哈薩克羊BMP15基因多態(tài)性研究

陳春華，劉宜勇，丁克奇，劉建明，楊光維*，吐來(lái)力江，團(tuán) 勇，道爾基

（1.新疆伊犁州畜牧科學(xué)研究所，新疆 伊寧 835000；2.新疆尼勒克縣畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 尼勒克 835700）

哈薩克羊BMP15基因多態(tài)性研究

陳春華1，劉宜勇1，丁克奇2，劉建明1，楊光維1*，吐來(lái)力江1，團(tuán) 勇1，道爾基1

（1.新疆伊犁州畜牧科學(xué)研究所，新疆 伊寧 835000；2.新疆尼勒克縣畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 尼勒克 835700）

為了探索綿羊多胎性的分子機(jī)理以及為綿羊繁殖力的標(biāo)記輔助選擇和育種提供理論依據(jù)，采用PCR-RFLP及PCR-DS方法，對(duì)哈薩克羊群體BMP15基因FecXG和FecXB及第2外顯子進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。結(jié)果表明：BMP15基因FecXG和FecXB位點(diǎn)均未出現(xiàn)多態(tài)性，在第2外顯子存在2種基因型，AA型和AB型；測(cè)序結(jié)果表明：AB型個(gè)體在該基因第775位點(diǎn)發(fā)生G→C的突變，出現(xiàn)G/C的雜合。優(yōu)勢(shì)基因型為AA型，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳基因，多態(tài)信息含量小于0.25，屬于低度多態(tài)；χ2適合性檢驗(yàn)表明：處于Hardy-weinberg平衡狀態(tài)；顯著性檢驗(yàn)分析表明：該突變位點(diǎn)在不同產(chǎn)羔數(shù)母羊群體中的分布有一定的差異。該突變位點(diǎn)可以作為控制綿羊多胎產(chǎn)羔的潛在分子標(biāo)記位點(diǎn)。

哈薩克羊；BMP15基因；PCR-RFLP；PCR-DS；多態(tài)性

綿羊的繁殖性能是一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)性狀，在群體內(nèi)表現(xiàn)連續(xù)變異，是由一系列主基因或數(shù)量性狀基因座（Quantitative Trait Locus，QTL）決定的[1]，且遺傳力只有0.1左右，很難用常規(guī)的技術(shù)來(lái)提高。目前，國(guó)內(nèi)外提高綿羊繁殖性能最常見(jiàn)的方法是利用基因工程等技術(shù)進(jìn)行分子育種，從根本上改變其繁殖性能。而找到與繁殖性能相關(guān)的分子標(biāo)記位點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)的基礎(chǔ)。

綿羊的骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白15基因（Bone Morphogenetic Protein 15 BMP15）是TGFβ超家族最大亞家族BMP家族中的一員，也稱為生長(zhǎng)分化因子9B（growth differentiation factor 9B GDF9B），位于綿羊X染色體上，是一種在卵巢表達(dá)的卵母細(xì)胞衍生因子。BMP15可以通過(guò)和卵泡抑素的結(jié)合調(diào)節(jié)自身的生物活性，對(duì)早期卵泡的生長(zhǎng)和分化起到重要調(diào)節(jié)作用。

目前在綿羊中發(fā)現(xiàn)了BMP15基因6個(gè)與繁殖力相關(guān)的突變。即FecXI、FecXB、FecXL、FecXH、FecXG和FecXR。其中任何一個(gè)突變雜合的所有母羊都表現(xiàn)有較高的排卵數(shù)，突變純合個(gè)體由于卵巢沒(méi)有初級(jí)卵泡而導(dǎo)致完全不育。Galloway等[2]（2000）發(fā)現(xiàn)了Inverdale綿羊BMP15基因的FecXI突變和Hanna綿羊BMP15基因的FecXH突變；Hanrahan等[3]（2004）在Belclare綿羊和Cambridge綿羊BMP15基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了FecXG突變，在Belclare綿羊BMP15基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了FecXB突變；Bodin等[4]（2007）發(fā)現(xiàn)了Lacaune綿羊BMP15基因的FecXL突變；Monteagudo等[5]（2008）和Martinez-Royo等[6]（2008）幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)了BMP15基因與繁殖力相關(guān)的第6個(gè)突變，即西班牙Rasa Aragonesa綿羊BMP15基因第二外顯子第525～541位缺失17個(gè)核苷酸，根據(jù)BMP15基因突變的命名規(guī)則，該突變命名為FecXR。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)小尾寒羊和湖羊展開(kāi)了BMP15基因的研究，發(fā)現(xiàn)高繁殖力的小尾寒羊發(fā)生了BMP15基因的FecXG突變，推測(cè)小尾寒羊的多胎性可能與該突變有關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)以哈薩克羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Polymerase Chain Reaction-Restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）及直接測(cè)序法（PCR-DS）方法對(duì)BMP15基因進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)與分析，查找哈薩克羊在該基因酶切位點(diǎn)中的多態(tài)性，并對(duì)具有多態(tài)性的DNA片段進(jìn)行測(cè)序分析，以期在該基因中找到與哈薩克羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，為開(kāi)展標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)羊是在尼勒克縣、特克斯縣、昭蘇縣提供的2 000多只羊群體中選擇抽取719只，其中411只產(chǎn)雙羔羊，308只產(chǎn)單羔羊。頸靜脈采血，ACD抗凝，供提取綿羊基因組DNA。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 參照《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》[7]以及常規(guī)酚-氯仿抽提法提取血液基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 參照GeneBank中綿羊BMP15基因（登錄號(hào)：NM_001114767）利用Olig 6.0和Primer 5.0設(shè)計(jì)引物如下表。

表1 檢測(cè)哈薩克羊多胎候選基因的引物

PCR擴(kuò)增體系為25 μL，包括：10×PCR緩沖液2.5 μL；10 pmol/L引物0.5 μL；dNTPs2.0 μL；2.5 U/μL TaqDNA聚合酶0.25 μL；100 ng/μL的DNA模板1.0 μL，其余用水補(bǔ)齊至25 μL。

1.2.3 PCR擴(kuò)增條件為 94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；62～55℃退火30 s；72℃延伸30 s；35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min；4℃保存，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 PFLP分析 5 μLPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；1.5 μL 10× Buffer；0.5 μL限制性內(nèi)切酶；3 μL水。

反應(yīng)條件：37℃水?。? h左右；3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，并在凝膠成像儀上成像觀察結(jié)果，并保存圖像。

1.2.5 產(chǎn)物回收與測(cè)序 根據(jù)RFLP分析結(jié)果，挑選出不同帶型的PCR產(chǎn)物各2個(gè)，用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，并將回收后的產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

利用Chromas2、MEGA 5.05軟件進(jìn)行測(cè)序結(jié)果分析；使用Popgene Version 32生物軟件計(jì)算等位基因頻率、基因型頻率、群體雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne），并檢驗(yàn)是否處于Hardy-weinberg平衡；采用PIC軟件計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC）值；利用SAS 8.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.1.1 BMP15基因FecXG位點(diǎn)PCR擴(kuò)增結(jié)果 用FecXG位點(diǎn)的引物對(duì)哈薩克羊基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物片段與目的片段大小一致（141 bp）（圖1），結(jié)果表明：特異性良好，可直接用于RFLP分析。

圖1 FecXG基因的PCR產(chǎn)物

2.1.2 BMP15基因FecXB位點(diǎn)PCR擴(kuò)增結(jié)果 用FecXB引物對(duì)哈薩克羊基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物片段與目的片段大小一致（153 bp）（圖2），結(jié)果表明：特異性良好，可直接用于RFLP分析。

圖2 FecXB基因的PCR產(chǎn)物

2.2 PCR-RFLP結(jié)果

2.2.1 BMP15基因FecXG位點(diǎn)PCR-RFLP結(jié)果 用Hinf I內(nèi)切酶對(duì)BMP15基因FecXG位點(diǎn)所擴(kuò)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，用3%瓊脂糖電泳對(duì)酶消化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，得到111 bp條帶，顯示PCR產(chǎn)物沒(méi)有被酶切開(kāi)（圖3）。

圖3 FecXG基因的PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

2.2.2 BMP15基因FecXB位點(diǎn)PCR-RFLP結(jié)果 用Dde I內(nèi)切酶對(duì)BMP15基因FecXB位點(diǎn)所擴(kuò)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，用3%瓊脂糖電泳對(duì)酶消化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果只有122 bp的酶切條帶，說(shuō)明該位點(diǎn)在哈薩克羊中不存在多態(tài)性（圖4）。

圖4 FecXB基因的PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

2.3 測(cè)序結(jié)果

對(duì)第二外顯子的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)：野生型AA型和突變型AB型相比，在AB型個(gè)體中，BMP15基因第775位點(diǎn)有一個(gè)G和A的雜合（圖5）。

圖5 綿羊BMP15基因AA型和AB型測(cè)序結(jié)果比較

2.4 BMP15基因第2外顯子的群體遺傳學(xué)分析

通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)羔數(shù)的719只哈薩克羊樣本直接測(cè)序檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)（表1），優(yōu)勢(shì)基因型均為AA型，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳基因。群體雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）是評(píng)價(jià)群體內(nèi)遺傳多樣性的指標(biāo)。哈薩克羊?qū)儆诘投榷鄳B(tài)（PIC<0.25）（表2）。χ2適合性檢驗(yàn)表明處于Hardyweinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。

表2 755bp處基因型頻率和基因型頻率

對(duì)哈薩克羊群體BMP15基因第755位點(diǎn)的純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)以及多態(tài)信息含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表3計(jì)算結(jié)果表明，在哈薩克羊群體中PIC屬于低度多態(tài)。

表3 BMP15基因多態(tài)位點(diǎn)多態(tài)性參數(shù)分析

2.5 不同基因型在哈薩克羊群體中分布的差異顯著性檢驗(yàn)

群體AA，AB兩種基因型與產(chǎn)羔數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果，表明攜帶基因型AA與AB群體之間產(chǎn)羔數(shù)差異顯著（P<0.05）。產(chǎn)羔數(shù)平均值表現(xiàn)為：AB>AA（表4）。

3 討論

3.1 基因的遺傳特性

在對(duì)719個(gè)哈薩克羊樣本進(jìn)行檢測(cè)分析時(shí)，BMP15基因發(fā)現(xiàn)AA、AB基因，優(yōu)勢(shì)基因型為AA型，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳基因，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)BB基因型的個(gè)體，這可能是被檢測(cè)的品種中BB基因型突變頻率太低或者BB基因?yàn)橹滤阑驈亩沟脗€(gè)體不能存活[8]。遺傳多態(tài)分析表明，多態(tài)信息含量小于0.25，屬于低度多態(tài)；χ2適合性檢驗(yàn)表明：處于Hardy-weinberg平衡狀態(tài)，說(shuō)明該地區(qū)自然選擇或者人工選擇對(duì)該基因分布的影響較小，在遺傳漂變、遷徙和人工選育等因素下保持動(dòng)態(tài)平衡。

表4 BMP15不同基因型產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

3.2 基因多態(tài)性與生產(chǎn)性狀的關(guān)系

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于綿羊BMP15基因多態(tài)性的研究報(bào)道比較多，且主要集中在對(duì)高繁殖力綿羊品種小尾寒羊、湖羊等品種的研究，而對(duì)于低繁殖力的哈薩克羊突變位點(diǎn)多態(tài)性的研究報(bào)道比較少。本實(shí)驗(yàn)利用PCR-RFLP、PCR-DS方法，對(duì)哈薩克羊群體BMP15基因進(jìn)行了多態(tài)性檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：哈薩克羊群體中BMP15基因FecXG和FecXB位點(diǎn)均未出現(xiàn)多態(tài)性，這與Galloway等[2]發(fā)現(xiàn)了Inverdale綿羊BMP15基因的FecXG突變和Hanna綿羊BMP15基因的FecXB突變結(jié)果有差異，可能是由于不同綿羊品種的產(chǎn)羔數(shù)差異導(dǎo)致的這個(gè)差異的原因。測(cè)序結(jié)果表明：AB型個(gè)體在該基因第二外顯子第755位點(diǎn)發(fā)生G→A的突變，出現(xiàn)G/A的雜合。本研究中發(fā)現(xiàn)的突變?yōu)橥x突變，沒(méi)有引起相應(yīng)氨基酸序列的變化，但由于堿基序列發(fā)生了變化，因此會(huì)影響基因的翻譯速度，從而影響該基因的表達(dá)質(zhì)量，甚至?xí)?dǎo)致蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)的變化，從而影響其功能的發(fā)揮[9]。因此推斷，BMP15基因第755位點(diǎn)的突變可以作為控制哈薩克羊多胎產(chǎn)羔的潛在遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，需要進(jìn)一步進(jìn)行深入的研究。

4 結(jié)論

4.1 BMP15基因FecXG、和FecXB位點(diǎn)的多態(tài)性

通過(guò)PCR-RFLP檢測(cè)BMP15基因的FecXG、和FecXB位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)位點(diǎn)在哈薩克羊群體中不存在多態(tài)性，表明BMP15基因的FecXG、和FecXB位點(diǎn)的多態(tài)性與哈薩克羊產(chǎn)羔數(shù)沒(méi)有相關(guān)性。

4.2 BMP15基因第二外顯子第775突變位點(diǎn)的多態(tài)性

運(yùn)用PCR-DS方法對(duì)719個(gè)哈薩克羊樣本的BMP15基因第2外顯子進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，在第755位點(diǎn)均有G和A的雜合出現(xiàn)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變純合體。在BMP15基因的相關(guān)分析中，不同基因型AA和AB群體的產(chǎn)羔數(shù)之間差異顯著。

參考文獻(xiàn)

[1]田秀娥，孫紅霞，王永軍.3個(gè)綿羊群體BMPR-IB基因的遺傳多態(tài)性及其對(duì)產(chǎn)羔數(shù)的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009,11（37）：31-36.

[2]Galloway S M，McNatty K P，Cambridge L M，et al.Mutations in anoocyte-derived growth factor gene（MBP15）are associated with both increased rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep[J].Biology of Reproduction，2004，70（4）：900-909.

[3]Hanrahan J P，Gregan S M，Mulsant P，et al.Muantions in the genes for oocyte-derived groeth factors GDF9 and BMPR15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belcalaer sheep ，Biol Reprod.2004，70：900-909.

[4]Bodin L，Di Pasquale E，F(xiàn)abre S，et al.A novel mutation in the BMPR15 gene causing defective protion secretion is Lacaune sheep[J].En-docrinology，2007，148（1）：393-400.

[5]Monteagudo L V，Ponz R，Tejedor M T.A 17 bp deletion in the bone morphogenetic protein 15（BMPR15）gene is associated to increased prolif cacy in the Rasa Aragonesa sheep breed[J].Animal Reproduction Science，2009，110：139-146.

[6]Martinez-Royo A，Jurado J J，Smulders J P.A deletion in the bone morphogenetic protein 15 gene cause sterility and increased prolicacy in Rasa Aragonesa sheep[J].Animal Genetics，2008，39（3）：294-297.

[7]趙有璋.羊生產(chǎn)學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[8]Davis G H.fecunity genes in sheep[J].Animal Reproduction Science，2004：82-83.

[9]Kimchi-Sarfaty C，Oh J M，Kim I W，et al.A“Silent”polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specif city[J].Animal Science，2007，315（5811）：525-528.

（編輯：張淑鳳）

S813.3

B

1006-799X(2016)24-0103-04

哈薩克羊多胎（多羔）基因檢測(cè)項(xiàng)目（YZ201502018）。

陳春華（1987-），女，新疆昭蘇縣人，畜牧師，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖。

楊光維（1981-），男，湖北咸豐人，高級(jí)畜牧師，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖。