羊卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

佟桂芝，宋　斌，董正德

(黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

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羊卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

佟桂芝，宋斌，董正德

(黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

卵母細(xì)胞采集方法分為從屠體卵巢和活體采卵兩大類。屠體卵巢采卵主要有抽吸法和切割法。優(yōu)點是成本低廉，可以變廢為寶。缺點是胚胎的譜系不清。活體采卵技術(shù)有兩種分別是腹腔鏡采卵和超聲波引導(dǎo)陰道穿刺采卵。其優(yōu)點是對母羊損傷小、母羊利用率高、胚胎的譜系清楚。以及影響卵母細(xì)胞質(zhì)量和產(chǎn)量的因素：激素、血清、卵泡液、生長因子等一些因素的作用。現(xiàn)介紹目前羊卵母細(xì)胞采集和影響體外成熟因素方面的研究進(jìn)展。

羊；卵母細(xì)胞；采卵；體外成熟

羊卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)是進(jìn)行體外胚胎生產(chǎn)(IVP)、轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)以及輔助生殖(ART)技術(shù)開展的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。通過在成熟培養(yǎng)液中添加激素、生長因子等促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟已取得一定的進(jìn)展[1]。目前影響羊卵母細(xì)胞體外成熟的因素有以下幾個方面。

1　卵母細(xì)胞的采集

1.1屠體卵巢采集卵母細(xì)胞

從屠體卵巢獲得卵母細(xì)胞主要有抽吸法或切割法。抽吸法是用18號或20號注射器針頭從卵巢卵泡抽吸獲得卵母細(xì)胞。切割法為切割卵巢組織分離卵母細(xì)胞。這兩種方法能夠得到大量不同時期的卵母細(xì)胞。這種方法的最大優(yōu)點是材料來源豐富，成本低廉，但確定母畜的系譜困難[2]。

1.2活體取卵

1.2.1腹腔鏡采卵腹腔鏡采卵技術(shù)

腹腔鏡采卵腹腔鏡采卵技術(shù)[3]相對簡單且高效。這一技術(shù)快速、廉價并且能夠多次重復(fù)采卵，沒有并發(fā)癥。在對動物進(jìn)行常規(guī)麻醉后進(jìn)行，采卵大約耗時20min。腹腔鏡采卵技術(shù)可以用于經(jīng)過激素處理的母羊。每只綿羊每周可采卵2次，卵母細(xì)胞的回收率為68%，平均每只母羊每個發(fā)情周期能夠采集到4.6枚卵母細(xì)胞。經(jīng)超數(shù)排卵的山羊利用這一方法得到的卵母細(xì)胞回收率為75%～85%，平均每只山羊能夠得到13.5個卵母細(xì)胞。這一技術(shù)的主要缺點是用吸管從卵泡中吸出卵母細(xì)胞時會導(dǎo)致卵丘細(xì)胞丟失。

1.2.2超聲波引導(dǎo)陰道穿刺采卵

超聲波引導(dǎo)陰道穿刺采卵[4]是一種安全的卵母細(xì)胞采集方法。卵母細(xì)胞回收率類似于腹腔鏡采卵，但是能夠看到和抽取的卵泡數(shù)量比腹腔鏡采卵少。最好在對動物進(jìn)行eCG和FSH單獨或結(jié)合處理之后進(jìn)行采卵，這樣能夠增加可采卵泡數(shù)量。該技術(shù)在山羊已經(jīng)有應(yīng)用，但是想要成熟的掌握這一技術(shù)需要很多的實踐練習(xí)。

2　影響卵母細(xì)胞成熟的因素

2.1激素對卵母細(xì)胞的成熟起重要作用

在成熟液中添加促性腺激素(FSH和LH)和17β-雌二醇能夠提高卵母細(xì)胞的成熟率。促性腺激素是哺乳動物體外培養(yǎng)核成熟的主要調(diào)節(jié)器。成熟液中添加促性腺激素有助于羔羊的卵母細(xì)胞的成熟。雌二醇可能刺激DNA聚合酶β和提高假雄原核生長因子的合成,這兩種物質(zhì)都參與細(xì)胞質(zhì)的成熟。FSH起到誘發(fā)卵丘細(xì)胞擴(kuò)散，暫時性抑制生發(fā)泡破裂，延遲第一次成熟分裂的時間，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)成熟。LH能增強(qiáng)卵母細(xì)胞的存活力，引起卵丘細(xì)胞變化，便于精子受精。綿羊卵母細(xì)胞的研究中，人們添加不同濃度的FSH和LH，O'Brien等添加FSH和LH的量均為10μg/mL[5]。

2.2卵巢的運輸時間和溫度

牛、羊卵巢從屠宰場獲得。運輸溫度及時間很重要。牛卵巢在37～39℃保存8h，卵母細(xì)胞成熟率下降，25℃保存8h，成熟率沒有明顯變化(Yang等，1990)[6]。Moodie等[7]研究證明，綿羊卵巢在22℃保存數(shù)小時，卵母細(xì)胞成熟率無明顯影響；體溫條件，卵母細(xì)胞成熟率明顯下降。孫桂金等(2006)[8]實驗，運輸溫度在28℃卵母細(xì)胞成熟率顯著高于22℃和35℃ 。37℃接近綿羊體溫，卵巢生理活動旺盛，卵巢在離體環(huán)境中得不到充足的營養(yǎng)物質(zhì)，使卵母細(xì)胞中部分物質(zhì)發(fā)生降解。卵巢的貯存溫度對卵母細(xì)胞體外成熟的影響機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

2.3血清對卵母細(xì)胞體外成熟的影響

在成熟液中通常要加10%～20%熱滅活的血清，因為血清能夠為COCs提供營養(yǎng)并且能防止透明帶硬化[9]。大多數(shù)羊卵母細(xì)胞的體外成熟都用FBS。盡管在成熟液中的可以不添加發(fā)情山羊血清(EGS)，但是在不加促性腺激素時，添加10%FBS、10%EGS或者10%ESS的成熟液培養(yǎng)山羊卵母細(xì)胞能夠獲得很高的成熟率。成熟液中添加5%發(fā)情牛血清能提高綿羊卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量。(趙曉娥等，2005)[10]實驗證明，綿羊卵母細(xì)胞體外成熟時，添加血清顯著地提高成熟率。

2.4生長因子

表皮生長因子(EGF)，胰島素樣生長因子(IGF)等均影響卵母細(xì)胞體外成熟[11]。表皮生長因子(EGF)能影響多種哺乳動物卵母細(xì)胞成熟和囊胚發(fā)生，也可能影響到綿羊和山羊卵泡生長和卵母細(xì)胞成熟。在有表皮生長因子存在的情況下綿羊卵母細(xì)胞能夠獲得更多的卵丘細(xì)胞擴(kuò)展和更高的受精率。EGF添加量在3ng/mL以下對山羊卵母細(xì)胞體外成熟沒有顯著影響。在成熟液中添加50ng/mL EGF能提高山羊胚胎生產(chǎn)率。在成熟液中添加神經(jīng)生長因子恢復(fù)減數(shù)分裂的卵母細(xì)胞大于70%。而胰島素樣生長因子-1(IGF-1)不會對卵母細(xì)胞成熟產(chǎn)生影響[11]。在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液M199中加入EGF，發(fā)現(xiàn)濃度(1、10、100 pg/L)可促進(jìn)卵丘擴(kuò)張，顯著提高卵母細(xì)胞達(dá)到M II期比例。艾繼輝(2003)[12]等證明：EGF可促進(jìn)裸卵的成熟率。魯進(jìn)等(2005)[13]研究表明，顆粒細(xì)胞分泌的IGF-1單獨或與促性腺激素協(xié)同作用能促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。宋凱等(2014)[14]本試驗僅在成熟培養(yǎng)階段的不同培養(yǎng)液(血清培養(yǎng)體系，F(xiàn)BS和牛血清白蛋白培養(yǎng)體系，BSA)中添加不同濃度VEGF(5ng/mL和10ng/mL)，結(jié)果添加血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)兩試驗組卵母細(xì)胞成熟率提高到84.61%和82.87%(P<0.01)；BSA體系中，2試驗組成熟率分別提高到82.40%和79.21% (P<0.01)，無論是FBS體系還是BSA體系，添加VEGF的各個試驗組成熟卵經(jīng)受精后的胚胎發(fā)育都有不同程度的提高，且具有差異顯著性。VEGF可能與血清中的未知因子協(xié)同作用，有效地提高了羊卵母細(xì)胞體外成熟率。

2.5卵丘細(xì)胞的影響

黃承俊等(2014)[15]試驗表明：添加離散卵丘細(xì)胞能夠顯著促進(jìn)機(jī)械裸卵(DOs)的體外成熟(57.98±14.27 VS 35.53±14.00，P<0.05)，對卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)具有促進(jìn)趨勢但差異不顯著(76.66±5.77 VS 66.76±9.46，P>0.05)；卵母細(xì)胞胞外卵丘細(xì)胞對共培養(yǎng)的DOs的體外成熟促進(jìn)作用效果不明顯(35.83±18.32 VS 35.53±14.00，P>0.05)。結(jié)果表明：添加的離散卵丘細(xì)胞主要以旁分泌途徑促進(jìn)卵母細(xì)胞的體外成熟；3層及其以上胞外卵丘細(xì)胞能夠提高其包裹的卵母細(xì)胞平均體外成熟能力的85.34%，添加的離散卵丘細(xì)胞能夠提高COC平均體外成熟能力的16.18%，能夠提高DO平均體外成熟能力的60.61%。

2.6卵泡直徑、卵泡直徑和卵母細(xì)胞成熟率相關(guān)

卵泡直徑、卵泡直徑和卵母細(xì)胞成熟率相關(guān),Crozet等[15]的實驗表明成年山羊的卵泡直徑和卵母細(xì)胞成熟力及早期胚胎體外發(fā)育力有直接的關(guān)系，卵母細(xì)胞來自直徑大于5mm的卵泡的經(jīng)體外成熟、體外受精、胚胎體外培養(yǎng)發(fā)育到囊胚的能力明顯高于小卵泡。但性未成熟山羊卵巢中卵泡直徑大多數(shù)為2.5～3mm，所以從性未成熟山羊中很難采集到直徑大于5mm的卵泡。因此從性未成熟山羊獲得的卵母細(xì)胞在發(fā)育能力上比成年山羊低。卵母細(xì)胞直徑與其發(fā)育能力有直接關(guān)系，直徑大于135μm的山羊卵母細(xì)胞發(fā)育能力最強(qiáng)，直徑小于110μm的卵母細(xì)胞不能成熟發(fā)育。直徑大的卵母細(xì)胞發(fā)育能力強(qiáng)可能和MPF活性有關(guān)，直徑較大的山羊卵母細(xì)胞經(jīng)過體外成熟培養(yǎng)后其MPF活性明顯高于直徑小的卵母細(xì)胞。史文升(2008)[16]試驗表明：卵泡直徑2mm≤D≤8mm的卵泡中的卵母細(xì)胞體外成熟率明顯高于8mm

2.7褪黑素的影響

活性氧(ROS)是決定卵母細(xì)胞成熟、胚胎發(fā)育及其形態(tài)改變的重要因素。王超(2011)[17]發(fā)現(xiàn)牛卵母細(xì)胞體外成熟時填加10～50ng/mL褪黑素能促進(jìn)卵母細(xì)胞從MⅠ到MⅡ期的發(fā)育，提高核的成熟率，對于胞質(zhì)線粒體的均勻分布卵丘擴(kuò)展起促進(jìn)作用。進(jìn)行體外成熟過程中卵母細(xì)胞，氧氣濃度、褪黑素的功能；高氧濃度下，褪黑素能顯著促進(jìn)牛卵母細(xì)胞成熟，這意味著褪黑素作用的發(fā)揮依賴于培養(yǎng)條件。李曉霞等(2015)[18]，添加10 M 褪黑素既可顯著提高牛卵母細(xì)胞的成熟率(62.5 VS 77.8 )(P<0．05)；受精后胚胎體外發(fā)育的卵裂率(53.2 VS 67.6 )(P<0.05)和囊胚率(20.3 VS 35.4)。裸卵暴露在ROS中會導(dǎo)致減數(shù)分裂靜止及卵母細(xì)胞退化。不同階段卵母細(xì)胞抵抗ROS的能力決定著發(fā)育能力。

最近幾年的科研在羊卵母細(xì)胞采集技術(shù)以及體外成熟技術(shù)上取得很大進(jìn)展，使體外胚胎的移植妊娠率和產(chǎn)羔率有了較大的提高。弄清卵母細(xì)胞成熟的分子水平控制機(jī)制將有助于發(fā)現(xiàn)影響胎兒及胎盤發(fā)育的因素和造成胎兒異常及妊娠異常的原因是體外胚胎，最終提高體外生產(chǎn)羊、轉(zhuǎn)基因羊及克隆羊等的胚胎質(zhì)量和效率。

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2015-12-16

2015-12-17

佟桂芝(1967-)，女，研究員，碩士，從事反芻動物的飼養(yǎng)與繁殖工作。

10.19369/j.cnki.2095-9737.2016.09.004

S826.3

A

2095-9737(2016)09-0007-02