功能性納米羥基磷灰石的生物相容性及安全性評(píng)價(jià)

趙顏忠 楊 敏 王國慧 譚 娟 朱曬紅,2

1(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 長沙 410013)2(中南大學(xué)醫(yī)用材料與器械研究中心， 長沙 410013)

功能性納米羥基磷灰石的生物相容性及安全性評(píng)價(jià)

趙顏忠1,2*楊 敏1王國慧1譚 娟1朱曬紅1,2

1(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 長沙 410013)2(中南大學(xué)醫(yī)用材料與器械研究中心， 長沙 410013)

采用水熱合成法制備的鋱離子摻雜的精氨酸修飾的納米羥基磷灰石顆粒(HAP/Arg)，對(duì)HAP/Arg的生物安全性進(jìn)行體內(nèi)外研究，探討其作為基因治療藥物載體的可行性。選擇人正常血管內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)以及人腫瘤細(xì)胞株(Hela細(xì)胞)作為體外細(xì)胞模型，用酶標(biāo)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)其在0、25、50～200 μg/mL HAP/Arg納米顆粒影響下的細(xì)胞存活率，用LDH法檢測(cè)其在不同濃度的 HAP/Arg納米顆粒影響下的細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性。選擇健康小鼠作為動(dòng)物模型，將其分為低劑量組(10 μg/mL/20 g 體重)、中劑量組(100 μg/mL/20 g 體重)、高劑量組(500 μg/mL/20 g 體重)及對(duì)照組，進(jìn)行死亡計(jì)數(shù)、血清生化指標(biāo)檢測(cè)以及倒置熒光顯微鏡觀察主要臟器的病理學(xué)特征。根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將健康小鼠分為低劑量組(0.09 mg/(kg·d))、中劑量組(4.5 mg/(kg·d))、高劑量組(225 mg/(kg·d))及對(duì)照組，按照新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判斷其生殖毒性。結(jié)果表明：0、25、50～200 μg/mL的HAP/Arg納米顆粒在4、24、48、72 h不同時(shí)間下對(duì)所選擇的HAEC細(xì)胞和Hela細(xì)胞的正常生長和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)均無明顯影響。在動(dòng)物的急性毒性實(shí)驗(yàn)和生殖毒性實(shí)驗(yàn)中，HAP/Arg各劑量組及對(duì)照組小白鼠均未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)及死亡情況，病理切片也均未見主要臟器結(jié)構(gòu)有炎癥及損傷性變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，HAP/Arg各劑量組與對(duì)照組相比均無顯著差異(P>0.05)。這些結(jié)果為下一步構(gòu)建一種高效、安全、簡便的新型納米基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)打下基礎(chǔ)。

羥基磷灰石；基因載體；精氨酸修飾；生物安全性

引言

本世紀(jì)以來，國際上對(duì)納米材料的生物安全性極為關(guān)注。Science和Nature等雜志相繼發(fā)表文章討論納米尺度物質(zhì)的生物效應(yīng)及該物質(zhì)對(duì)環(huán)境和健康的影響[1-5]。納米羥基磷灰石作為良好的人工骨材料及組織材料已廣泛用于臨床，其安全性已達(dá)到ISO10993的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。與常規(guī)材料相比，納米材料本身具有不同的物理化學(xué)性質(zhì)，納米材料的尺寸大小、化學(xué)組成、表面結(jié)構(gòu)、溶解性、形態(tài)以及聚集狀態(tài)等都可以影響其生物學(xué)效應(yīng)[6-7]。湯京龍等綜述了國內(nèi)外納米HAP生物學(xué)評(píng)價(jià)、體內(nèi)毒性和細(xì)胞毒性方面的文獻(xiàn)，認(rèn)為HAP納米顆?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定對(duì)其生物安全性的影響較小，但是也提示納米HAP可以在體內(nèi)遷移[8]。許艷慧等研究HAP納米顆粒的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出較高的細(xì)胞增殖率，細(xì)胞毒性趨于0級(jí)，表明HAP納米顆粒無細(xì)胞毒性[9]。馮凌云等研究HAP納米微晶在血液中的穩(wěn)定性和對(duì)血細(xì)胞的影響，表明HAP納米可以用于靜脈注射[10]。郭曉東等也證明羥基磷灰石/聚乳酸(HAP/PDLLA)納米復(fù)合材料沒有毒性、致突變性和刺激性，不會(huì)引起溶血和凝血[11]。孟純陽等對(duì)羥基磷灰石/聚酰胺(HAP/PA)骨納米復(fù)合材料的毒性研究，沒有發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)急性、亞慢性、慢性毒性反應(yīng)，溶血率小于5%，沒有出現(xiàn)皮膚刺激反應(yīng)[12]。也有學(xué)者通過內(nèi)毒素試驗(yàn)、血液相容性試驗(yàn)、急毒試驗(yàn)和植入等試驗(yàn)，證明了HAP納米材料具有良好的組織相容性和骨結(jié)合能力[13]。劉麗萍等靜脈注射不同濃度的HAP納米顆粒溶液白兔體內(nèi)后，也沒有發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)的累積毒性[14]。以上一系列實(shí)驗(yàn)說明，HAP納米顆粒可以作為藥物載體，通過靜脈注射給藥是安全的。盡管目前體外研究毒性機(jī)制使用采用多種細(xì)胞系模型，但是應(yīng)用血管內(nèi)皮細(xì)胞研究納米顆粒毒性研究的僅有少量報(bào)道。研究其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用，將為進(jìn)一步研究HAP/Arg納米顆粒的細(xì)胞作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)采用水熱合成法制備的用于基因治療的稀土元素鋱離子摻雜的HAP/Arg納米顆粒，參照ISO7406技術(shù)報(bào)告相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，選擇代表性的人正常血管內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)以及一種人腫瘤細(xì)胞株(Hela細(xì)胞)作為體外細(xì)胞模型，在細(xì)胞水平、亞細(xì)胞水平以及動(dòng)物整體水平等方面，對(duì)HAP/Arg的生物安全性進(jìn)行了一系列體內(nèi)及體外研究，包括MTT顯色法細(xì)胞增殖試驗(yàn)、LDH法細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)及其動(dòng)物生殖毒性實(shí)驗(yàn)，探討其作為基因治療藥物載體的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究采用的實(shí)驗(yàn)材料主要有：自制的HAP/Arg納米顆粒(中南大學(xué)粉末冶金國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備提供)，昆明種小白鼠220只購自中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部(等級(jí)：SPF級(jí)，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK．(湘)2010-0001)，HAEC細(xì)胞和Hela細(xì)胞(賽齊(上海)生物工程有限公司)，鱟試劑(廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)和LDH試劑(Sigma公司)。

1.2 納米顆粒懸濁液內(nèi)毒素檢測(cè)

采用鉻酸洗液、自來水和蒸餾水洗滌玻璃器皿，用錫箔紙包好后放置烤箱內(nèi)，250℃下干烤60 min以上備用。鱟試劑經(jīng)其靈敏度復(fù)核檢測(cè)，符合要求。將HAP/Arg納米顆粒樣品編號(hào)，每管加0.1 mL的內(nèi)毒素稀釋專用水稀釋，搖勻0.5 min。取細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或工作標(biāo)準(zhǔn)品1支，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查專用水溶解，封口膜封嚴(yán)瓶口，置旋渦器上混合20 min。然后稀釋，制備成4個(gè)濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，即2.0、1.0、0.5、0.25 λ。取裝有 0.1 mL 鱟試劑溶液的 10 mm×75 mm試管或 0.1mL/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿 6 支，按樣品管(0.1 mL樣品溶液+0.1 mL試劑)、樣品陽性度管(0.1 mL樣品溶液 + 0.1 mL 4λ的內(nèi)毒素稀釋液，混勻30 s，吸混合液0.1 mL+0.1 mL試劑)、陽性管(0.1 mL 2 λ的內(nèi)毒素稀釋液 + 0.1 mL試劑)、陰性管(0.1 mL內(nèi)毒素稀釋專用水+0.1 mL試劑)加樣，以上各管連同操作板在桌面上搖勻30 s，并用封口膜封口。加樣結(jié)束后，將樣品管、樣品陽性度管、陽性管、陰性管連同試管架放入(37±1)℃水浴或適宜恒溫器中，試管架保持水平狀態(tài)，保溫(60±2) min。取出實(shí)驗(yàn)反應(yīng)管，倒轉(zhuǎn)180°觀察，經(jīng)以上檢測(cè)合格后，將作為后續(xù)研究用的樣品。

1.3 MTT顯色法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將人正常血管內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)和人腫瘤細(xì)胞(Hela)以2 × 104/mL密度接種于96孔板(每孔加150 μL)，培養(yǎng)至指數(shù)生長期(24 h)，每組3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。用含0.1%的血清培養(yǎng)液同步24 h或通過4℃冰箱低溫保存3 h，使多數(shù)細(xì)胞進(jìn)入S期。然后加入50 μL不同濃度的HAP納米顆粒懸濁液，濃度從0、25、50至200 μg/mL，震蕩混均，繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)4、24、48、72 h后，每孔加入5 mg/mL MTT保存液20 μL，震蕩后繼續(xù)孵育4 h，吸盡上清液，每孔加入乙醇和二甲基亞砜(DMSO)混合液 (1:1) 100 μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長處測(cè)定不同時(shí)間各孔的OD吸光值。同時(shí)，設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、DMSO)、對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的納米顆粒溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、DMSO)，每組設(shè)定復(fù)孔。根據(jù)每組5孔均值的細(xì)胞存活率(細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)× 100%)，推斷HAP/Arg納米顆粒的細(xì)胞毒性。

1.4 檢測(cè)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性

按照LDH試劑盒方法檢測(cè)，即取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按照本文第1.3節(jié)所述的方法進(jìn)行細(xì)胞接種、 孵育、 同步化后，加入HAP/Arg納米顆粒懸濁液使終濃度為0、25、50、200 μg/mL共同孵育 4、24、48、72 h，對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度及對(duì)照組均設(shè)5個(gè)平行孔。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)試劑盒說明檢測(cè)細(xì)胞外LDH水平。

1.5 HAP/Arg納米顆粒的急性毒性研究

健康昆明種小鼠80只，實(shí)驗(yàn)前禁食16 h，不禁水。雌雄分籠。隨機(jī)分為低劑量組(10 μg /mL/20 g 體重)、中劑量組(100 μg/mL/20 g體重)、高劑量組(500 μg /mL/20 g體重)及對(duì)照組(等體積的生理鹽水)，每組小鼠20只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射相應(yīng)劑量的HAP/Arg納米顆粒懸液，空白對(duì)照組尾靜脈注射等體積的生理鹽水。每天觀察小鼠一般活動(dòng)行為、體重、攝食量、毛色、大小便、呼吸，進(jìn)行死亡計(jì)數(shù)。動(dòng)物死亡后立即解剖，取主要臟器，行組織切片—光鏡篩選—電鏡檢查，檢測(cè)死因。每組分別于停藥1 d后隨機(jī)抽取8只，禁食12 h后摘除眼球取血，上機(jī)檢測(cè)動(dòng)物血清生化指標(biāo)。每組隨機(jī)抽取2只頸椎脫臼處死，一只小鼠分別取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉等。制備石蠟病理切片，倒置熒光顯微鏡觀察主要臟器的病理學(xué)特征。余下動(dòng)物在試驗(yàn)結(jié)束(7 d)時(shí)處死動(dòng)物。

1.6 HAP/Arg納米顆粒的動(dòng)物生殖毒性

根據(jù)HAP/Arg納米顆粒的動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，擬定低劑量組(0.09 mg /(kg·d) )、中劑量組(4.5 mg /(kg·d))、高劑量組(225 mg /(kg·d))及對(duì)照組，將雄雌小鼠各隨機(jī)分為3個(gè)給藥組和1個(gè)對(duì)照組，每組35只昆明種小白鼠(雄15、雌20只)，禁食(但不禁水)16 h后，實(shí)驗(yàn)組分別連續(xù)尾靜脈注射相應(yīng)劑量HAP/Arg納米顆粒懸液(見表1)9周和12周(每周2次)，然后將雄鼠和雌鼠以1∶1合籠，共合籠5 d，合籠期間連續(xù)給藥(每周2次)，雄鼠給藥至11周，雌鼠則繼續(xù)給藥至懷孕的第15 d。空白對(duì)照組尾靜脈注射等體積的生理鹽水。根據(jù)新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判斷其生殖毒性[15]。雌雄鼠體重、黃體數(shù)、著床數(shù)、活胎數(shù)、胎仔體重等平均數(shù)均用F檢驗(yàn)。交配率、受孕率用χ2檢驗(yàn)。

表1 HAP/Arg納米顆粒懸濁液的小白鼠給藥方案

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 10.0進(jìn)行分析，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S.D.)表示，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 HAP/Arg納米顆粒的內(nèi)毒素檢測(cè)

為了排除HAP/Arg納米顆粒樣品中的內(nèi)毒素干擾因素，保證研究結(jié)果的可靠性，必須要去除納米顆粒樣品中的大量內(nèi)毒素，從而避免內(nèi)毒素對(duì)下一步實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的影響，本實(shí)驗(yàn)按中國生物制品規(guī)程(2000年版)對(duì)批量制備的HAP/Arg納米顆粒懸濁液進(jìn)行無菌試驗(yàn)和內(nèi)毒素檢查，全面考察HAP/Arg納米顆粒制備工藝。實(shí)驗(yàn)樣品反應(yīng)管結(jié)果顯示為陰性，故認(rèn)為該批樣品檢測(cè)的內(nèi)毒素符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。因此，樣品HAP/Arg納米顆粒完全可以用于下一步的生物安全性研究。

2.2 HAP/Arg納米顆粒對(duì)細(xì)胞增殖的影響

圖1所示為不同HAP/Arg納米顆粒濃度及作用時(shí)間下的HAEC正常內(nèi)皮細(xì)胞和Hela腫瘤細(xì)胞的吸光度OD值。可以看出，各個(gè)時(shí)間段及濃度細(xì)胞活力均與空白對(duì)照組細(xì)胞在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯差異，說明各劑量組在不同作用時(shí)間下對(duì)所選擇的兩種細(xì)胞的正常生長無明顯影響。本實(shí)驗(yàn)從影響細(xì)胞增殖的角度出發(fā)，采用MTT法體外評(píng)價(jià)精氨酸修飾后的HAP納米顆粒的細(xì)胞毒性。根據(jù)存活細(xì)胞數(shù)量與吸光值呈正比的原理，檢測(cè)了不同HAP/Arg納米顆粒濃度及作用時(shí)間下的HAEC正常內(nèi)皮細(xì)胞和Hela腫瘤細(xì)胞的吸光度OD值。

圖1 HAP/Arg納米顆粒在細(xì)胞中的細(xì)胞活力(a)人宮頸癌表皮細(xì)胞 (Hela); (b)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)Fig.1 Cell viability assay. It showed no effects of varying concentrations and exposure time of HAP/Arg nanoparticles on cell viability (a)Hela cell;(b) HAEC cell.

2.3 HAP/Arg納米顆粒對(duì)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性影響

表2 HAP/Arg納米顆粒對(duì)人腫瘤HeLa細(xì)胞LDH活性濃度(U/L)的影響

表2、3所示為4～72 h的作用時(shí)間內(nèi)，不同濃度的HAP/Arg納米顆粒對(duì)人腫瘤HeLa細(xì)胞和人主動(dòng)脈內(nèi)皮HAECs細(xì)胞內(nèi)的LDH活性(U/L)的影響?？梢钥闯?，在同一時(shí)間內(nèi)，各濃度下的HAP/Arg納米顆粒對(duì)細(xì)胞內(nèi)LDH活性濃度與對(duì)照組的相比無顯著性差異。但是，隨著作用時(shí)間的延長，各濃度組LDH的量均明顯增大，但與對(duì)照組無明顯差異，說明HAP納米顆粒對(duì)細(xì)胞膜的影響不大。正常情況下，LDH存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷時(shí)，LDH漏出到細(xì)胞外，LDH的升高或降低直接影響機(jī)體的正常生命活動(dòng)，故通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的含量，可間接反映細(xì)胞膜完整性的損傷程度。

2.4 HAP/Arg納米顆粒的急性毒性研究

2.4.1 小鼠行為及體重的變化

圖2 所示為各組小白鼠7日內(nèi)體重變化趨勢(shì)?？梢钥闯觯o藥各劑量組昆明種小白鼠的體重及體重增長與對(duì)照組昆明種小白鼠在7 d內(nèi)相比無顯著性差異，P>0.05。在試驗(yàn)周期內(nèi)，尾靜脈注射昆明種小白鼠后，觀察HAP/Arg納米顆粒各劑量組和生理鹽水注射組昆明種小白鼠行為活動(dòng)自如，毛色、大小便以及呼吸無明顯異常變化。昆明種小白鼠的攝食量未發(fā)現(xiàn)明顯的與納米顆粒作用有關(guān)的異常變化。

表3 HAP/Arg納米顆粒對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮HAECs細(xì)胞LDH活性濃度(U/L)的影響

圖2 各組小白鼠7日內(nèi)體重變化趨勢(shì)Fig.2 Body weight of mice

2.4.2 HAP/Arg納米顆粒的毒性反應(yīng)

表4所示為小白鼠尾靜脈注射不同劑量的HAP/Arg納米顆粒懸濁液后的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果。可以看出，實(shí)驗(yàn)各劑量組及生理鹽水對(duì)照組小白鼠均未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)及死亡情況，表明本研究所制備的HAP納米顆粒無急性毒性作用。

表4 HAP/Arg納米顆粒懸濁液注射給藥小白鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 HAP/Arg納米顆粒對(duì)生化指標(biāo)的影響

圖3所示為小白鼠尾靜脈注射不同劑量的HAP/Arg納米顆粒懸濁液后取血所查各生化指標(biāo)的結(jié)果。由圖可知，HAP/Arg納米顆粒高劑量組的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)與生理鹽水對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)，中劑量組和低劑量組的ALT與生理鹽水對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05)。其他劑量組的各血清生化指標(biāo)，如血清生化指標(biāo)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血清總蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)的含量，較生理鹽水組相比變化不大(P>0.05)。

圖3 各組小白鼠的生化指標(biāo)Fig.3 Biochemical assay of serum

2.4.4 HAP/Arg納米顆粒對(duì)昆明種小白鼠各臟器的病理學(xué)觀察結(jié)果

圖4 所示為小鼠各組臟器的病理切片圖。由圖4可知，HAP/Arg納米顆粒各劑量組和對(duì)照組，均未見對(duì)各組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)有炎癥及損傷性變化。

圖4 各組臟器病理切片圖(每行從左到右依次為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組)。(a)心臟； (b)腎臟； (c)肝臟； (d)肺；(e)脾；(f)肌肉Fig.4 Pictures of pathological section for each group of main organs(In each line from left to right: control group, low dose group, middle dose group, high dose group).(a)Heart; (b) Kidney; (c)Liver; (d) Lung; (e) Spleen; ( f)Muscle

2.5 HAP/Arg納米顆粒的動(dòng)物生殖毒性研究

2.5.1 HAP/Arg納米顆粒對(duì)昆明種小白鼠的影響

表5所示為各組小鼠雌雄合籠后的雌鼠受孕率結(jié)果。由表可看出，各劑量組在交配給藥前，交配給藥期間未見有死亡發(fā)生，解剖時(shí)也未見有明顯的異常。各劑量組雄鼠的交配率及交配后致雌鼠懷孕率與對(duì)照組相比均無顯著差異。

表6所示為雄性小鼠睪丸及副睪質(zhì)量的比較?？梢钥闯觯o藥組睪丸和附睪平均質(zhì)量與對(duì)照組相比有差異，但臟器系數(shù)無顯著性的差異(P>0.05)，且3個(gè)HAP/Arg納米顆粒實(shí)驗(yàn)劑量組之間不呈劑量反應(yīng)關(guān)系。

2.5.2 HAP/Arg納米顆粒對(duì)胎仔的影響

表5 小鼠雌雄合籠后的雌鼠受孕率結(jié)果

表6 雄性小鼠睪丸及副睪重量的比較

從0.09、4.5、225 mg/(kg·d)組各隨機(jī)抽查了一窩昆明種小白鼠的胎仔的外形，未見胎仔的形態(tài)異常。胎仔的內(nèi)臟軟組織未見明顯的異常，其窩數(shù)和胎仔數(shù)的發(fā)生率與對(duì)照組相比均無顯著性的差異(P>0.05)。胎仔的骨骼檢查未發(fā)現(xiàn)胎仔胸骨節(jié)第一中心及恥骨未骨化的現(xiàn)象。各劑量組也均無明顯軟骨畸形。

3 討論

目前，理想的基因載體應(yīng)當(dāng)具備以下特點(diǎn)：

1)載體的保護(hù)性；

2)無細(xì)胞毒性和無免疫原性，對(duì)患者安全；

3)穩(wěn)定性好，基因負(fù)載率高，容易制備，并可大規(guī)模生產(chǎn)；

4)能使負(fù)載的治療基因高效穩(wěn)定地進(jìn)行表達(dá)。

HAP納米顆粒作為新型的基因載體材料，在生物相容性、與蛋白和核酸親和性以及表面易修飾性等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。本研究基于HAP納米顆粒的獨(dú)特理化特性和安全性，探討其作為基因治療藥物載體的可行性。該研究為進(jìn)一步研究HAP/Arg納米顆粒的生物安全性及臨床前研究提供依據(jù)，為下一步構(gòu)建一種能高效、安全、簡便的新型納米基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)打下基礎(chǔ)。同時(shí)，為更好地了解HAP納米顆粒潛在的細(xì)胞毒性提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。

采用PEI和PAA對(duì)HAP納米顆粒進(jìn)行表面修飾后，研究發(fā)現(xiàn)改性后的HAP納米顆?？梢燥@著地改變納米HAP顆粒的表面電荷，具有正電荷的材料對(duì)于細(xì)胞的毒性較大。本實(shí)驗(yàn)用水熱合成法制備的鋱離子摻雜的精氨酸修飾的納米羥基磷灰石顆粒(HAP/Arg)，在體外將人正常血管內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)和人腫瘤細(xì)胞株(Hela)與不同濃度的HAP/Arg納米顆粒混合培養(yǎng)后，利用酶標(biāo)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)在490 nm波長處測(cè)定不同時(shí)間的各孔的OD吸光值，即用細(xì)胞存活率推斷HAP/Arg納米顆粒的細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)中人正常血管內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)和人腫瘤細(xì)胞株(Hela)與不同濃度HAP/Arg納米顆粒共同培養(yǎng)后，其活力在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯差異；而隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，兩者的細(xì)胞活力與對(duì)照組相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上也無明顯差異。在同一時(shí)間段，即使培養(yǎng)濃度不同，上述兩種細(xì)胞的組內(nèi)LDH活性濃度相比較無明顯差別；組間相比較，人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)的LDH活性濃度較同時(shí)間段的人腫瘤細(xì)胞株(Hela) 的LDH活性濃度稍高；且隨著時(shí)間的延長，同濃度下的同種細(xì)胞的LDH活性濃度逐漸升高。然而，不同濃度不同時(shí)間作用下的人正常血管內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)和人腫瘤細(xì)胞株(Hela)的LDH活性濃度與空白對(duì)照組相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些結(jié)果證明不同濃度的HAP/Arg納米顆粒在不同時(shí)間作用下對(duì)兩種細(xì)胞的正常生長無明顯影響。

基于上述體外研究結(jié)果，利用健康小鼠作為動(dòng)物模型，分析所制備的HAP/Arg納米顆粒對(duì)動(dòng)物的急性毒性以及生殖毒性影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度HAP/Arg納米顆粒及生理鹽水注射后的小鼠體重雖有波動(dòng)，但體重及其增長程度與對(duì)照組相比無明顯差異。說明短時(shí)間內(nèi)，所制備的HAP納米顆粒對(duì)動(dòng)物的生長無明顯急性毒性作用。分析血清生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)高劑量的HAP/Arg納米顆粒對(duì)小鼠的肝臟有一定程度的損傷，這可能與體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticulo endothelial system, RES) 巨噬細(xì)胞吞噬攝取大量100～200 nm微粒運(yùn)送至肝細(xì)胞內(nèi)有關(guān)[16]。而AST、TP、BUN、CREA等的含量較生理鹽水組相比變化不大，說明不同劑量的HAP/Arg納米顆粒對(duì)腎臟損傷較小。此結(jié)果與Liu等使用不同濃度的HAP納米顆粒溶液靜脈注入白兔體內(nèi)觀察到的毒性反應(yīng)[17]是一致的，即HAP納米顆粒溶液靜脈對(duì)動(dòng)物血液中電解質(zhì)、酶的影響較小，沒有累積毒性，LDH、CPK、GOP、BUN、ALP等有一過性變化而后恢復(fù)正常。

目前，由于納米材料的特殊性質(zhì)，可能對(duì)靶向特定的組織器官產(chǎn)生較嚴(yán)重的毒性。本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物尾靜脈注射方式將HAP/Arg納米顆粒導(dǎo)入機(jī)體，研究其在小鼠體內(nèi)各組織器官的損傷情況，對(duì)于客觀評(píng)價(jià)納米顆粒的生物安全性及毒理學(xué)機(jī)制有重要意義。如果在本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上繼續(xù)探討HAP納米顆粒對(duì)動(dòng)物是否有慢性毒性，或許可以更加完善關(guān)于HAP納米顆粒的毒性研究。今后，也可在更多的樣本量和更加細(xì)致化的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證，以期豐富基因載體及基因治療的相關(guān)研究。

4 結(jié)論

1) 樣品HAP/Arg納米粉末完全可用于生物安全性的檢測(cè)，各劑量組在不同作用時(shí)間下對(duì)所選擇的正常血管內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)和人腫瘤細(xì)胞(Hela)的正常生長無明顯影響。此外，HAP/Arg納米顆粒本身對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的影響也不大。

2) 在試驗(yàn)周期內(nèi)，動(dòng)物的行為活動(dòng)、毛色、大小便以及呼吸以及攝食量未發(fā)現(xiàn)明顯的與HAP/Arg納米顆粒作用有關(guān)的異常變化，給藥各劑量組動(dòng)物的體重及體重增長與對(duì)照組相比無顯著性差異，表明HAP/Arg納米顆粒無急性毒性作用，但是否有慢性毒性作用還有待進(jìn)一步研究。

3) HAP/Arg納米顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血清五項(xiàng)生化指標(biāo)的影響，僅見HAP/Arg納米顆粒高劑量組的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)與生理鹽水對(duì)照組相比有顯著性差異, 這可能與體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)巨噬細(xì)胞吞噬攝取大量適量大小的納米顆粒被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞內(nèi)有關(guān)。其他各劑量組的各血清生化指標(biāo)，如血清生化指標(biāo)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血清總蛋白、尿素氮、肌酐的含量較生理鹽水組相比變化不大，說明HAP/Arg納米顆粒各劑量組對(duì)肝臟和腎臟損傷較小。心臟、脾臟、肺、肝臟、腎臟、肌肉等組織病理切片及倒置熒光顯微鏡均未見對(duì)組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)有炎癥及損傷性變化。

4) HAP/Arg納米顆粒對(duì)動(dòng)物無明顯生殖毒性，各劑量組雄鼠的交配率及交配后致雌鼠懷孕率與對(duì)照組相比均無顯著差異，且胎仔的外形、內(nèi)臟軟組織均未見異常，未發(fā)現(xiàn)胎仔胸骨節(jié)第一中心及恥骨未骨化的現(xiàn)象，也無明顯軟骨畸形。

[1] Besinis A, De Peralta T, Tredwin CJ, et al. Review of nanomaterials in dentistry: interactions with the oral microenvironment, clinical applications, hazards, and benefits[J].ACS Nano,2015, 9(3):2255-2289.

[2] Pavicic T. Calcium hydroxylapatite filler: an overview of safety and tolerability [J]. J Drugs Dermatol, 2013, 12(9):996-1002.

[3] Maynard A, Rejeski D. Too small to overlook [J].Nature, 2009, 460(7252):174-174.

[4] Fan AM, Alexeeff G. Nanotechnology and nanomaterials: toxicology, risk assessment, and regulations [J].J Nanosci Nanotechno, 2010, 10(12):8646-8657.

[5] Forsberg EM. Standardisation in the field of nanotechnology: some issues of legitimacy [J]. Sci Eng Ethics, 2012, 18(4):719-739.

[6] Legeros RZ. Properties of osteoconductive biomaterials:calciumphosphates [J].Clinical Orthopaedics and Related Research,2002,395(395):81-98.

[7] Aoki H, Kutsuno T. An in vivo study on the reaction of hydroxyapatite-sol injected into blood [J]. Journal of Materials Science:Materials in Medicine, 2000, 11(2):67-72.

[8] 湯京龍，奚廷斐. 納米羥基磷灰石生物安全性的研究現(xiàn)狀 [J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2007,11(5):936-943.

[9] 許艷慧，李四群，李志安. 納米羥基磷灰石復(fù)合材料的研究——納米羥基磷灰石的毒性 [J]. 實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2004,20(2):147-150.

[10] 馮凌云，曹獻(xiàn)英，閆玉華，等.HAP納米微晶在血漿中的穩(wěn)定性及對(duì)血細(xì)胞形態(tài)的影響[C]// 納米材料和技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展——全國第二屆納米材料和技術(shù)應(yīng)用會(huì)議論文集:下卷.北京: 中國材料研究學(xué)會(huì)，2001:E5-E8.

[11] 郭曉東，鄭啟新，杜靖遠(yuǎn)，等. 可吸收羥基磷灰石/聚DL-乳酸復(fù)合骨折內(nèi)固定材料的生物相容性研究 [J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 1999,16(2):9902-9903.

[12] 孟純陽，安洪，蔣電明，等. 新型納米骨重建和修復(fù)材料羥基磷灰石/聚酰胺體內(nèi)植入的生物相容性及安全性 [J]. 中國臨床康復(fù), 2004,8(29):6330-6334.

[13] 李激. 納米材料與納米技術(shù)在口腔內(nèi)外科學(xué)中的應(yīng)用概述 [J]. 右江醫(yī)學(xué), 2013,41(1):106-109.

[14] 劉麗萍，肖雁冰，肖子文，等. 家兔靜脈注射羥基磷灰石納米顆粒的反應(yīng)研究 [J]. 衛(wèi)生研究, 2005,34(4):474-476.

[15] 董延生. 藥物安全性評(píng)價(jià)毒性病理平臺(tái)的規(guī)范化建設(shè)與實(shí)踐 [D]. 北京：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 2012.

[16] Rocca JD, Liu Demin, Lin Wenbin. Nanoscale metal-organic frameworks for biomedical imaging and drug delivery [J]. Acc Chem Res, 2011, 44(10):957-968.

[17] 劉軍安，魏曉磊，江洪，等. 新型改性PAMAM樹狀大分子的合成及其轉(zhuǎn)染效率初探 [J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010,29(3):333-334.

Study on Biological Safety of Functionalized Nano-Hydroxyapatite

Zhao Yanzhong1, 2*Yang Min1Wang Guohui1Tan Juan1Zhu Shaihong1, 2

1(MedicalExperimentalCenteroftheThirdXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410013,China)2(ResearchCenterforMedicalMaterialandInstruments,CentralSouthUniversity,Changsha410013,China)

To investigate the feasibility of nano-hydroxyapatite with arginine-functionalized and Tb3+doped HAP/Arg as a gene drug carrier, and to study the biological safety of HAP/Arg. Normal human vascular endothelial cells (HAEC) and human tumor cells (Hela) were selected as cell modelsinvitro, under the exposure of 0, 25, 50 to 200 μg/mL of HAP/Arg nanoparticles, the cell survival rate was measured by the enzyme labeled immunoassay instrument, and the structural integrity of the cell membrane of which was examined by LDH method. Healthy mice were divided into low dose group (10 μg/mL/20 g weight), middle dose group (100 μg/mL/20 g weight), high dose group (500 μg/mL/20 g weight ) and control group, to count number of deaths, to detect serum biochemical indexes and to observe pathologic features of main organs by inverted fluorescence microscope. According to the results of acute toxicity experiment, healthy mice were divided into low dose group (0.09 mg/(kg·d)), middle dose group (4.5 mg/(kg·d)), high dose group (225 mg/(kg·d) ) and control group, according to the preclinical safety evaluation standard to judge its reproductive toxicity. The results showed that HAP/Arg with concentration of 0, 25, 50 and 200 μg/mL did not affect normal growth and cell membrane structure under 4, 24, 48 and 72 h of HAEC cells and Hela cells. In experiments on animal acute toxicity and general reproductive toxicity, there were no obvious toxic reaction and death in the mice of each dose group and control group, the inflammation and injury were not found in the main organs. Statistical analysis shows that each dosage groups of HAP/Arg has no significant difference compared with control group (P>0.05). Above results are expected to be useful for developing a novel efficient, safe and convenient gene delivery system for the next research step.

hydroxyapatite; gene delivery system; arginine-functionalized; biological safety

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 05.008

2015-12-25， 錄用日期:2016-06-30

湖南省科技計(jì)劃(支撐計(jì)劃)重點(diǎn)項(xiàng)目(2013SK2024); 教育部博士學(xué)科點(diǎn)基金

R318

A

0258-8021(2016) 05-0562-08

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: yanzhongzhao@163.com