提供技術(shù)支持。

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App lication ofmetabonom ics in animalnutritionmetabolic diseases

Cao Yu1，Sun Lingwei2，Bao Kai3，Wang Yanhui1，Xia Cheng1，Zhang Hongyou1*
(1.Col lge of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongj iang Bayi Agricul tural University,Hei longj ing
Daqing163319; 2 Jiangsu Engineering Technology Research Center of Mutton Sheep&Goat Industry,JiangsuNanj ing210095; 3 Shanghai dairycow breeding center Co.,Ltd.,Shanghai200436)

With the rapid development of the stock farming,increased demand for animals products,increasingly incidence of variable nutritional metabol ic disease.As a par t of system biology,organism metabol ites can be quantitative and qualitative detected by metabolites for exploring the process and the pathogenesis of various metabol ic diseases.Metabolomics had made certain achievements in the study of human disease,but sti l l in its infancy in animal metabol ic diseases.In this paper,the appl ication of metabolomics in animal nut rition metabol ic disease was reviewed,lay theoretical basis for the future research.

Animal nutrition metabol ic diseases;System biology;Metabolomics;Pathogenesis

S856

A

1672-9692(2016)01-0052-06

2015-11-08

曹宇（1991-），男，黑龍江省大慶人，在讀研究生，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)。

張洪友（1960-），男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31072181）和國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD12B03-2）。