非酒精性脂肪性肝病動物模型研究進(jìn)展

喻 琴綜述，王 麗審校

（西南醫(yī)科大學(xué)：1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川瀘州 646000）

非酒精性脂肪性肝病動物模型研究進(jìn)展

喻 琴1綜述，王 麗2審校

（西南醫(yī)科大學(xué)：1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川瀘州 646000）

非酒精性脂肪性肝??；脂肪性肝炎；動物模型

非酒精性脂肪性肝病 （nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指由非酒精因素和其他不明病因所致的，以大量脂肪堆積于肝細(xì)胞內(nèi)為主要特征的臨床病理綜合征，可從單純性脂肪肝發(fā)展至脂肪性肝炎、肝纖維化，甚至導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生。其病理改變主要有肝細(xì)胞脂肪變性、肝細(xì)胞氣球樣變、以淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤和纖維化等[1]。近年來，隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國的NAFLD發(fā)病率成逐年上升趨勢，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，其病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍未完全闡明，其主要環(huán)節(jié)可能是胰島素抵抗（IR）和氧化應(yīng)激，此外，脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素、內(nèi)脂素及腫瘤壞死因子-α等多種脂肪細(xì)胞因子也參與了肝臟脂肪變性、炎細(xì)胞浸潤及纖維化改變[2]。為深入研究其發(fā)病機(jī)制，有效地預(yù)防和治療NAFLD，建立理想的能涵蓋人體病理改變的動物模型極為重要。本文就近幾年國內(nèi)外常見的NAFLD動物模型的優(yōu)缺點(diǎn)及最新研究進(jìn)展做一綜述，以期為根據(jù)不同實驗?zāi)康倪x擇相應(yīng)的實驗動物模型提供參考，且為以后建立更穩(wěn)定的與人類病變更為相似的模型打下基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)外用于科研的NAFLD動物模型主要有營養(yǎng)失調(diào)性模型、藥物中毒性模型、基因敲除或基因突變性模型、復(fù)合性模型，茲介紹如下。

1 營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝模型

目前 ，營養(yǎng)失調(diào)性模型仍是最常見的NAFLD模型，即給予動物高脂、高糖飼料喂養(yǎng)建立的脂肪肝模型。其主要發(fā)病機(jī)理是營養(yǎng)過剩，食物中脂類、膽固醇或（和）糖類過量，無法完全吸收利用，脂類堆積于肝臟而引發(fā)脂肪肝，進(jìn)一步出現(xiàn)炎癥改變及纖維化?？山I養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝模型的動物種屬很多，主要包括大鼠、小鼠 、家兔 、雞 、豬等 ，其中大鼠最為常見 。

1.1 大 鼠

大鼠是建立脂肪肝動物模型最常用的動物種屬。不同的飼料配方（高脂高糖飼料）均可成功建立非酒精性脂肪肝模型。

1.1.1 高脂飼料誘發(fā)模型

目前，國內(nèi)外學(xué)者大多采用基礎(chǔ)飼料加豬油或膽固醇或蛋黃喂養(yǎng)大鼠建立高脂飼料脂肪肝模型。劉云龍等[3]用基礎(chǔ)飼料加15%豬油、13%雞蛋黃粉、5%全脂奶粉和2%白砂糖喂養(yǎng)雄性SD大鼠12周，成功建立脂肪肝模型，并用此模型研究綠原酸對高脂飼料誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響[3]。樊希承等[4]用含10%豬油、1%膽固醇、0.3%膽鹽的高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠，7周后大鼠肝實質(zhì)細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，造模成功，并應(yīng)用此模型觀察脂肪肝的逆轉(zhuǎn)狀況，評價脂肪肝轉(zhuǎn)歸的影響因素，發(fā)現(xiàn)多數(shù)單純性脂肪肝如能早期診治，可以阻止脂肪肝的進(jìn)一步發(fā)展并使其逆轉(zhuǎn)，抗脂肪肝治療好于自然恢復(fù)。此類模型存在的主要缺點(diǎn)是造模時間長、病變輕。但由于造模方法簡便、重復(fù)性好、動物死亡率低且與臨床高脂血癥或肥胖引起的脂肪肝相似，造模停止后病變逆轉(zhuǎn)緩慢便于藥物干預(yù)研究，目前仍是國內(nèi)外最常用的NAFLD模型。

此外，也有學(xué)者采用高脂液體飼料喂養(yǎng)大鼠造模，此種模型造模所需時間較大鼠自由進(jìn)食高脂固體飼料短，發(fā)病機(jī)制與人體高脂血癥引起的脂肪肝相似，但每天灌胃較為繁瑣，且如操作不當(dāng)易損傷動物食道或引起動物窒息死亡。

1.1.2 高糖飼料誘發(fā)模型

Kawasaki等[5]用富含果糖的飲食喂養(yǎng)5周齡的Wistar大鼠5周，肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的大泡性脂肪變 、肝臟與體重的比值增加、肝臟甘油三脂濃度增加，造模成功，其形成機(jī)制與我國部分人群不良飲食習(xí)慣導(dǎo)致的脂肪肝類似。有不少學(xué)者采用禁食+高糖的方法建立脂肪肝模型，多將雄性Wistar大鼠禁食48 h后給予高糖飼料（雙糖、淀粉），2 d后形成單純性脂肪肝。該脂肪肝模型的形成可能與肝臟合成脂肪酸的循環(huán)失衡和甘油三酯的合成與分泌失衡有關(guān)。此模型具有造模時間短、成功率高、便于觀察的特點(diǎn)；但最大的缺陷在于禁食48 h后再進(jìn)食與人體自然發(fā)病機(jī)制不相符，也因此限制了其應(yīng)用。

1.2 其他動物種屬

除了大鼠，小鼠、家兔、雞和豬也可用于建立NAFLD模型。盡管小鼠生命周期較短，不太適合長時間給藥觀察，但由于體型小，易于飼養(yǎng)和管理，仍有越來越多的高脂誘導(dǎo)小鼠脂肪肝模型被建立。Seung等[6]用兩種脂肪含量不同（45%和60%）的高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠建立脂肪肝模型，并研究一氧化氮合酶在脂肪肝模型中的分布情況，15周后成功建立NAFLD模型，且60%脂肪熱量組的肝細(xì)胞小泡性脂肪變比45%脂肪熱量組的更嚴(yán)重，同時觀察到一氧化氮合酶在脂肪肝模型組中的分布比正常組多，這為后續(xù)的肥胖、糖尿病及NAFLD的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。此外，也有人用兔、雞和豬建立營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝模型，有學(xué)者以高脂飼料喂養(yǎng)雄性新西蘭家兔，建模成功[7]，這種模型體積大，適合臨床影像學(xué)檢查，這是其他小型動物不具有的特點(diǎn)；國外學(xué)者曾用高脂糊狀飼料喂養(yǎng)3周齡的雄性白色來航雞，6個月后雞肝組織出現(xiàn)大、小泡混合性脂肪變性以及大范圍的炎癥浸潤[8]，此種模型建模時間長，限制了其應(yīng)用；有少數(shù)人用豬建立營養(yǎng)失調(diào)性NAFLD模型[9]，雖然豬與人類的NAFLD病史更為相似，但是飼養(yǎng)成本較高，目前應(yīng)用也不多。

2 藥物中毒性脂肪肝模型

目前國內(nèi)外常用四氯化碳（CC14）、四環(huán)素、乙硫氨酸等藥物建立中毒性非酒精性脂肪肝模型。

2.1 四氯化碳誘發(fā)模型

四氯化碳是最早用于建立中毒性脂肪肝模型的化學(xué)物質(zhì)，是一種肝毒性藥物，可造成急性肝損傷，其主要機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)CYP2E1激活及嚴(yán)重脂質(zhì)過氧化反應(yīng)造成肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能破壞。給予大鼠皮下注射四氯化碳0.5 mL/kg，每周3次，短時間內(nèi)即可觀察到中重度大泡性肝細(xì)胞脂肪變，伴炎癥及壞死。此外，以四氯化碳灌胃也可建立脂肪肝模型，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物研究[10]。

2.2 四環(huán)素誘發(fā)模型

四環(huán)素是一種抗生素類化學(xué)藥物，可用于誘發(fā)動物脂肪肝，主要通過干擾線粒體DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，影響線粒體脂肪酸β-氧化，繼而造成肝細(xì)胞脂肪變性。Yin等[11]給2組雄性CD-1（ICR）BR Swiss大鼠一次性口服四環(huán)素0.1 g/kg或1 g/kg后，高劑量組大鼠在24 h即可見肝細(xì)胞小泡性脂肪變，并發(fā)現(xiàn)脂肪酸的β-氧化受抑制，也應(yīng)用此模型做NAFLD基因方面的研究，其他學(xué)者采用腹腔注射四環(huán)素的方法也獲得了類似結(jié)果[12]。

2.3 乙硫氨酸誘發(fā)模型

乙硫氨酸可使肝臟蛋白質(zhì)合成發(fā)生障礙，進(jìn)而使載脂蛋白的復(fù)合物生成減少，導(dǎo)致三酰甘油蓄積于肝臟，引起脂肪肝。Leclercq I等人給予白鼠腹腔注射乙硫氨酸0.02 mmol/kg/ d，連續(xù)7 d后處死白鼠，肝組織病理學(xué)切片顯示出現(xiàn)了肝細(xì)胞小泡性脂肪病變。近年來，國內(nèi)學(xué)者用乙硫氨酸灌胃的方法也成功建立小鼠脂肪肝模型[13]。

以上幾種中毒性模型具有建模迅速、方法簡便、病變明顯的優(yōu)點(diǎn)，但其發(fā)病機(jī)制、病理、病理生理改變與人體非酒精性脂肪肝差異較大，且多數(shù)藥物毒性強(qiáng)，動物死亡率高，研究者可根據(jù)其研究目的和研究條件決定是否建立此類模型。

3 基因敲除或基因突變性脂肪肝模型

脂肪肝的形成不僅受飲食等環(huán)境因素的影響，也與遺傳學(xué)因素密切相關(guān)，基因水平的變化可造成肝細(xì)胞脂肪變性。通過人為地對動物進(jìn)行基因敲除或使其基因突變可建立非酒精性脂肪肝模型。

3.1 FLS小鼠模型

Soga等用同系交配的方法建立了一個新種系的小鼠，即FLS（fatty liver shionogi）小鼠，這種基因突變小鼠可自發(fā)形成脂肪肝，甚至發(fā)展成肝癌，但不伴有肥胖和糖尿病。新生 FLS小鼠肝細(xì)胞內(nèi)含有大小不等的脂滴，隨鼠齡增長，脂滴進(jìn)行性增大，肝內(nèi)甘油三酯（triglyceride，TG）的含量明顯增加，達(dá)到正常小鼠的5倍，易自發(fā)形成肝細(xì)胞癌。雜交實驗提示FLS小鼠的脂肪肝具有多基因特征，可用于研究肝脂肪變性進(jìn)展成肝癌的病因和發(fā)病機(jī)制。

3.2 ADK-/-小鼠模型

Boison等用破壞腺苷激酶（adenosine kinase，ADK）基因的方法成功建立出生后致死性NAFLD模型。ADK-/-小鼠胚胎發(fā)育正常，出生后4 d即發(fā)生肝細(xì)胞小泡性脂肪變，并于2周內(nèi)死亡。該模型建立所需時間短，但最大的缺陷在于模型是快速致死性的，不能用于藥物療效觀察等方面的研究，實際應(yīng)用受限。

3.3 ArKO小鼠模型

Chow等[14]通過敲除芳香酶基因Cyp9（aromatase knockout，ArKO）建立了小鼠脂肪肝模型[14]，研究發(fā)現(xiàn)雌激素α受體激動劑可改善小鼠脂肪肝變性。芳香酶基因Cyp9敲除后，小鼠不能合成內(nèi)源性雌激素，導(dǎo)致腹腔內(nèi)脂肪細(xì)胞的體積和數(shù)量顯著高于野生型同窩鼠，提示雌激素在維持脂肪代謝中具有重要作用[15]。

3.4 肝細(xì)胞特異性PTEN缺陷小鼠模型

磷酸酶及強(qiáng)力蛋白同源蛋白（phosphataseandtensinhomologdetectedon chromosometen，PTEN）是一種位于10號染色體上的抑癌基因，是以磷酯酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PIP3） 為基質(zhì)的磷酸酶[16]，PTEN缺陷細(xì)胞表現(xiàn)為其生長和代謝亢進(jìn)，易于癌變。Horie Y等[17]特異性敲除小鼠肝細(xì)胞PTEN基因，建立NAFLD模型，在此模型可見肝細(xì)胞脂肪變性和風(fēng)帆樣腫大、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤、旁竇狀隙纖維化和出現(xiàn)Mallory小體等酷似人NAFLD的病理學(xué)改變[17]，重現(xiàn)“單純性脂肪肝-脂肪性肝炎-肝纖維化”的NAFLD自然經(jīng)過。脂肪肝的形成與過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ及Akt-SREBP1c信號傳導(dǎo)途徑的激活和脂聯(lián)蛋白（adiponectin）、脂肪細(xì)胞蛋白酶（adipsin）、激活蛋白2（activatorprotein 2）、脂肪酸合成酶（fattyacidsynthetase，F(xiàn)AS）以及乙酰輔酶A羧化 （acetyl-CoA carboxylase，ACC）等脂肪酸合成酶相關(guān)基因的表達(dá)增加有關(guān)；此外，氧化應(yīng)激的增加可引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化引發(fā)的肝細(xì)胞損害而造成脂肪性肝炎。由于此類模型復(fù)制出的NAFLD與人類病變極為相似，因此，近年來，該模型備受矚目。大鼠與人類的同源性高于小鼠，如果未來對大鼠進(jìn)行特異性PTEN基因敲除建立脂肪肝模型，其復(fù)制出的疾病與人類NAFLD將更加相似，對于研究其發(fā)病機(jī)制及防治也將更為有利。

盡管目前許多基因工程動物模型價格昂貴，但其能夠從整體水平、組織器官水平及細(xì)胞和分子水平進(jìn)行研究，為NAFLD的發(fā)病機(jī)制、藥物篩選等研究提供比較理想的實驗體系，未來諸如此類的模型將會越來越多。

4 復(fù)合脂肪肝模型

由于上述三類單一模型的發(fā)病機(jī)制和組織病理改變等疾病特征均與人體NAFLD存在一定差異。近年來，許多研究者聯(lián)合應(yīng)用營養(yǎng)、藥物和基因誘發(fā)模型，以期使復(fù)合模型的疾病特征與人體NAFLD更接近，更能反映疾病從單純性脂肪肝向脂肪性肝炎進(jìn)展，脂肪性肝炎向肝纖維化進(jìn)展的過程。建立復(fù)合模型的常見方法包括:高脂飲食+四氯化碳[18]，ob/ob小鼠+蛋氨酸-膽堿缺乏（MCD）飲食[19]，ApoE-/-小鼠+高脂飲食[20]，PPARα-/-小鼠+MCD飲食等，用這些方法均能復(fù)制出發(fā)病機(jī)制、病理組織學(xué)變化及發(fā)病經(jīng)過與人類酷似的NAFLD模型。由于復(fù)合模型最大程度地模擬了人類NAFLD的復(fù)雜性，病理變化顯著，是一種極具潛力的非酒精性脂肪肝模型。

5 幾種非酒精性脂肪肝動物模型優(yōu)缺點(diǎn)比較

不同致病因素所致脂肪肝動物模型的形成機(jī)制及病理改變各異，各有其優(yōu)點(diǎn)和缺陷。

營養(yǎng)失調(diào)性模型建模方法簡便、重復(fù)性好，與人類NAFLD的致病機(jī)制相似，能出現(xiàn)胰島素抵抗、代謝綜合征等全身代謝紊亂表現(xiàn)，肝臟病變多具有漸進(jìn)性發(fā)展的特點(diǎn)，但建模所需時間較長；藥物中毒性模型建模迅速、方法簡便、病變明顯，但其發(fā)病機(jī)制、病理改變與人體NAFLD差異較大，且藥物毒性強(qiáng)，動物死亡率高；基因敲除或基因突變性模型能自發(fā)形成脂肪肝，且伴肥胖、胰島素抵抗等代謝綜合征，能從整體水平、組織器官水平及細(xì)胞和分子水平進(jìn)行研究，但價格昂貴，且部分模型缺乏NAFLD的自然演變過程；復(fù)合模型能最大程度地模擬人類NAFLD的復(fù)雜性，病理變化顯著，其不足在于與單一模型相比，建模過程稍復(fù)雜。

6 展 望

經(jīng)過國內(nèi)外研究者數(shù)十年的努力，NAFLD動物模型的研究有了很大進(jìn)展，許多模型已用于NAFLD發(fā)病機(jī)理、藥物療效觀察、臨床影像學(xué)等研究，且在基礎(chǔ)和臨床領(lǐng)域均取得一定成績。好的NAFLD動物模型應(yīng)具有以下特點(diǎn)：符合人類脂肪肝發(fā)病機(jī)制、形成過程及病變特征，建?？?，動物死亡率低，復(fù)制率高，重復(fù)性好，方法簡便。許多復(fù)合模型雖然能很大程度地反映NAFLD“單純性脂肪肝-脂肪性肝炎-肝纖維化”的典型疾病過程，但至今仍缺乏能完全涵蓋人類NAFLD疾病特征的單一動物模型。今后的研究應(yīng)在完善已有模型的基礎(chǔ)上，更多地致力于基因工程模型的改造和建立，探索新的造模方法，使動物模型更貼近人類NAFLD的特點(diǎn)，以期對疾病進(jìn)行更深入的研究，闡明其發(fā)病機(jī)制，更好地防治NAFLD。

1.Burt AD，Lackner C，Tiniakos DG.Diagnosis and assessment of NAFLD:definitions and histopathological classification[J].Semin Liver Dis，2015，35（3）:207-220.

2.董妹，劉平，孫明瑜.非酒精性脂肪肝發(fā)病機(jī)制——“二次打擊”學(xué)說研究進(jìn)展[J].臨床肝膽病雜志，2012，28（7）：551-555.

3.劉云龍，宋卓，彭冰潔.綠原酸對高脂飼糧誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2015，27（7）：2140-2149.

4.樊希承，黃穎，黃亦琦.非酒精性脂肪肝模型的建立與逆轉(zhuǎn)狀況[J].中國臨床康復(fù)，2006，10（24）：103-105.

5.Kawasaki T，Igarashi K，Koeda T，et al.Rats fed fructose-enriched diets have characteristics of nonalcoholic hepatic steatosis[J].The Journal of nutrition，2009，139（11）:2067-2071.

6.Seung-Kwon HA，Chanhee CHAE.Inducible nitric oxide distribution in the fatty liver of a mouse with high fat diet induced obesity[J].Exp Anim，2010，59（5）：595-604.

7.Ding Y，Rao SX，Meng T，et al.Usefulness of T1 mapping on Gd-EOB-DTPA-enhanced MR imaging in assessment of non-alcoholic fatty liver disease[J].European radiology，2014，24（4）：959-966.

8.Ignacio A，Antonia MC，Gracia A，et al.Hyperlipidemie chicken as a model of non-alcoholic steatohepatitis[J].Exp Biol Med，2009，234（1）：10-16.

9.Lydia L，Mouhamad A，Romil S，et al.Nutritional model of steatohepatitis and metabolic syndrome in the ossabaw miniature swine[J].Hepatology，2009，50（1）：56-67.

10.Dai N，Zou Y，Zhu L，Wang HF，et al.Antioxidant properties of proanthocyanidins attenuate carbon tetrachloride （CCl4）-induced steatosis and liver injury in rats via CYP2E1 regulation[J].J Med Food，2014，17（6）:663-669.

11.Yin HQ，Kim M，Kim JH，et al.Hepatic gene expression profi ling and lipid homeostasis in mice exposed to steatogenic drug，tetracycline[J].Toxicol Sci，2006，94（1）: 206-216.

12.Yu HY，Wang BL，Zhao J，et al.Protective effect of bicyclol on tetracycline-induced fatty liver in mice[J].Toxicology，2009，261（3）：112-118.

13.王昀，陳蜜，江振洲.雞骨草總黃酮碳苷對乙硫氨酸導(dǎo)致的小鼠脂肪肝的影響[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2014，19（1）：1-7.

14.Chow JD，Jones ME，Prelle K，et al.A selective estrogen receptor α agonist ameliorates hepatic steatosis in the male aromatase knockout mouse[J].J Endocrinol，2011，210（3）: 323-334.

15.Toda K，Hayashi Y，Saibara T.Deletion of tumor necrosis factor-alpha receptor type 1 exacerbates insulin resistance and hepatic steatosis in aromatase knockout mice[J]. Biochim Biophys Acta，2010，1801（6）：55-64.

16.Hopkins BD，Parsons RE.Molecular pathways:intercellularPTENandthepotentialof PTENrestorationtherapy[J]. Clin Cancer Res，2014，20（21）：5379-5383.

17.Horie Y，Ohshima S，Sato W，et al.Hepatocyte-specific Pten deficient mice[J].Nihon Rinsho.Japanese journal of clinical medicine，2006，64（6）:1033-1042.

18.Kubota N，Kado S，Kano M，et al.A high-fat diet and multiple administration of carbon tetrachloride induces liver injury and pathological features associated with non-alcoholic steatohepatitis in mice[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2013，40（7）:422-430.

19.Clarke JD，Dzierlenga AL，Nelson NR，et al.Mechanism of altered metformin distribution in nonalcoholic steatohepatitis[J].Diabetes，2015，64（9）:3305-3313.

20.Zhang L，Yang M，Ren H，et al.GLP-1 analogue prevents NAFLD in ApoE KO mice with diet and Acrp30 knockdown by inhibiting c-JNK[J].Liver International，2013，33（5）:794-804.

（2015-11-05收稿）

R332

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.03.031

喻 琴（1991-），女，碩士生，E-mail：534138116@qq.com。