調(diào)味料和保鮮劑協(xié)同對(duì)淡水魚(yú)特征性腐敗菌的抑制作用

劉小莉 賈洋洋 夏秀東 劉源 周劍忠

摘要：以分離自腐敗淡水魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌作為抑菌試驗(yàn)指示菌，在體外抑菌試驗(yàn)基礎(chǔ)上篩選抑菌效果優(yōu)良的保鮮劑和調(diào)味料配方，進(jìn)一步以菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量為指標(biāo)評(píng)估魚(yú)塊保鮮效果。結(jié)果顯示，以pH值為4的醋酸溶液配制0.05%尼泊金丁酯，對(duì)所有受試腐敗菌均有很好的抑菌效果；5%大蒜汁和黃酒也具有一定抑菌作用。以黃酒為基料制備0.05%尼泊金丁酯和5%大蒜汁，并用醋酸將pH值調(diào)節(jié)為4，浸漬后的白魚(yú)魚(yú)塊具有明顯保鮮效果，置于25 ℃加速腐敗條件下36 h后，菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量分別為5.40 lg CFU/g、34.97 mg/100 g，未經(jīng)保鮮處理的對(duì)照高達(dá)7.99 lg CFU/g、76.61 mg/100 g。

關(guān)鍵詞：保鮮劑；調(diào)味料；淡水魚(yú)；微生物腐??；揮發(fā)性鹽基氮

中圖分類號(hào)： TS254.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0389-03

我國(guó)淡水資源豐富，是淡水魚(yú)的生產(chǎn)與消費(fèi)大國(guó)，然而淡水魚(yú)防腐保鮮體系相對(duì)滯后，成為限制淡水魚(yú)行業(yè)發(fā)展的桎梏。冷藏是水產(chǎn)品保鮮的重要手段，但存在于水產(chǎn)品表面的嗜冷微生物依然能夠大量生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致其腐敗，并表現(xiàn)為自溶、表面發(fā)黏、顏色變化、產(chǎn)生異味等現(xiàn)象[1]。

淡水魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)成分不同于其他食品，其碳水化合物含量非常少，而蛋白質(zhì)、游離氨基酸含量非常豐富，同時(shí)含有大量三甲胺氧化物（TMAO），這些特性決定了導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的特征性腐敗微生物[specific spoilage organism（s），SSO]不同于其他食品[2-3]。只有能夠利用蛋白質(zhì)、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分的腐敗細(xì)菌才能在此類食品中大量生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致該類食品腐敗變質(zhì)。近年來(lái)，很多學(xué)者對(duì)水產(chǎn)品的腐敗微生物生態(tài)進(jìn)行了分析，認(rèn)為熒光假單胞菌、單核增生李斯特菌、腐敗希瓦菌（Shewanella putrefaciens）、發(fā)光細(xì)菌（Photobacterium）等是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗最重要的腐敗細(xì)菌，這些腐敗細(xì)菌在冷藏階段很快成為優(yōu)勢(shì)微生物，并導(dǎo)致水產(chǎn)品的腐敗[4-5]。

如果不采取適當(dāng)?shù)姆栏ｕr措施，捕撈后的水產(chǎn)品極易腐敗變質(zhì)，嚴(yán)重影響水產(chǎn)品的市場(chǎng)流通和銷售。找到導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的微生物種類，才能有效進(jìn)行水產(chǎn)品腐敗的靶向抑制，這是研發(fā)水產(chǎn)品加工保藏技術(shù)、提高水產(chǎn)品質(zhì)量的前提。本研究選用食品加工中常用的保鮮劑及調(diào)味料，考察保鮮劑和調(diào)味料組合對(duì)自主分離得到的特征性腐敗菌生長(zhǎng)的抑制作用，篩選抑菌效果顯著的保鮮混合液配方，為延長(zhǎng)淡水魚(yú)產(chǎn)品貨架期、提高產(chǎn)品價(jià)值提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

購(gòu)買市售白魚(yú)、鯽魚(yú)、青魚(yú)，于室溫下放置至腐敗，分離其中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌作為抑菌試驗(yàn)指示菌。經(jīng)生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析鑒定，優(yōu)勢(shì)腐敗菌為漫游球菌Vagococcus sp.BY-1、變形桿菌Proteus sp.BY-2、摩根氏菌Morganella sp.JY-1、泰瑞芽孢桿菌Terribacillus sp.QY-1、賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillus sp.BY-3、糞透明顫菌Vitreoscilla sp.QY-1，分別編號(hào)為腐敗菌1～6，于-20 ℃下20%甘油管中保存于筆者所在研究室。

Nisin、山梨酸鉀、雙乙酸鈉、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、乳酸、醋酸均購(gòu)自鄭州思源食品添加劑有限公司。白醋、姜醋、香醋、大蒜、生姜、黃酒、白酒等調(diào)味料購(gòu)自超市。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基配制和菌種活化

肉湯培養(yǎng)基配方為牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂12 g、水1 000 mL，pH值為7.0～7.2，于121 ℃高壓滅菌15 min，保存?zhèn)溆?。液體活化采用不添加瓊脂的液體肉湯培養(yǎng)液。

菌株保藏的甘油管于室溫下融化，吸取100 μL保存菌種，接種于5 mL液體肉湯培養(yǎng)基，于30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.2抑菌劑配制

保鮮劑的配制參照國(guó)家食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014及相關(guān)文獻(xiàn)。稱取一定質(zhì)量商品化防腐劑，以無(wú)菌去離子水分別配制成終濃度0.05% Nisin、0.1% 山梨酸鉀、0.2% 雙乙酸鈉、0.05% 尼泊金乙酯、0.05% 尼泊金丙酯、0.05% 尼泊金丁酯，并分別采用乳酸、醋酸將pH值調(diào)節(jié)至4。分別以不添加防腐劑的乳酸、醋酸溶液作為對(duì)照，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

調(diào)味料的制備。選用市售白醋、姜醋、香醋，以無(wú)菌去離子水將pH值分別稀釋至3、4、5，于4 ℃保存?zhèn)溆?。分別稱取去皮大蒜、生姜，添加4倍體積的無(wú)菌去離子水，于高速勻漿機(jī)中打成勻漿，過(guò)100目篩，得到5%大蒜汁和5%姜汁，于 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩＿x用市售黃酒和白酒，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3體外抑菌試驗(yàn)

采用改良的平板孔阱擴(kuò)散法[6]研究各種保鮮劑的抗菌活性。采用冷卻的肉湯培養(yǎng)基將活化好的抗菌試驗(yàn)指示菌種稀釋至106 CFU/mL以上，倒平板。待培養(yǎng)基冷凝后，采用直徑為7 mm的打孔器于平板上均勻打3個(gè)孔，吸取10 μL融化的培養(yǎng)基封底，以防止培養(yǎng)基與平皿底間出現(xiàn)裂隙。分別吸取100 μL處理好的保鮮劑注入孔中，于30 ℃下培養(yǎng)48 h后測(cè)量抑菌圈大小，計(jì)算平均值。

1.2.4魚(yú)塊保鮮試驗(yàn)

選用市售鮮活白魚(yú)，經(jīng)冰水預(yù)冷后去除鱗、內(nèi)臟、頭、尾、皮，瀝干魚(yú)體，剔除脊骨，將魚(yú)肉分割為約3 cm×3 cm的小塊，混勻后隨機(jī)分組。將魚(yú)塊浸沒(méi)于保鮮劑中，30 min后取出瀝干，置于無(wú)菌的包裝袋內(nèi)密封保存。未經(jīng)保鮮劑處理的魚(yú)塊作為陰性對(duì)照。魚(yú)塊于25 ℃下保藏，定期取樣，稱取魚(yú)塊10 g，添加90 mL去離子水勻漿2 min，以快速定性濾紙過(guò)濾，測(cè)定濾液的pH值。分別參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB 4789.2—2010、GB/T 5009.44—2003測(cè)定魚(yú)塊樣品的菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮TVB-N含量。

2結(jié)果與分析

2.1保鮮劑對(duì)腐敗菌的抑制效果

目前，商品化的保鮮劑大多在酸性條件下具有最強(qiáng)的抑菌效果[7-8]，本研究分別采用醋酸和乳酸調(diào)節(jié)保鮮劑溶液的pH值。以乳酸、醋酸調(diào)節(jié)pH值的保鮮劑溶液對(duì)6種淡水魚(yú)腐敗菌的抑制效果見(jiàn)表1、表2。結(jié)果顯示，pH值為4且不含保鮮劑的乳酸或醋酸對(duì)照溶液均沒(méi)有抑菌效果；醋酸溶液溶解的保鮮劑的抑菌效果明顯優(yōu)于乳酸溶液溶解的防腐劑；以乳酸調(diào)節(jié)pH值的6種保鮮劑中，只有0.05% Nisin、0.2%雙乙酸鈉、0.05%尼泊金丙酯對(duì)賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sp.BY-3）（腐敗菌5）具有抑制作用，其他保鮮劑對(duì)各種腐敗菌均沒(méi)有抑制效果。相同的保鮮劑及濃度，以醋酸調(diào)節(jié)pH值則抑菌效果顯著增強(qiáng)，0.2%雙乙酸鈉、0.05%尼泊金丁酯對(duì)6種受試腐敗菌的生長(zhǎng)均具有明顯抑制作用，且尼泊金丁酯的抑菌效果顯著高于其他保鮮劑。在乳酸和醋酸2種不同的pH值環(huán)境中，0.05%尼泊金乙酯對(duì)所有腐敗菌均沒(méi)有抑制作用。表1中，保鮮劑0為pH值為4的乳酸溶液，保鮮劑1～6分別為以pH值為4的乳酸溶液溶解的0.05% Nisin、01%山梨酸鉀、0.2%雙乙酸鈉、0.05%尼泊金乙酯、0.05%尼泊金丙酯、0.05%尼泊金丁酯。表2中，保鮮劑0為pH值為4的醋酸溶液，保鮮劑1～6分別為以pH值為4的醋酸溶液溶解的0.05% Nisin、0.1%山梨酸鉀、0.2%雙乙酸鈉、005%尼泊金乙酯、0.05%尼泊金丙酯、0.05%尼泊金丁酯。

2.2調(diào)味料對(duì)腐敗菌的抑制作用

多項(xiàng)研究表明傳統(tǒng)調(diào)味料具有防腐抑菌作用[9]，本研究選用淡水魚(yú)加工中常用的醋、大蒜、生姜、黃酒、白酒等調(diào)味料，以適口感為參考依據(jù)選擇合適的濃度及用量，考察其抑菌特性。結(jié)果表明，各種市售白醋、姜醋、香醋以無(wú)菌去離子水稀釋至pH值為4以上時(shí)，對(duì)6種受試腐敗菌的生長(zhǎng)均沒(méi)有抑制作用。其他調(diào)味料的抑菌活性見(jiàn)表3，其中5%大蒜汁的抑菌活性最顯著，對(duì)變形桿菌（Proteus sp.BY-2）、摩根氏菌（Morganella sp.JY-1）、泰瑞芽孢桿菌（Terribacillus sp.QY-1）、糞透明顫菌（Vitreoscilla sp.QY-1）均具有抑制作用；其次為黃酒，對(duì)漫游球菌（Vagococcus sp.BY-1）、賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sp.BY-3）、糞透明顫菌（Vitreoscilla sp.QY-1）均具有抑制效果，且對(duì)賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sp.BY-3）抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)（19.02±1.76） mm；5%姜汁對(duì)受試的6種腐敗菌均無(wú)抑制作用；白酒僅對(duì)賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sp.BY-3）具有一定抑制作用。

2.3魚(yú)塊的防腐

根據(jù)以上結(jié)果將防腐浸制液的配方確定為：稱取適量大蒜，加入4倍體積的黃酒，打漿后過(guò)濾，向?yàn)V汁中添加尼泊金丁酯使其終濃度為0.05%，使用醋酸將混合液的pH值調(diào)節(jié)至4。魚(yú)塊在此混合保鮮液中浸漬后保藏，對(duì)照和保鮮劑處理的魚(yú)塊在儲(chǔ)藏期內(nèi)的菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮含量變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1、圖2。與未經(jīng)處理的對(duì)照相比，保鮮劑浸漬處理的魚(yú)塊在儲(chǔ)藏期內(nèi)菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮含量的增長(zhǎng)速度顯著緩慢。36 h后對(duì)照魚(yú)塊的菌落總數(shù)達(dá)7.99 lg CFU/g （98×107 CFU/g），保鮮處理的魚(yú)塊則為5.40 lg CFU/g，且 24 h 后增長(zhǎng)速率減緩。對(duì)照和經(jīng)保鮮處理魚(yú)塊的揮發(fā)性鹽基氮含量增加趨勢(shì)類似，36 h后對(duì)照組樣品的揮發(fā)性鹽基氮含量高達(dá)76.61 mg/100 g，具有明顯的腐臭味；經(jīng)保鮮處理的樣品中揮發(fā)性鹽基氮含量?jī)H為34.97 mg/100 g，約為對(duì)照組含量的一半?？梢?jiàn)，保鮮防腐處理對(duì)魚(yú)塊腐敗菌的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用。

3結(jié)論與討論

水產(chǎn)品貯藏保鮮技術(shù)的開(kāi)發(fā)是養(yǎng)殖、捕撈生產(chǎn)活動(dòng)的延續(xù)，是加工企業(yè)創(chuàng)收的必要保證。與傳統(tǒng)水產(chǎn)品保鮮技術(shù)和現(xiàn)代高新保鮮技術(shù)相比，食品保鮮劑的應(yīng)用更加簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)，高效地達(dá)到水產(chǎn)品保鮮的要求，突破傳統(tǒng)繁瑣的保鮮措施和昂貴的現(xiàn)代設(shè)備投資瓶頸，是水產(chǎn)品及其他食品貯藏保鮮的重要發(fā)展方向。

本研究結(jié)果顯示，不同保鮮劑或不同溶液體系中的相同保鮮劑對(duì)淡水魚(yú)特征性腐敗菌的抑制作用具有很大差異。食品保鮮劑品種多樣。Nisin是一種高效、無(wú)毒、安全、營(yíng)養(yǎng)的天然食品保鮮劑，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有廣譜抑制作用，對(duì)可形成芽孢的細(xì)菌具有更強(qiáng)的抗菌效果[7]。祝銀等對(duì)凍藏金槍魚(yú)肌肉的硬度、彈性、凝聚性等進(jìn)行測(cè)試發(fā)現(xiàn)，Nisin保鮮液可適當(dāng)延長(zhǎng)凍藏金槍魚(yú)的保鮮期，其最適質(zhì)量濃度為0.4 g/L[10]。然而本研究結(jié)果顯示，Nisin僅對(duì)賴氨酸芽孢桿菌具有抑制作用，對(duì)其他受試的腐敗菌均無(wú)抑制作用。

苯甲酸、山梨酸及其鹽類等化學(xué)防腐劑是國(guó)內(nèi)常用的食品防腐劑，其成本低于天然防腐劑，但其防腐效果受微生物種類、食品成分、pH值、溶解性等因素影響，具有一定使用局限性，一般僅能在酸性條件下使用。尼泊金酯是一類廣譜、高效、低毒的防腐劑，且不易受食品pH值的影響，在pH值為 4～8 的范圍內(nèi)均具有很好的抑菌能力[11]。本研究結(jié)果表明，尼泊金丁酯對(duì)所有受試腐敗菌的生長(zhǎng)均具有抑制作用，其抑菌譜最廣且抑菌活性高。鄒玉萍等研究各種單酯在蒸煮袋熟魚(yú)的保藏效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，丁酯的防腐能力高于丙酯和乙酯[12]。

單一的防腐劑通常存在一定缺陷，須采用復(fù)合防腐技術(shù)才能發(fā)揮互補(bǔ)和相乘效果，有效阻止微生物的生長(zhǎng)和其他不利因素，達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)、相得益彰的目的。保鮮劑與傳統(tǒng)水產(chǎn)加工調(diào)味料的復(fù)合使用對(duì)腐敗菌具有很好的抑制作用，與微生物酶系統(tǒng)中的巰基結(jié)合，從而破壞很多酶系統(tǒng)，達(dá)到抑制微生物生長(zhǎng)、繁殖及防腐的效果，進(jìn)而有效抑制TVBN的增長(zhǎng)，延緩魚(yú)肉的腐敗變質(zhì)[13]。

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