禽源性大腸桿菌研究進(jìn)展

嚴(yán)杜建

（阿克蘇職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，新疆 阿克蘇 843000）

禽源性大腸桿菌研究進(jìn)展

嚴(yán)杜建

（阿克蘇職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，新疆 阿克蘇 843000）

禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌的某些致病性血清型所引起的一種原發(fā)性或繼發(fā)性疾病。臨床上常表現(xiàn)為氣囊炎、腹膜炎、急性敗血癥和出血性腸炎等癥狀。主要從禽大腸桿菌的危害、耐藥性、特異性抗體的制備及其應(yīng)用等方面進(jìn)行了概述。

大腸桿菌；耐藥性；特異性抗體；禽

禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌（Escherichia coli）的某些致病性血清型所引起的禽的一類疾病的總稱［1］。近年來，隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)集約化程度不斷提高，該病已上升為危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)最主要的疾病之一。雖然抗菌藥物的應(yīng)用對(duì)大腸桿菌病有一定的防治作用，但同時(shí)也會(huì)加劇大腸桿菌耐藥菌株的產(chǎn)生，使得該病的防治變得更加棘手。為了尋求一條有效的防治途徑，國(guó)內(nèi)外許多科技工作者進(jìn)行了大量有關(guān)大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)、耐藥機(jī)制探討、特異性抗體的研究及其應(yīng)用，并已取得了一系列的成果。

1 大腸桿菌對(duì)禽的危害

近十幾年來，禽大腸桿菌已上升為我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)最主要也是預(yù)防最棘手的疾病之一，而且該病常與其他病并發(fā)或繼發(fā)，易造成極高的死亡率［2］。目前已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋鴨群也流行該病，這也嚴(yán)重影響了蛋鴨產(chǎn)蛋率及其后代的生長(zhǎng)發(fā)育。近年來的鴨大腸桿菌病血清型調(diào)查發(fā)現(xiàn)，O1、O2、O3、O78 等血清型就占很大一部分。劉栓江等［3］在對(duì)河北定州發(fā)病鴨場(chǎng)菌株分離時(shí)發(fā)現(xiàn)，鴨大腸桿菌的主要血清型是O2和O3型。我國(guó)各地區(qū)鴨大腸桿菌病流行血清型統(tǒng)計(jì)也表明了 O1、O2、O78 占據(jù)主要部分［4］。

2 大腸桿菌的耐藥性

2.1 大腸桿菌對(duì)某些抗菌藥物的耐藥性 大腸桿菌病臨床治療用藥種類繁多，由于這些抗菌藥物的濫用，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥菌株的不斷增加，耐藥譜也在不斷擴(kuò)大。據(jù)統(tǒng)計(jì)［5］，20世紀(jì)80年代到90年代，大腸桿菌敏感株百分比呈下降趨勢(shì)；20世紀(jì)90年代到2000年，大腸桿菌敏感和中度敏感株比例下降，而耐藥株比例增加。張秀英等［6］試驗(yàn)表明，大腸桿菌耐藥率基本順序?yàn)椋狠拎に幔舅沫h(huán)素＞磺胺甲基異噁唑＞復(fù)方新諾明 （甲氧芐啶）＞第2，3代喹諾酮類＞氨芐西林、阿莫西林＞氯霉素、鏈霉素＞卡那霉素＞頭孢噻吩＞慶大霉素＞氟苯尼考＞阿米卡星、頭孢曲松。吳志鋼等報(bào)道［7］，由于恩諾沙星、氧氟沙星、氨芐青霉素等藥物的廣泛使用，大腸桿菌對(duì)其產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性，而以預(yù)防藥、添加劑形式添加在飼料中的喹乙醇、痢菌凈和氯霉素也加劇了大腸桿菌耐藥菌株的產(chǎn)生。

2.2 大腸桿菌的耐藥性機(jī)制 大腸桿菌是臨床上由質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥性的主要細(xì)菌之一。1959—1960年在日本由Akiba和Ochiai等發(fā)現(xiàn)并證實(shí)多重耐藥性可在大腸桿菌和志賀菌之間互相傳遞，1962年將該種傳遞耐藥性的因子命名為耐藥性因子或R因子。1963年Lebek在研究致病性大腸桿菌時(shí)發(fā)現(xiàn)了R質(zhì)粒［8］。1969年Smith曾親自服用帶有R質(zhì)粒的大腸桿菌，證明R質(zhì)粒的出現(xiàn)與使用抗生素呈正相關(guān)。其后還有很多關(guān)于正常人、病人及畜禽R質(zhì)粒檢出情況的報(bào)道［9］。這些耐藥性質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥菌株主要是通過以下2種方式來使宿主細(xì)菌失去對(duì)抗菌藥物的敏感性：

2.2.1 指令合成鈍化酶和同工酶：鈍化酶是一類能使抗微生物藥物失去或降低抗菌活性的酶，可使藥物分解或取代生成沒有抗菌活性或不能滲入細(xì)胞內(nèi)的新產(chǎn)物。如大腸桿菌所產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶可以打開青霉素和頭孢菌素類藥物子結(jié)構(gòu)中的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使其完全失去活性，產(chǎn)生的磷酸轉(zhuǎn)移酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶及腺轉(zhuǎn)移酶可分別通過羧基磷酸化、氨基乙?；Ⅳ然佘挣；饔檬拱被擒疹愃幬锓肿咏Y(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使之失去作用，如對(duì)氯霉素的耐藥性即是由于產(chǎn)生乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素乙?；セ钚裕?0］。同工酶則主要是取代菌細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)被抗菌藥物頡頏的酶，使阻斷的代謝過程恢復(fù)，如對(duì)磺胺類藥物的耐藥性就是由于合成二氫碟酸合成酶以代替原有的被磺胺類藥物頡頏的二氫葉酸合成酶，同樣對(duì)甲氧芐啶（TMP）的抗性也是由于合成一種新的不受TMP影響的二氫葉酸還原酶。

2.2.2 改變細(xì)胞膜對(duì)藥物的通透性：例如細(xì)胞膜對(duì)四環(huán)素通透性的改變，是由于質(zhì)粒指令合成一種新的膜結(jié)合蛋白質(zhì)使四環(huán)素外排加強(qiáng)，進(jìn)入細(xì)胞的藥物量減少，達(dá)不到抑菌濃度，從而產(chǎn)生耐藥性。

3 禽大腸桿菌特異性抗體的制備

3.1 禽大腸桿菌特異性抗體的常規(guī)制備方法

3.1.1 免疫原的制備：免疫原是制備高效特異性抗體的必要條件。菌株選擇是否正確，其免疫原性強(qiáng)弱，決定了抗體的療效。劉清河等［11］采用常見的致病性大腸桿菌菌株制備了O、K凝集原，隨機(jī)采集了感染大腸桿菌動(dòng)物的血清并與制備好的O、K凝集原進(jìn)行試管凝集試驗(yàn)，根據(jù)動(dòng)物天然抗體凝集效價(jià)，了解當(dāng)?shù)卮竽c桿菌優(yōu)勢(shì)血清型，為制備有效特異性抗體提供了有力依據(jù)。另外，也可以直接從發(fā)生大腸桿菌的疫地采集病料，在分離鑒定為致病性大腸桿菌后，利用平板凝集試驗(yàn)對(duì)大腸桿菌血清型進(jìn)行粗略鑒定。其方法是［12］，對(duì)要分離鑒定的大腸桿菌進(jìn)行純化培養(yǎng)后，用少量5%石炭酸生理鹽水或0.5%氫氧化鈉溶液將菌苔洗下，制成濃稠菌懸液，在121℃高壓環(huán)境中作用2～2.5 h以破壞其K抗原及H抗原，待其冷卻后取1 mL O抗原單價(jià)血清（作適當(dāng)稀釋）在玻板上與其混勻，在0.5～1 min內(nèi)觀察結(jié)果，出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng)，同時(shí)也應(yīng)設(shè)立陰性對(duì)照。上述2種方法對(duì)比起來，前者的操作更為簡(jiǎn)便，能夠抓住治療時(shí)機(jī)，可以避免造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。

3.1.2 高免血清的制備：在制備高免血清前，必須考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇問題。若動(dòng)物在未注射所試驗(yàn)的免疫原之前，就已經(jīng)在體內(nèi)存在了該抗體，而事先卻沒有進(jìn)行該抗體測(cè)定就進(jìn)行接種，勢(shì)必會(huì)影響結(jié)果的判定。所以可采用玻板凝集法或試管凝集試驗(yàn)法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液中是否含有大腸桿菌抗體，只有在測(cè)定其不含有大腸桿菌抗體時(shí)才可選擇其作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［13］。

動(dòng)物免疫接種可選用肌肉注射、皮下注射或靜脈注射等方法，試驗(yàn)表明，免疫間隔時(shí)間和免疫劑量不同，會(huì)直接影響抗體產(chǎn)生的效果。同時(shí)在免疫過程中，還要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作以防抗原被污染及免疫動(dòng)物被其他病原菌感染。菅新宇等［12］采用5次免疫接種，劑量依次為 0.2、0.4、0.6、1、2 mL，免疫間隔時(shí)間為2 d，最后一次免疫后第10天頸動(dòng)脈采血，用試管凝集試驗(yàn)測(cè)得抗血清效價(jià)為5 120。蘇敬良等［14］采用 4 次免疫接種，劑量依次為 0.5、1、2、4 mL，每次接種間隔時(shí)間為5 d，最后一次免疫接種后第10天頸動(dòng)脈采血，測(cè)得效價(jià)均在5 120以上。

根據(jù)大腸桿菌的免疫特性，動(dòng)物在接種2 d后就有抗體產(chǎn)生，在第6天達(dá)到高峰，以后再進(jìn)行加強(qiáng)免疫時(shí)，就能充分啟動(dòng)動(dòng)物的免疫應(yīng)答系統(tǒng)，產(chǎn)生更多抗體，但為了避免抗原與抗體間相互影響，增強(qiáng)免疫接種時(shí)應(yīng)間隔適當(dāng)時(shí)間，根據(jù)接種劑量、方法等可選擇在 2～10 d 不等［15］。

經(jīng)免疫接種的動(dòng)物，在最后一次接種7～11 d后采血。動(dòng)物在采血前24 h禁食，只供給飲水滿足其機(jī)體代謝需要，以防血液中血脂濃度過高［13］。

3.2 禽大腸桿菌特異性抗體制備新進(jìn)展 對(duì)大腸桿菌特異性抗體的研究中，張靖飛等［16］從大腸桿菌細(xì)胞壁外膜蛋白出發(fā)，首先對(duì)外膜蛋白進(jìn)行提取，采用SDS-PAG方法分型，從而確定菌株的血清型，然后用常規(guī)方法制備抗體。陳永鋒等［17］在該基礎(chǔ)上研究證明了O78血清型內(nèi)相同的不同外膜蛋白型分離株間能獲得最大保護(hù)，O18血清型內(nèi)相同的外膜蛋白分離株間也能獲得最大保護(hù)，但對(duì)不同的外膜蛋白分離株間不能提供保護(hù)。上述2個(gè)血清型分離株間無論膜外蛋白是否相同，均不能提供交叉保護(hù)。研究表明［18］，膜外蛋白能夠客觀反映大腸桿菌分離株的遺傳相關(guān)性，外膜蛋白在大腸桿菌致病性和免疫中都起重要作用，對(duì)膜外蛋白的研究必將成為大腸桿菌病的研究熱點(diǎn)。姜平等［19］研究表明，O78和O18的1型菌毛抗原有較大差異，這就為大腸桿菌R質(zhì)粒的普遍存在性和不同性奠定了充實(shí)的依據(jù)，同時(shí)也為弄清大腸桿菌免疫保護(hù)、O血清型及菌體的外膜蛋白型間的關(guān)系提供了研究方向。李福玲等［20］在對(duì)基礎(chǔ)疫苗中的蛋白進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，該種基礎(chǔ)疫苗的蛋白含有多個(gè)保護(hù)性多肽抗原結(jié)合位點(diǎn)，可以根據(jù)這些結(jié)合位點(diǎn)的特性，利用基因技術(shù)制備出新的疫苗。

4 特異性抗體效價(jià)的測(cè)定

抗體效價(jià)測(cè)定是依據(jù)細(xì)菌菌體與全血或血清中特異性抗體反應(yīng)而發(fā)生凝集形成凝聚顆粒或凝聚塊。根據(jù)凝聚顆?；蚰蹓K多少、大小、抗原抗體混合液透明度來判定抗體的效價(jià)［21］。常采用的方法有玻板凝集法和試管凝集試驗(yàn)法，但玻板凝集法更多適用于檢查抗原和抗體的有無，多數(shù)研究均以試管凝集試驗(yàn)法來判定，其方法是取10個(gè)潔凈的凝集小管，依次加入0.5 mL的生理鹽水。取以1︰10比例稀釋的大腸桿菌抗血清0.5 mL加入1號(hào)管，混勻后取0.5 mL加入2號(hào)管，混勻后又取0.5 mL加入3號(hào)管，依次下去，9號(hào)管吸取0.5 mL棄去。從10號(hào)管開始從右向左依次加入0.5 mL大腸桿菌懸液（10億/mL）混勻，37℃靜置 4～12 h，使抗原抗體充分反應(yīng)，以50%凝集（細(xì)菌部分凝集沉于管底，凝集塊呈顆粒狀，菌液半澄清）作為判定標(biāo)準(zhǔn)。也有人用微量法測(cè)定血清的效價(jià)，該試驗(yàn)是在一次性塑料微量試驗(yàn)板中進(jìn)行，但與試管凝集試驗(yàn)法相比，該方法所用血清和抗原的量都很少。因此，該方法雖然可以降低試驗(yàn)成本和縮短試驗(yàn)時(shí)間，但凝集結(jié)果不是很顯著，易給結(jié)果判定造成一定困難。在試驗(yàn)中，通常配合試管凝集試驗(yàn)法使用，而不單獨(dú)應(yīng)用。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用也在不斷擴(kuò)大。它是將抗原抗體反應(yīng)特異性與酶促反應(yīng)的敏感性相結(jié)合而建立的免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。運(yùn)用于該技術(shù)的辣根過氧化物酶（HRP）與大腸桿菌特異性抗體分子可發(fā)生共價(jià)結(jié)合，而且彼此之間互不影響生物化學(xué)活性。當(dāng)抗體與抗原結(jié)合后，在溶液中底物的參與下，產(chǎn)生肉眼可見的顏色反應(yīng)，而顏色反應(yīng)的深淺程度與溶液中抗原抗體的量成正比［13］，由此即可檢測(cè)出抗血清效價(jià)。

5 大腸桿菌特異性抗體的應(yīng)用

5.1 免疫預(yù)防作用 考慮到大腸桿菌特異性抗體免疫有較強(qiáng)的針對(duì)性，在應(yīng)用其進(jìn)行免疫接種之前，應(yīng)對(duì)當(dāng)?shù)鼗蝠B(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌致病性血清型作大致調(diào)查，根據(jù)調(diào)查結(jié)果選擇與其相對(duì)應(yīng)的特異性抗體，這樣才能使大腸桿菌特異性抗體產(chǎn)生最好的預(yù)防效果。據(jù)資料報(bào)道，有針對(duì)性的免疫接種能更好地刺激免疫系統(tǒng)，活化免疫功能。劉清河等［11］研究表明，用特異性抗體免疫接種動(dòng)物，不但能預(yù)防疾病，還能在一定程度上促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，這種作用在因抗生素濫用而防治效果不理想的今天，無疑對(duì)今后藥物的研究有較大臨床指導(dǎo)意義。

在應(yīng)用特異性抗體時(shí)，還要把母源抗體的影響考慮在內(nèi)。對(duì)于2周齡內(nèi)的雛鴨而言，由于其體內(nèi)尚有較高母源抗體，若在該期間使用特異性抗體，效果會(huì)大打折扣。因此，雛鴨初免常選在3周左右，在40～60日齡時(shí)再進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，即可產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫力。

5.2 診斷作用 自1975年Mistein和Kohler首先報(bào)道應(yīng)用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制取出單克隆抗體以來，該技術(shù)和研究已取得了很大的發(fā)展。目前，國(guó)內(nèi)外已用該方法制成多種診斷用的單克隆抗體，大腸桿菌特異性抗體就是單克隆抗體其中的一種。單克隆抗體最大的優(yōu)點(diǎn)是它只針對(duì)一個(gè)抗原決定簇，故特異性非常高，抗體分子屬于同一類或亞類免疫球蛋白，非常均勻和純一，易標(biāo)準(zhǔn)化，抗體親和力不變，重復(fù)性強(qiáng)，產(chǎn)量高，易大量制備［22］。

目前，免疫熒光抗體檢測(cè)（IF）技術(shù)也得到了廣泛應(yīng)用。免疫熒光抗體檢測(cè)是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光顯微技術(shù)的精確性、敏感性相結(jié)合的免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。當(dāng)熒光色素與大腸桿菌抗血清中的抗體結(jié)合后（在不影響抗體蛋白分子免疫活性條件下）與標(biāo)本涂片中的特異性抗原結(jié)合，最終形成比較固定、不易被緩沖液洗脫的物質(zhì)，該物質(zhì)在熒光顯微鏡下可檢測(cè)到熒光，由此可判斷抗原或抗體的存在和相應(yīng)菌株分布情況［13］。

總之，隨著科技的進(jìn)步和人們對(duì)食品品質(zhì)要求的不斷提高，新的具有有效性、低毒性、病原特異性、增強(qiáng)免疫功能性及良好藥物動(dòng)力學(xué)等特征的抗體將會(huì)出現(xiàn)，抗體在預(yù)防疾病等生命科學(xué)中的地位和作用將會(huì)顯得越來越嚴(yán)重，禽大腸桿菌病必將得到有效地防控。

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Research Progress on Pathogenic Escherichia coli from Avian Origin

YAN Du-jian
（Department of Bioengineering，Aks Vocational and Technical College，Aksu 843000，China）

Avian colibacillosis is a primary or secondary disease caused by infection of Escherichia coli with certain pathogenic serotypes.The clinical symptoms involved in this disease include airsacculitis,peritonitis,acute septicemia and hemorrhagic enteritis,etc.The research progress on pathogenic Escherichia coli from avian origin was reviewed on the aspects of harm,antimicrobial resistance,preparation and employment of specific antibody.

Escherichia coli；antimicrobial resistance；specific antibody；avian

S858.351.2

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）04-0087-03

2016-01-26

項(xiàng)目來源：阿克蘇職業(yè)技術(shù)學(xué)院校級(jí)重點(diǎn)項(xiàng)目（KJZ-2015-01）。

嚴(yán)杜建（1979—），男，講師，碩士，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物疾病診療。

（責(zé)任編輯：慕宗杰）