多柔比星聯(lián)合順鉑化療對(duì)宮頸癌放療患者的療效及對(duì)相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響

覃杏幸 莫永華 劉桂玉

(1 廣西科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，柳州市 545000，E-mail：guangxqinxx@tom.com；2 廣西科技大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，柳州市 545000)

論著·臨床研究

多柔比星聯(lián)合順鉑化療對(duì)宮頸癌放療患者的療效及對(duì)相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響

覃杏幸1莫永華2劉桂玉1

(1 廣西科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，柳州市 545000，E-mail：guangxqinxx@tom.com；2 廣西科技大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，柳州市 545000)

目的 探討多柔比星聯(lián)合順鉑化療對(duì)宮頸癌放療患者的療效及對(duì)相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響。方法 選取60例宮頸癌患者，按照隨機(jī)數(shù)表法分為觀察組和對(duì)照組，每組30例。兩組患者均給予放療治療，對(duì)照組加用順鉑化療，觀察組加用多柔比星聯(lián)合順鉑化療。觀察兩組患者治療前后HeLa細(xì)胞脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)蛋白、淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X(Bax)蛋白、Ki-67蛋白的表達(dá)情況，比較兩組的臨床療效、生存率、不良反應(yīng)發(fā)生率。結(jié)果 治療后，兩組HeLa細(xì)胞FHIT、Bax蛋白表達(dá)均增高，觀察組的表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)；治療后，兩組HeLa細(xì)胞Ki-67蛋白表達(dá)均降低，但觀察組的表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05)。觀察組與對(duì)照組的總有效率分別為83.33%、60.00%，觀察組臨床療效優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)；觀察組患者的3、5年生存率均高于對(duì)照組患者(P<0.05)。兩組不良反應(yīng)發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 多柔比星聯(lián)合順鉑對(duì)宮頸癌患者有良好的治療效果，有效增加HeLa細(xì)胞FHIT、Bax蛋白的表達(dá)，降低Ki-67蛋白的表達(dá)，提高患者生存率，且不增加患者的不良反應(yīng)發(fā)生率，是一種安全有效的治療手段。

宮頸癌；多柔比星；順鉑；療效；脆性組氨酸三聯(lián)體；淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白；Ki-67

宮頸癌是婦科腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌[1-2]。每年全世界大約有超過20萬女性死于宮頸癌，發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并呈現(xiàn)年輕化發(fā)病趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅婦女健康[3]。近年來隨著研究的深入發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)腫瘤治療有良好效果。HeLa 細(xì)胞為人宮頸癌的傳代細(xì)胞，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中極為重要。有研究發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞的變異與其細(xì)胞內(nèi)脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine triad，F(xiàn)HIT)蛋白、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X(B-cell lymphoma-2 associated X，Bax)蛋白、Ki-67蛋白表達(dá)改變有極大關(guān)系[4]。因此本研究通過觀察多柔比星聯(lián)合順鉑化療對(duì)宮頸癌患者療效及對(duì)基因蛋白表達(dá)的影響，以期探討HeLa細(xì)胞在宮頸癌治療中的重要作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2008年12月至2010年12月廣西科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的60例宮頸癌患者。整個(gè)研究均在患者及其家屬知情同意下完成，并獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理活檢證實(shí)為宮頸癌；(2)經(jīng)組織學(xué)證實(shí)為鱗癌且其臨床分期為Ⅱa期～Ⅲb期；(3)無心、肝、腎等重要器官損害、無出血性疾病等，一般狀況良好；(4)既往無癌癥病史，且該次患病前無放化療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)一般狀況差、不能耐受化療者；(2)存在明顯的惡病質(zhì)、或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；(3)具有化療禁忌證者。按照隨機(jī)數(shù)表法將60例患者分為觀察組和對(duì)照組，每組30例。對(duì)照組年齡為32.4～63.3歲，觀察組年齡為31.1～64.9歲。兩組患者在年齡、腫瘤直徑、分期等臨床資料方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 治療方法 (1)化療：對(duì)照組在放療同時(shí)給予順鉑(齊魯制藥有限公司；生產(chǎn)批號(hào)：20081009；30 mg/支)40 mg/m2，靜脈滴注，1次/周，于放療的間歇進(jìn)行，共進(jìn)行6個(gè)周期的化療。觀察組在對(duì)照組基礎(chǔ)上給予多柔比星(浙江海正藥業(yè)股份有限公司；生產(chǎn)批號(hào)：20081111；5 ml：10 mg)30 mg/m2，靜脈滴注，1次/周，于放療的間歇進(jìn)行，共進(jìn)行6個(gè)周期的化療。(2)放療：放療采用15MV X線外放射與192Ir高劑量率腔內(nèi)后裝聯(lián)合。外放射方法：先對(duì)全盆腔進(jìn)行放療，劑量為1.8～2.2 Gy/次，1次/d，每周5次，宮旁總劑量為25～30 Gy。全盆腔的放療完成后，再進(jìn)行盆腔的四野外放射，劑量為1.8～2.0 Gy/次，1次/d，每周進(jìn)行4次，到宮旁總劑量為15～20 Gy。于盆腔四野外進(jìn)行放射的同時(shí)進(jìn)行192Ir高劑量率腔內(nèi)后裝的治療，1次/周。宮腔、陰道的治療依次進(jìn)行，A點(diǎn)每次劑量為6 Gy，總劑量為36～42 Gy。在放療期間每天進(jìn)行陰道沖洗。每周復(fù)查血常規(guī)，定期復(fù)查肝腎功能，必要時(shí)給予升白細(xì)胞、保肝、止吐、護(hù)腎等對(duì)癥處理。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察兩組患者治療前后HeLa細(xì)胞FHIT、Bax、Ki-67蛋白表達(dá)、臨床療效、1、3、5年生存率、不良反應(yīng)(惡心嘔吐、血紅蛋白下降、白細(xì)胞下降、心臟毒性、肺毒性、肝毒性)的發(fā)生情況。近期療效的評(píng)價(jià)根據(jù)世界衛(wèi)生組織對(duì)于實(shí)體瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[5]，將其分為完全緩解(complete remission，CR)、部分緩解(partial remission，PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)和疾病進(jìn)展(progressive disease，PD)，其中完全緩解+部分緩解總和為有效。在同步放化療完成3個(gè)月時(shí)進(jìn)行復(fù)查，并對(duì)其進(jìn)行療效評(píng)定。對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，評(píng)價(jià)1年、3年、5年生存率。

1.4 FHIT、Bax、Ki-67蛋白表達(dá)的檢測(cè)

1.4.1 藥物與試劑：采用1 mg/ml的生理鹽水將順鉑(購于山東德州制藥廠)配成儲(chǔ)存液。噻唑藍(lán)購自華美公司(批號(hào)20080102)。FHIT、Bax、Ki-67抗體及試劑盒購自北京中杉生物科技有限公司( 批號(hào)20080203)。

1.4.2 細(xì)胞爬片免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)：分別于治療前及治療后6周，檢測(cè)患者FHIT、Bax、Ki-67蛋白表達(dá)：子宮頸癌HeLa細(xì)胞檢測(cè)的標(biāo)本從所取活檢組織中提?。菏褂脭U(kuò)陰器擴(kuò)開陰道后，使用組織鉗鉗取組織，在胰酶消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為 3×104/ml，置于含10%胎牛血清、100 U/ml含青霉素、100 μg/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)基在含5% CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。后將其置于六孔板內(nèi)放蓋玻片，將經(jīng)胰酶消化后的HeLa細(xì)胞以3×104/ml濃度均勻滴于蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后加培養(yǎng)液2 ml培養(yǎng)24 h，取出蓋玻片，磷酸緩沖鹽溶液洗滌后，用 10%多聚甲醛固定，-4℃過夜。蒸餾水沖洗，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶聯(lián)結(jié)免疫組織化學(xué)法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行處理，在進(jìn)行免疫組化后檢測(cè)相應(yīng)的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采取χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)，生存率的計(jì)算采用生存分析Kaplan-Meier法，生存率的比較采用Log-Rank χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 治療前后兩組患者的HeLa細(xì)胞FHIT、Bax、Ki-67蛋白表達(dá)比較 治療后，觀察組與對(duì)照組FHIT、Bax表達(dá)均增高(P<0.05)，且觀察組的表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.05)；治療后，觀察組與對(duì)照組Ki-67表達(dá)均減少(P<0.05)，且觀察組的表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 治療前后兩組患者HeLa細(xì)胞的FHIT、Bax、Ki-67蛋白表達(dá)比較(x±s，μg/ml)

2.2 兩組患者臨床療效的比較 觀察組的臨床療效優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者臨床療效的比較(n，%)

2.3 兩組患者生存率的比較 觀察組患者的3年及5年生存率高于對(duì)照組患者(P<0.05)。見表4及圖1。

表4 兩組患者生存率的比較(%)

圖1 兩組生存曲線

2.4 兩組患者的不良反應(yīng)比較 觀察組與對(duì)照組的不良反應(yīng)發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 兩組患者的不良反應(yīng)比較(n，%)

3 討 論

研究表明，無論對(duì)宮頸癌患者施行手術(shù)治療還是進(jìn)行放射治療，均可以取得較好臨床治療療效[6]。在20世紀(jì)80年代之前，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為宮頸癌對(duì)化療不敏感，只有在其他的治療措施均失敗以后才考慮進(jìn)行化療。1983年，F(xiàn)riedlander等[7]首次報(bào)告宮頸癌患者使用化療治療。隨后有許多研究也表明宮頸癌對(duì)化療敏感[8-9]。目前，宮頸癌的化療方案眾多，但是大多數(shù)化療方案的治療效果有限，且不良反應(yīng)較嚴(yán)重，大多數(shù)患者不能耐受。此外，有的化療藥物因存在劑量限制性，受到極大限制。

近年來，抗癌藥物的發(fā)展日新月異，宮頸癌的各種化療方案層出不窮。目前宮頸癌的最佳化療方案仍沒有得到普遍統(tǒng)一，目前常用化療方案主要以鉑類為基礎(chǔ)藥物的化療，如BIP(博來霉素+異環(huán)磷酰胺+順鉑)、PVB(順鉑+長春新堿+博來霉素)等方案。但由于這些方案藥物不良反應(yīng)均很大，其臨床應(yīng)用受到極大限制[10-11]。同步放化療(concurrent chemoradiotherapy，CCRT)目前已被美國的國家癌癥研究所推薦作為宮頸癌的治療標(biāo)準(zhǔn)，并作為Ⅰb2期以上的宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療模式。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)在治療指南推薦順鉑作為CCRT 1類證據(jù)治療宮頸癌[12]。但是順鉑的胃腸反應(yīng)以及腎臟毒性大[13]。多柔比星既為抗生素，也可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的DNA、RNA合成，為周期非特異性的抗腫瘤藥物，其對(duì)不同生長周期的腫瘤細(xì)胞均有殺傷作用。有研究顯示多柔比星與順鉑、氟脲苷等藥物聯(lián)合使用具有有協(xié)同作用[14]。

HeLa細(xì)胞為人宮頸癌的傳代細(xì)胞，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中極為重要。有研究發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞的變異與其細(xì)胞內(nèi)FHIT、Bax、Ki-67蛋白表達(dá)改變有極大關(guān)系。FHIT基因定位在3p14.2內(nèi)，為宮頸癌等位基因的缺失發(fā)生高發(fā)區(qū)，其表達(dá)減少和缺失被認(rèn)為與人體多種惡性腫瘤的產(chǎn)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究結(jié)果表明，從正常宮頸到浸潤性宮頸癌，伴隨著疾病進(jìn)展，F(xiàn)HIT的表達(dá)會(huì)逐漸減少[13]。Bax基因?yàn)榱馨图?xì)胞瘤-2凋亡家族中重要成員，其表達(dá)增高可以有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。近年來研究表明Ki-67抗原可以作為衡量腫瘤細(xì)胞增生程度的指標(biāo)[14]。Ki-67抗原主要表達(dá)在增殖期細(xì)胞核抗原當(dāng)中，也存在于核仁中，其參與調(diào)控細(xì)胞周期，它對(duì)細(xì)胞的增殖十分重要[15]。

本研究觀察多柔比星聯(lián)合順鉑對(duì)宮頸癌患者治療療效及對(duì)基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，治療后兩組的HeLa細(xì)胞FHIT、Bax蛋白均表達(dá)增高、Ki-67蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，且觀察組的FHIT、Bax蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.05)，Ki-67蛋白的表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)，提示宮頸癌細(xì)胞的增殖受到抑制后FHIT、Bax蛋白的表達(dá)上調(diào)，而Ki-67蛋白表達(dá)下調(diào)，且多柔比星聯(lián)合順鉑化療的效果更為明顯。從療效來看，多柔比星聯(lián)合順鉑患者的總有效率為83.33%，其3、5年生存率分別為93.33%、83.33%，均高于單用順鉑化療患者(P<0.05)，且兩組的不良反應(yīng)發(fā)生率無明顯差異(P>0.05)，這提示多柔比星聯(lián)合順鉑能夠取得較好臨床治療效果的同時(shí)，并不會(huì)增加藥物的副作用。

綜上所述，多柔比星聯(lián)合順鉑對(duì)宮頸癌患者有良好的治療效果，有效增加HeLa細(xì)胞FHIT、Bax的表達(dá)，降低Ki-67的表達(dá)，能夠提高患者的生存率，且不增加患者的不良反應(yīng)發(fā)生率，是一種安全有效的治療手段。

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Effect of chemotherapy with doxorubicin combined with cisplatin on efficacy and protein expressions of related genes in cervical cancer patients undergoing radiotherapy

QINXing-xing1,MOYong-hua2,LIUGui-yu1

(1DepartmentofGynaecologyandObstetrics,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofScienceandTechnology,Liuzhou545000,China;2DepartmentofNeurology,LiuzhouPeople′sHospitalAffiliatedtoGuangxiUniversityofScienceandTechnology,Liuzhou545000,China)

Objective To explore the effect of chemotherapy with doxorubicin combined with cisplatin on efficacy and protein expressions of related genes in cervical cancer patients undergoing radiotherapy.Methods Sixty patients with cervical cancer were divided into observation group and control group using the random number table,with 30 cases in each group.Both groups were treated with radiotherapy.Additionally,the control group received chemotherapy with cisplatin,and the observation group received chemotherapy with cisplatin and doxorubicin.The fragile histidine triad(FHIT) protein,B-cell lymphoma-2 associated X(Bax) protein and Ki-67 protein expressions of HeLa cells before and after treatment were observed in both groups.The clinical efficacy,survival rate and incidence rate of adverse effects were compared between the two groups.Results After treatment,FHIT protein and Bax protein expressions of HeLa cells increased in both groups,but the expression levels in the observation group were higher than those in the control group(P<0.05).After treatment,Ki-67 protein expression of HeLa cells in both groups decreased,but the expression level in the observation group was lower than that in the control group(P<0.05).The total effective rates of the observation group and control group were 83.33% and 60.00% respectively,and the clinical efficacy of the observation group was superior to that of the control group(P<0.05).The three-year and five-year survival rates in the observation group were higher than those in the control group(P<0.05).There was no significant difference in the incidence rate of adverse reactions between the two groups(P>0.05).Conclusion Doxorubicin combined with cisplatin obtains a good efficacy for the treatment of cervical cancer,and can effectively increase the expressions of FHIT and Bax proteins and reduce the expression of Ki-67 protein in the HeLa cells.Moreover,it can improve the survival rate of patients and does not increase the incidence rate of adverse reactions,so it is a safe and effective therapeutic approach. 【Key words】 Cervical cancer,Doxorubicin,Cisplatin,Efficacy,Fragile histidine triad,Lymphocyte tumor-2 associated X protein,Ki-67

覃杏幸(1977～)，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤疾病研究。

R 737.33

A

0253-4304(2016)09-1256-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.09.19

2016-04-01

2016-07-03)