復(fù)合纖維素分解菌的探討

文│王琳 王新梅 王蓓蓓（安徽省鳳陽(yáng)縣畜牧獸醫(yī)局）

復(fù)合纖維素分解菌的探討

文│王琳 王新梅 王蓓蓓（安徽省鳳陽(yáng)縣畜牧獸醫(yī)局）

近年來(lái)，農(nóng)作物秸稈和畜禽糞肥的不合理利用，既造成了生物資源的浪費(fèi)，又污染了環(huán)境。如何將這些生物資源“變廢為寶”是目前亟待解決的問(wèn)題。大量試驗(yàn)研究表明，這些廢棄物的主要有機(jī)成分是纖維素，由于秸稈中木質(zhì)纖維素占干重的40%～60%，且自然狀態(tài)下極難分解。因此，纖維素的生物降解已成為生物技術(shù)處理有機(jī)固體廢物的關(guān)鍵，也是生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。

本文從土壤和不同材料的堆肥中分離篩選高效纖維素分解菌，并研究其對(duì)溫度、pH的適應(yīng)性，以便對(duì)纖維素分解菌進(jìn)行優(yōu)化來(lái)加快堆肥的腐熟進(jìn)度。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)材料。

（1）樣本。從鳳陽(yáng)縣府城鎮(zhèn)及周邊地區(qū)采集雞糞、農(nóng)作物秸稈及一些腐殖質(zhì)等。從采集的樣本中篩選得到相關(guān)菌種。

（2）培養(yǎng)基。初篩培養(yǎng)基：NaNO32.5克，KH2PO41克，CaCl2·6H2O 0.1克，MgSO40.3克，NaCl 0.1克，F(xiàn)eCl30.01克，濾紙條10克，蒸餾水1000毫升，溫度121℃，滅菌20分鐘。

復(fù)篩培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（CMC培養(yǎng)基）。NaCl6克，MgSO4·7H2O 0.1克，KH2PO40.5克，CaCl20.1克，K2HPO42.0克，CMCNa 15克，（NH4）2SO42.0克，pH7.0～7.4，蒸餾水1000毫升，固體培養(yǎng)基加2%瓊脂。

優(yōu)化培養(yǎng)液：Mandels培養(yǎng)基。KH2PO43.0克，CaCl20.5克，MgSO4·7H2O0.5克，NaCl0.1克，F(xiàn)eCl30.01克，NaNO33.0克，F(xiàn)eSO4·7H2O 7.5毫克，MnSO4·7H2O 2.5毫克，ZnSO4·7H2O 2.0毫克，CoCl23.0毫克，H2O 1000毫升，121℃滅菌20分鐘，pH7.2～7.3。

（3）無(wú)淀粉濾紙。濾紙用1%醋酸浸泡24小時(shí)，用碘液檢查確定無(wú)淀粉后再用2%蘇打水沖洗至中性，晾干，將處理后的濾紙剪成小條待用。

2.試驗(yàn)方法。

（1）初選。初選是將原始菌種接種在初篩液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)。樣品用生理鹽水浸泡30分鐘，充分震蕩，吸取上清液1毫升接種到20毫升的三角燒瓶初篩培養(yǎng)基中，30℃恒溫震蕩搖床60轉(zhuǎn)/分鐘的條件下培養(yǎng)3～7天后，觀察濾紙的崩解程度，選擇濾紙條崩解程度較高、速度最快和效果穩(wěn)定的培養(yǎng)液進(jìn)行固體分離純化培養(yǎng)。

（2）復(fù)選。復(fù)選是將初選菌種接種在固體培養(yǎng)基上進(jìn)一步純化分離。用接種環(huán)從有濾紙水解的三角燒瓶中蘸取分解菌，在貼有濾紙的復(fù)選平板上畫(huà)線，32℃下培養(yǎng)7天。對(duì)濾紙的分解效果測(cè)定是將各菌株接種到以濾紙為惟一碳源的CMC培養(yǎng)基中，觀察濾紙的崩解效果，以“+”的多少來(lái)表示濾紙崩解程度，“+”越多說(shuō)明該菌株的降解效果越強(qiáng)，并計(jì)算CMC酶相對(duì)活性H=T/t（厘米/天），式中：H為相對(duì)活性；T為透明圈直徑；t為培養(yǎng)時(shí)間。重復(fù)此操作選擇分解纖維素能力強(qiáng)的菌落，將其放入4℃的冰箱保存，以備優(yōu)化分析用。

（3）菌種的條件優(yōu)化。將復(fù)選的菌種在28℃、32℃、35℃、38℃、40℃條件下分別接種在pH為6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0的Mandels培養(yǎng)基中，觀察并記錄濾紙條的崩解速度。

將每組篩選的最優(yōu)pH條件下的菌種再次接種，放在28℃、32℃、35℃、38℃、40℃條件下培養(yǎng)，選出溫度和pH間最優(yōu)的關(guān)系。

二、結(jié)果與分析

1.菌種的篩選。采用以濾紙為惟一碳源的培養(yǎng)基，從土壤和不同材料的堆肥中篩選纖維素分解菌，經(jīng)多次富集增殖培養(yǎng)后，獲得10組具有纖維素降解功能的微生物，其中混合菌株H4具有穩(wěn)定的分解纖維素效果，在以濾紙為碳源的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵7天，濾紙全部崩解，并沒(méi)有絮狀沉淀，形成完全溶解的黃色稍黏稠發(fā)酵液。

將H4混合菌株用CMC平板進(jìn)行分離純化得到單個(gè)菌株D1（放線菌）、D2（細(xì)菌）、D3（真菌），比較單個(gè)菌株以及相互混合對(duì)濾紙分解的效果（表1），結(jié)果表明各菌株單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)濾紙均有一定的分解效果，但遠(yuǎn)不如混合的效果好，由此說(shuō)明3株菌株之間有很好的協(xié)同效應(yīng)，故選擇混合菌H4作為優(yōu)化菌種。

2.菌種不同溫度下最適pH變化。

（1）分別在28℃、32℃、35℃、38℃、40℃條件下優(yōu)化。將H4分別接種在裝有濾紙條、pH為6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0的Mandels培養(yǎng)基中，分別在28℃、32℃、35℃、38℃、40℃恒溫振蕩搖床上培養(yǎng)7天觀察結(jié)果（表2）。

試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度在28℃時(shí)，偏酸性的環(huán)境更有利于濾紙的分解，pH過(guò)高反而抑制濾紙的分解；在32℃時(shí)纖維素分解菌最適分解的pH為中性；在35℃時(shí)纖維素分解菌最適分解的pH為7.2，偏堿性，溫度較高時(shí)，酸性條件下不適宜H4混合菌對(duì)濾紙的分解，分解速度明顯變慢。由此可得出，H4混合菌在pH分別為6.8、7.0、7.2時(shí)分解濾紙能力最強(qiáng)。

3.最適溫度的條件優(yōu)化。將H4混合菌接種在pH分別為6.8、7.0、7.2帶有濾紙的Mandels培養(yǎng)基中，溫度分別為28℃、32℃、35℃、38℃、40℃的振蕩搖床60轉(zhuǎn)/分鐘的條件下培養(yǎng)，直至濾紙完全崩解時(shí)所用的天數(shù)，并記錄（表3）。

本試驗(yàn)通過(guò)多次分離篩選得到纖維素分解菌，秸稈的分解是由各種微生物參與的生物氧化降解過(guò)程。微生物分解會(huì)產(chǎn)熱，致使秸稈堆內(nèi)溫度升高，達(dá)到一定溫度時(shí)會(huì)導(dǎo)致微生物出現(xiàn)死亡或休眠，從而引起堆體溫度下降，下降到最適溫度時(shí)，休眠狀態(tài)的微生物開(kāi)始繼續(xù)活動(dòng)，如此反復(fù)。正是由于秸稈堆在發(fā)酵過(guò)程中溫度的變化，因而測(cè)定不同溫度對(duì)纖維素分解菌纖維素酶活性的影響，對(duì)于篩選高效的纖維素分解菌具有重要的實(shí)踐意義。

同時(shí)提取出來(lái)的H4混合纖維素分解菌包括細(xì)菌、真菌、放線菌，即細(xì)菌的最適溫度在35～37℃，pH在7.2～7.6；真菌的最適溫度在28～30℃，pH在6.5～6.8；放線菌的最適溫度在23～37℃，pH在7.5～8.0，因而測(cè)定不同溫度和pH對(duì)H4混合菌酶活性的影響，對(duì)于篩選高效的纖維素分解菌具有重要的實(shí)踐意義。

表1 不同菌株對(duì)濾紙的分解效果

表2 不同溫度下纖維素分解菌分解濾紙能力由強(qiáng)到弱順序

表3 濾紙完全崩解時(shí)所用的天數(shù)

三、結(jié)論

纖維素分解菌的分離還存在一些爭(zhēng)議，但通過(guò)與單一菌株的混合發(fā)酵相比，H4混合菌可使纖維分解能力明顯提高，這是由于不同菌株產(chǎn)生不同類(lèi)型的纖維素酶，混合后相互作用的結(jié)果。試驗(yàn)表明：纖維素分解受pH和溫度影響較大，發(fā)酵過(guò)程中需調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH，保持中性或偏堿性可達(dá)到很好的分解效果；溫度在35℃時(shí)纖維素分解酶活性最強(qiáng)，分解速度最快。H4混合菌的最適溫度是35℃，最優(yōu)pH為7.2，可以看出H4混合菌中含有大量的細(xì)菌和放線菌，而真菌受到抑制。因此選擇濾紙作為碳源是較好的纖維素分解菌初選和增殖的培養(yǎng)基，為降解秸稈和有機(jī)廢棄物對(duì)環(huán)境的污染有重要意義，同時(shí)也可以利用纖維素分解菌分解秸稈生產(chǎn)酵母蛋白飼料提供有效參考。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)篩選的混合菌株具有較強(qiáng)的協(xié)同作用，對(duì)纖維素有很好的降解能力，對(duì)其進(jìn)一步優(yōu)化降解能力明顯增強(qiáng)。這對(duì)我國(guó)農(nóng)村秸稈和城市有機(jī)廢棄物的處理將有非常廣闊的應(yīng)用前景。